Propiono rūgštis, kurią gamina Cutibacterium Acnes fermentacija, pagerina melanino sintezę

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Hsin-Jou Kao1, Yan-HanWang2, Sunita Keshari3, John JacksonYang3, Shinta Simbolon1, Chun-Chuan Chen1 ir Chun-Ming Huang1*

Ultravioletinis švitinimas skatina melanino kaupimąsi, kurį galima sumažinti naudojant cheminius balinimo produktus. Tačiau susirūpinimas dėl tokių gaminių saugos paskatino ieškoti natūralių ir nekenksmingų alternatyvų. Šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti natūralią rūgštinę formulę, mažinančią odos pigmentaciją. Metabolitas propiono rūgštis (CH3CH2COOH, PA) buvo gausiausia riebalų rūgštis Pluronic F68 (PF68) Cutibacterium acnes (C. acnes) fermentacijos filtrate ir sumažino DOPA teigiamų melanocitų skaičių, žymiai slopindama ląstelių tirozinazės aktyvumą, prisijungdama prie laisvųjų riebalų rūgščių receptorius 2 (FFAR2). Be to, gydymas 4 mM PA nepakeitė melanocitų proliferacijos, o tai rodo, kad tai yra veiksmingas hiperpigmentacijos sprendimas, nesukeliantis ląstelių pažeidimo. Sumažėjęs DOPA teigiamų melanocitų ir tirozinazės aktyvumas taip pat buvo pastebėtas pelių ausų odos audiniuose, kuriems buvo sušvirkštas C. acnes ir PF68 mišinys, ir tai patvirtina, kad melanogenezės slopinimą greičiausiai lemia fermentacijos metabolitai iš C. acnesfermentacijos naudojant PF68. anglies šaltinis. Be to, PA neturėjo įtakos savo pirminių bakterijų C. acnes augimui, taigi yra stiprus fermentacijos metabolitas, kuris nepažeidžia odos mikrobiomo pusiausvyros.

Oda veikia kaip sąsaja tarp žmogaus kūno ir išorinės aplinkos, apsauganti nuo patogenų, fizinės ir ultravioletinės žalos1. Jei žmogaus oda yra per daug veikiama ultravioletinės spinduliuotės (UVR), kuri turi įtakos daugelio ląstelių tipų funkcijoms ir išlikimui, sukelia odos uždegimą, kuris gali sukelti vėžį2,3. UV sukeltas DNR pažeidimas suaktyvina ląstelių atstatymo signalus, kad melanocituose gamintų melaniną, todėl atsiranda odos pigmentacija4,5. Sveiko žmogaus odos paviršių kolonizuoja įvairi mikroorganizmų aplinka, kurių daugelis yra nekenksmingi kaip komensalai ar oportunistiniai patogenai6,7. Probiotikai yra įprasti bakterioterapijos pavyzdžiai, galintys apsaugoti nuo foto, sulėtindami odos senėjimo požymius ir sušvelnindami UV spindulių sukelto odos uždegimo poveikį3,8,9. Pavyzdžiui, probiotinės pieno rūgšties bakterijos ypač apsaugo nuo UV spindulių sukeliamų uždegiminių, alerginių reakcijų ir imunosupresijos odoje10. Be to, Cutibacterium acnes (C. acnes), vyraujančios odos mikrobiome bakterijos, gebėjimas gaminti porfiriną, reaguojant į UVR, yra pagrindinis biologinis žymeklis dėl savo vaidmens saugant ir užkertant kelią pusiausvyros sutrikimui2, 11, 12. praktinio intereso13. Tyrimai atskleidė, kad fermento filtratas (GFF) sumažino melanino kiekį žmogaus melanomos ląstelėse, taip sumažindamas odos pigmentaciją14. Laisvosios riebalų rūgštys (FFA) turi puikų reguliuojantį poveikį melanogenezei ir slopina tirozinazės aktyvumą kultivuojamose B16F10 pelių melanomos ląstelėse15. Dauguma hiperpigmentacijos gydymo būdų blokuoja tirozino pavertimą melaninu, kuris veikia kaip tirozinazės inhibitorius – pagrindinis reguliavimo fermentas, reikalingas melanino biosintezei16. Pastaruoju metu platus odos balinimo medžiagų, tokių kaip fenolio ir gyvsidabrio junginiai, naudojimas kosmetikos preparatuose sukėlė rimtų saugos problemų17. Be to, FFAR2 (taip pat žinomas kaip GPR43) yra įvairiuose audiniuose, pavyzdžiui, kaulų čiulpuose, blužnyje ir normalioje odoje18, ir yra daug žadantis vaistų taikinys nutukimui, kolitui ir kai kuriems uždegiminiams atsakams gydyti19. FFAR2 yra trumpos grandinės riebalų rūgščių (SCFA), kurių grandinės ilgis yra mažesnis nei šeši anglies atomai, tokių kaip acetatas, butiratas ir propionatas, stipriausias FFAR220,21 agonistas, receptorius. Anksčiau mes parodėme, kad in vivo FFAR2 numušimas pelių odoje blokavo sviesto rūgšties tarpininkavimą UV dirginimui3.

C. acnes is abundant on the human skin surface accounting for>60 procentų bakterijų2. Be to, propiono rūgštis (PA), fermentacijos metabolitas iš C. acnes, ir jos esterifikuoti dariniai veikia kaip potencialus antimikrobinis agentas prieš Staphylococcus aureu11,22, o poli(etileno oksido) dangos yra perspektyvus būdas išvengti infekcijų23. Odos komensalinės probiotinės bakterijos gali slopinti USA300 augimą fermentuojant poli(etilenglikolio) dimetakrilatą kaip selektyvų fermentacijos iniciatorių24. PF68, PEG pagrindu pagamintas polimeras, yra stabilus gelio nešiklis antimikrobinėms medžiagoms, padidinantis vaisto paviršiaus tirpumą, ir paprastai naudojamas gydant užkrėstas žaizdas be jokio pastebimo šalutinio poveikio25. Šiame tyrime nustatėme, kad PF68, kaip polimero kilmės junginys, yra potencialiai saugus ir veiksmingas agentas, o metabolitų, susidarančių PF68 fermentacijos metu, naudojant odos kommensalinį C. acnes, naudojimas gali slopinti UV sukeltą odos hiperpigmentaciją arba melanogenezę.

cistanche tubolosa privalumai: slopina odos melanogenezę.

Metodai

Etikos pareiškimas.

Šis tyrimas buvo atliktas griežtai laikantis patvirtinto Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (IACUC) protokolo Nacionaliniame centriniame universitete (NCU), Taivane (NCU{0}}) ir laikantis „Arrive“ gairių (https://arriveguidelines). .org/). Instituto vėžio tyrimų (ICR) pelės (8–9 savaičių amžiaus patelės; Nacionalinis laboratorinių gyvūnų centras, Taipėjus, Taivanas) buvo nužudytos naudojant CO2 uždaroje dėžėje. Visi metodai buvo atlikti pagal atitinkamas gaires ir reglamentus

Bakterijų kultūra.

C. acnes (ATCC 6919) buvo kultivuojamas sustiprintoje Clostridium terpėje (RCM, Oksfordas, Hempšyras, Anglija) anaerobinėmis sąlygomis naudojant Gas-Pak (BD, Sparks, MD, JAV). Bakterijos buvo auginamos 37 laipsnių temperatūroje iki logaritminio augimo fazės. Bakterijų granulės buvo surenkamos centrifuguojant 5, 000 × g 10 minučių, plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), o po to suspenduotos PBS arba RCM tolesniems eksperimentams.

Bakterijų fermentacija.

C. acnes (105 kolonijas formuojantys vienetai (CFU)/mL) buvo inkubuojami 10 ml TSB, esant 2 procentams PF68 (BASF, NY, JAV) anaerobinėmis sąlygomis naudojant Gas-Pak. esant 37 laipsnių. Tik PF68 TSB buvo įtrauktas kaip kontrolė. 0,002 procento (m/v) fenolio raudonojo (Sigma) TSB buvo fermentacijos indikatorius. Spalvos pasikeitimas iš raudonai oranžinės į geltoną rodo, kad įvyko bakterinė fermentacija, kuri buvo aptikta pagal optinį tankį esant 560 nm (OD560).

Dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS) analizė.

C. acnes (105 KSV/ml) ​​buvo inkubuojamas TSB (10 ml), dalyvaujant 2 procentams PF68. Po 1- dienos fermentuota terpė buvo centrifuguojama esant 5000 g 10 minučių, o supernatantas buvo naudojamas SCFA aptikti pagal anksčiau paskelbtą protokolą26. Acto rūgšties (AA), PA, sviesto rūgšties (BA) ir izosviesto rūgšties (I-BA) kiekiai fermentacijos terpėje buvo kiekybiškai įvertinti pagal kalibravimo kreivę, sudarytą iš šešių nulinių lygių, naudojant FFA testo standartą. Restek Corporation, Bellefonte, PA, JAV), kuris skiedžiamas iki 500-, 1,000-, 2,000-, 5,000- ir 10,000- sulankstyti.

B16F10 melanomos ląstelių kultūra.

B16F10 melanomos ląstelių liniją maloniai parūpino daktaras Richardas Gallo iš Kalifornijos universiteto San Diego (JAV) ir dr. Cheng Ching-Yi iš Chang Gungo mokslo ir technologijų universiteto Taivane. Ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA, JAV), papildytu 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS, Life Technologies) ir 1 procento penicilino-streptomicino (Life Technologies) 37 laipsnių ir 5 procentais. CO2. Ląstelės buvo auginamos iki 70–80 procentų susiliejimo ir po to subkultūrinamos tripsino-etilendiaminotetraacto rūgštimi (EDTA, Life Technologies).

Atvirkštinės transkripcijos – kiekybinė polimerazės grandininė reakcija (RT-qPCR).

RT-qPCR buvo naudojamas tirozinazės geno ekspresijai tirti B16F10 melanomos ląstelėse, apdorotose 4 mM PA 48 valandas. Bendra ląstelių RNR buvo išgauta naudojant Quick-RNA MiniPrep rinkinį (Zymo Research, CA, JAV), po to buvo atlikta atvirkštinė transkripcija į cDNR naudojant iScript cDNR sintezės rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV) ir amplifikuota RT-qPCR. ABI 7300 sistema (Applied Biosystems, Waltham, MA, JAV). Genų ekspresijos kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas lyginamasis ciklo slenkstis (ΔΔCT). Gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) geno lygis buvo naudojamas tirozino kinazės genui normalizuoti. Tirozinazės ir GAPDH pradmenys yra 5′-TGACAAAGCCAAAACCCCCA-3′ (į priekį); 5′-TTGTTCAAAAATACTTCCAGTGTGT-3′ (atgal) ir 5′-TGTGTCCGTCGRGGATCTGA-3′ (pirmyn); 5′-GATGCCTGCTTCACCACCTT3′ (atvirkščiai).

Ląstelių tirozinazės aktyvumas po FFAR2 geno numušimo.

B16F10 melanomos ląstelės buvo pasėtos 5 × 104 ląstelių/šulinėlių tankiu į 24-šulinėlių plokšteles. Be to, ląstelės buvo apdorotos FFAR2 selektyvaus antagonisto GLPG0974 (0,1 µM, GLPG) ir PA (4 mM) ir inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje 5 procentų CO2 24 valandas. Ląstelės buvo tripsinizuojamos ir lizuojamos RIPA buferiu (Thermo Fisher Scientific, NJ, JAV). Lizuotos ląstelės buvo užšaldytos -80 laipsniu ir du kartus atšildytos, po to centrifuguojamos 12, 000 aps./min 10 min. Supernatantas buvo sumaišytas su 1 ug/ml levodopos (L-DOPA, Sigma) santykiu 2:1 96-šulinėlių plokštelėje, inkubuojamas kambario temperatūroje (RT) 1 val., o OD ties 475 nm. aptiktas27.

kam naudojamas cistanchas: mažina tirozinazės aktyvumą

BrdU ženklinimas.

B16F10 melanomos ląstelės buvo auginamos ant 8-šulinėlių kameros stiklelių (Thermo Fisher Scientific) DMEM su 10 procentais FBS, penicilinu ir streptomicinu, kol buvo pasiektas 70 procentų susiliejimas. Į auginimo terpę kartu su 4 mM PA buvo pridėta bromodeoksiuridino (10 μM, BrdU, ACROS, Naujasis Džersis, JAV). BrdU, pridėtas su PBS į auginimo terpę, buvo įtrauktas kaip kontrolė. Po 24 valandų ląstelės buvo fiksuotos 4 procentų perfluoro Roxy (PFA, Sigma) ir 10 min. permeabilizuotos 0,2 procento Triton X -100 (Sigma). Tada ląstelės buvo apdorotos 2 N HCl 37 laipsnių temperatūroje 25 minutes, neutralizuojamos HCl su 0,1 M borato buferiu (pH 8,5) 10 minučių ir blokuojamos blokuojančiu buferiu prieš inkubuojant anti-BrdU antikūnus (Abcam, MA, JAV). nakties ir asilo anti-ožkos Alexa Fluor 568 IgG (H plius L) (Life Technology) kaip antrieji antikūnai 1 val. 4 laipsnių temperatūroje. Branduoliai buvo nudažyti 4,6-diamidino2-fenilindoliu (DAPI, Sigma). Vaizdai buvo gauti naudojant „cellSens“ programinę įrangą, prijungtą prie „Olympus BX63“ mikroskopo.

Pelės modeliai buvo sukurti veikiant UV šviesai.

Pelių modeliai padėjo geriau suprasti daugybę UVR28 vaidmenų. UVR padidina DOPA teigiamų melanocitų kiekį odoje, ypač poveikio vietoje29. C. acnes injekcijos į pelių ausis gydymo protokolas buvo aprašytas mūsų ankstesniame tyrime3 (šioje nuorodoje nekalbama apie C. acnes injekciją). Į ICR pelių ausis buvo įšvirkščiama į odą C. acnes (107 KSV) su 2 procentais PF68 ir be jo, po to buvo paveikta 312 nm bangos ilgio ultravioletinė B (UVB) 200 mg/cm2 doze, naudojant UV lempą (EB modelis) {10}}C, Spectronics Corp., Westbury, NY, USA) po 2 minutes kasdien 3 dienas. Pelės ausys, sušvirkštos PBS arba PF68, o po to UVB, buvo įtrauktos kaip kontrolė. Kitoje eksperimentinių pelių grupėje ausys buvo uždėtos 4 mM PA, po to buvo veikiamos UV spinduliais, o kontrolė buvo PBS.

siRNR tarpininkaujantis FFAR2 genų nutildymas.

Norėdami nutildyti FFAR2 geną, naudojome chemiškai modifikuotą siRNR, nukreiptą į FFAR2 receptorių (FFAR2 siRNR), siRNR neigiamą kontrolę (NC siRNR) ir kontrolę be injekcijos (C), kurios buvo gautos iš GenePharma Co. (Šanchajus, Kinija). Jų oligonukleotidų sekos yra siFFAR2: sensorinė grandinė, 5′-CCGGUGCAGUACAAGUUAUTT-3′; 5′-AUAACUUGUACUGCACCGGTT-3′ priešprasminė kryptis. valdymas: jutimo kryptis, 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′; 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ priešprasminė kryptis. Šios chemiškai modifikuotos siRNR buvo tiekiamos kiekvieną dieną 3 dienas intraderminiu būdu į pelių ausis, naudojant mikroadatą (2 mg / kg pelių svorio). Nuo antros dienos tepkite su 2 procentų PA ir UV spinduliais 3 dienas. Išankstinis apdorojimas siRNR sušvirkštimui į pelę, kaip aprašyta 30 nuorodoje. Dešimt, pelių ausys buvo iškirptos ir nudažytos ketvirtą dieną.

Western blotingas.

Į pelių ausis buvo sušvirkšta chemiškai modifikuota FFAR2 ir kontrolinė siRNR, po to 3 dienas buvo taikoma 2 procentų PA ir UVB ekspozicija. Trečią dieną pelių ausys buvo supjaustytos, homogenizuotos ir lizuojamos RIPA buferiu (Thermo Fisher Scientific). Ląstelių lizatai (30 µg) buvo paveikti 10 procentų SDS-PAGE geliu, kuris po to perkeltas į polivinilidenfluorido (PVDF) membraną (Sigma) ir užblokuotas 5 procentais (m/v) neriebiu pienu, prieš inkubuojant per naktį. pirminiai antikūnai prieš FFAR2 Rabbit PolyAb (Proteintech, Rosemont, IL, JAV) 4 laipsniu arba -aktinu (1:1,000; Cusabio Technology, Hiustonas, Teksasas, JAV). Po to sekė 1 val. gydymas krienų peroksidaze konjuguotu ožkų antriniu antikūnu prieš triušius (1:5000) (Thermo Fisher Scientific). Baltymų juostos buvo aptiktos naudojant chemiliuminescencinį aptikimo reagentą (Thermo Fisher Scientific) ir Omega Lum C vaizdo gavimo sistemą (Gel Co., San Franciskas, CA, JAV). Baltymų juostos buvo atliktos naudojant „ImageJ“ programinę įrangą.

Melanocitų skaičiavimas.

Pelės kremzlės buvo pašalintos rankiniu būdu, o odos audiniai mirkomi amonio tiocianato (Sigma) tirpale 37 laipsnių temperatūroje 2 0 min. Epiderminis ir bazinis sluoksniai buvo nušveisti nuo likusio odos audinio, o melanocitai buvo nudažyti panardinant į 0,1 M PBS (pH 7,2), turintį 0,14 proc. L-DOPA kambario temperatūroje 3 valandas ir melanocitų skaičių. odos audiniuose buvo nustatytas mikroskopu pagal anksčiau paskelbtą protokolą29.

Statistinės analizės.

Duomenų analizė atlikta nesuporuotu t-testu, naudojant Prism programinę įrangą. Statistinio reikšmingumo lygiai buvo nurodyti taip: *P<0.05,><0.01,><0.001, and="" ns="non-significant." the="" mean±standard="" deviation="" (sd)="" for="" at="" least="" three="" independent="" experiments="" except="" for="" two="" independent="" western="" blotting="" analyses="" for="" fig.="" 4c="" was="" displayed.="" animal="" experiments="" were="" performed="" with="" at="" least="" three="" animals="" per="" treatment="">

cistanche tubolosa

Rezultatai

C. acnes sukelia PF68 fermentaciją.

Ankstesni tyrimai parodė odos probiotikų fermentaciją, kad sukeltų SCFA gamybą, dalyvaujant junginiams kaip anglies šaltiniui26. Norint ištirti, ar C. acnes gali fermentuoti PF68, C. acnes buvo inkubuojamas su PF68 TSB terpėje 1 dieną su fenolio raudonuoju indikatoriumi, kad būtų galima stebėti bakterijų fermentaciją. TSB terpėje, inkubuotoje tik su bakterijomis, fenolio raudona spalva pasikeitė iš raudonos į oranžinę dėl bakterijų dauginimosi, o TSB terpėje, kurioje yra bakterijų ir PF68, fenolio raudona spalva pasikeitė į šviesiai geltoną, sumažėjus pH, o tai rodo, kad PF68 buvo naudojamas kaip. anglies šaltinis fermentacijai (1A pav.). Be to, fenolio raudonojo OD560 parodė reikšmingą pH vertės sumažėjimą TSB terpėje, kurioje yra bakterijų ir PF68 (1B pav.), palyginti su bakterijomis arba vien tik PF68. C. acnes fermente, kultivuotame su PF68, buvo nustatyti SCFA (1C pav.) ir buvo AA, PA, BA ir I-BA rūgštys, o PA11 koncentracija yra didžiausia (1D pav.). ).

1 pav. Bakterijų fermentaciją polimeru lydėjo intraląstelinio pH sumažėjimas.

PA poveikis in vitro melanino gamybai per PA-FFAR2.

Fatty acids modulate the degradation of tyrosinase, a crucial enzyme involved in melanin biosynthesis in melanocytes and melanoma cells31. Therefore, to detect the in vitro effect of PA on melanin synthesis, B16F10 melanoma cells were treated with 4 mM PA for 48 h, with the decreased expression of the tyrosinase in PA treated melanoma cells compared to the control (Fig. 2A). The immunostaining of PA-treated melanoma cells after BrdU labeling showed that PA did not alter the proliferation of melanoma cells (Fig. 2B). Furthermore, the effect of PA and AA, two highly expressed SCFAs in the fermentation filtrate (Fig. 1D)32, on melanin production was assessed in melanoma cells, with PA causing a>dvigubai sumažėjo melanino gamyba, palyginti su AA (2C pav.). SCFA, kaip ir PA ir AA, reguliuoja savo funkcijas sąveikaudami su FFAR2 ir FFAR3, o PA yra vienas iš stipriausių SCFA abiem šiems receptoriams33. Atsižvelgiant į PA reguliavimą per jo sąveiką su FFAR2, šio receptoriaus signalizacijos blokavimas naudojant selektyvų inhibitorių gali būti naudingas būdas įvertinti PA vaidmenį reguliuojant melanogenezę. Prieš pradedant gydymą PA, blokuojant FFAR2, naudojant selektyvų FFAR2 antagonistą GLPG, ląstelių tirozinazės aktyvumas nepakito, o be GLPG sumažėjo, priešingai nei kontrolinės grupės (2D pav.). Šie rezultatai parodė veiksmingą PA-FFAR2 vaidmenį mažinant melanino kiekį, slopinant tirozinazės kinazės aktyvumą melanomos ląstelėse su nepakitusiu ląstelių proliferacija.

2 pav. Tirozinazės geno ekspresijos ir ląstelių proliferacijos poveikis melanomos ląstelėse po gydymo PA.

C. acnes ir PF68 mišinys slopino UVB sukeltus funkcionuojančius melanocitus pelių ausyse.

Nustatyta, kad vietinis fermentacijos ekstraktų arba riebalų rūgščių naudojimas sumažina UV sukeltą odos hiperpigmentaciją, reguliuodamas tirozinazės skaidymą34, 35. Ankstesni tyrimai parodė, kad melanogenezė po UV poveikio atsiranda dėl funkcionuojančių melanocitų aktyvavimo epidermyje arba dermoje36. Nustačius, kad PA, kaip pagrindinis SCFA, atsirandantis dėl PF68 fermentacijos C. acnes, gali veiksmingai sumažinti melanino gamybą in vitro, tada ištyrėme C. acnes ir PF68 poveikį jam in vivo. ICR pelių ausys buvo veikiamos UVB spinduliuote kas antrą dieną 3 dienas kartu su C. acnes ir PF68 injekcijomis. Injekcija su PBS arba C. acnes arba vien PF68 buvo įtraukta kaip kontrolė. Epiderminis ir bazinis sluoksniai buvo nušveisti nuo odos audinio pelės ausyje, o melanocitai buvo nudažyti L-DOPA. Po UVB poveikio žymiai padidėjo melanocitų skaičius, o po C. acnes ar PF68 injekcijos nepasikeitė. Tačiau po gydymo C. acnes ir PF68 mišiniu buvo nustatytas reikšmingas DOPA teigiamų melanocitų skaičiaus sumažėjimas UVB poveikio grupėse (3A pav.).

3 pav. Melanocitų indukcija UVB spinduliais ir slopinimas skirtingais gydymo būdais.

UVB sukeltų funkcionuojančių melanocitų pagerinimas pelės ausyje PA, C. acnes fermentacijos metabolitu.

Buvo įvertintas tiesioginio PA panaudojimo poveikis UV sukeltai melanogenezei. UV sukelta hiperpigmentacija ir tirozinazės ekspresija pelių ausų odoje kontrolinėje grupėje po vietinio PA vartojimo 3 dienas buvo žymiai sumažinta (3B pav.). Tus, PA, C. acnes fermentacijos PF68 metabolitas, slopina veikiančių melanocitų gamybą, o melanino sintezę sukelia UVB. Tirozinazės ekspresija buvo pastebimai sumažinta PA apdorotose ląstelėse, palyginti su kontrole (3C pav.).

PA slopina UVB sukeltus veikiančius melanocitus per FFAR2 in vivo.

Norint nustatyti, ar egzogeninės melanogenezės sumažėjimas įvyko dėl PA sąveikos su giminingu receptoriumi, FFAR2 buvo numuštas pelės ausies odos melanocituose, po to buvo atliktas UVB poveikis ir gydymas PA. UVB sukeltas melanocitų proliferacijos padidėjimas ir tirozinazės aktyvumas buvo žymiai sumažintas pelės ausies epidermyje, sušvirkštame NC siRNR po PA panaudojimo (4A, B pav.). Tačiau melanocitų skaičius ir tirozinazės aktyvumas išlieka nepakitęs net ir po PA panaudojimo UVB apšvitintame pelės ausies epidermyje, numuštame FFAR2. Mes patvirtinome FFAR2 geno numušimą, išmatuodami FFAR2 baltymų ekspresijos lygį Western blot analize (4C pav.). Tus, PA trukdo melanogenezei, slopindamas tirozinazės, kurioje PA-FFAR2 vaidina potencialų vaidmenį melanino gamyboje, aktyvumą.

cistanche tubolosa ekstraktas

Diskusija

Melaninas, svarbus odos apsaugos nuo UV spinduliuotės veiksnys, yra sintetinamas melanocitų melanosomose, per dendritinius antgalius perkeliamas į gretimus keratinocitus ir galiausiai paskirstomas visame odos epidermyje37. Bakterijų fermentacijos metabolitai vis dažniau naudojami odos terapijoje dėl jų teigiamo poveikio UV sukeltam odos uždegimui ir infekcinėms ligoms3. Šiame tyrime parodėme, kad PA, pagrindinis C. acnes fermentacijos PF68 metabolitas, sumažino UVB sukeltą funkcionuojančių melanocitų kiekį, slopindamas tirozinazės aktyvumą in vitro ir in vivo per FFAR2.

Ankstesni tyrimai parodė melanogenezės slopinimą per tirozinazės slopinimą fermentacijos metabolitais iš probiotinių LA ir Lactobacillus bakterijų 24, 38, 39. Be to, didelės molekulinės masės PEG pagrindu pagamintas polimeras (~20, 000) buvo visiškai suskaidytas fermentuojant gramneigiamoms bakterijoms, gaminančioms acetatą ir propionatą40. Šiame tyrime PA (~4 mM) buvo daugiausiai SCFA C. acnes PF68 fermentacijos filtrate ir sumažino melanino kiekį melanocituose veiksmingiau nei AA. Be to, gydymas 4 mM PA reikšmingai slopino ląstelių tirozinazės aktyvumą melanocituose, įrodydamas, kad PA slopino melanogenezę sumažinus tirozinazės geno ekspresiją. Žmonės turi vienodą melanocitų skaičių, todėl ne odos pigmentacija turi įtakos, o funkcionuojančių melanocitų aktyvacija UV spinduliuote36,41. Čia gydymas 4 mM PA nepakeitė melanocitų proliferacijos, o tai rodo, kad tai yra veiksminga gydymo galimybė, nesukelianti ląstelių pažeidimo. Sumažėjęs melanocitų skaičius ir tirozinazės aktyvumas taip pat buvo pastebėtas pelių ausų odos audiniuose, kuriems buvo sušvirkštas C. acnes ir PF68 mišinio, ir tai rodo, kad melanogenezės slopinimą greičiausiai lemia fermentacijos metabolitai, atsirandantys C. acnes fermentacijos metu naudojant PF68 kaip anglį. šaltinis. Be to, mūsų tyrimas patvirtino, kad PA yra puikus antimikrobinis agentas, nepakeitęs jo pirminių bakterijų C. acnes augimo, o tai rodo, kad PA yra stiprus metabolitas, kuris nepažeidžia odos mikrobiomo pusiausvyros11.

Melanino gamybą inicijuoja ir reguliuoja kelios signalizacijos sistemos, pagal kurias tirozinazė katalizuoja tirozino pavertimą DOPA ir dopachinonu, todėl susidaro melanocitiniai pigmentai42, 43. Daugeliu atvejų odą šviesinantys reagentai veikia įvairiais melanino gamybos lygiais per FFAR2, kad paveiktų tirozinazės aktyvumą arba tiesiogiai nukreipia tirozinazę, kad slopintų melanogenezę odoje44–46. SCFA, pvz., PA ir AA, veikia prisijungdami prie jų selektyvių giminingų receptorių, tokių kaip FFAR2 arba FFAR3, o PA yra vienas stipriausių SCFA abiem receptoriams47. GLPG, selektyvus FFAR2 antagonistas, ir siRNR tarpininkaujamas FFAR2 genų nutildymas, siekiant palaikyti FFAR23, 48 blokavimą. Dabartiniame tyrime padidėjęs melanocitų skaičius ir tirozinazės geno ekspresija pelių ausų odos audiniuose nepakito, reaguodama į UVB spinduliuotę, net ir po PA pritaikymo pelėms FFAR2 numušimui (4A pav.). Be to, tirozinazės geno ekspresija sumažėjo po gydymo PA in vitro, tačiau FFAR2 geno blokavimas GLPG, selektyviu FFAR2 antagonistu, pagerino PA poveikį, kad susilpnėtų tirozinazės geno ekspresija. Užblokavus FFAR2, FFAR2 praradimas padidina tirozinazės aktyvumo ekspresiją po gydymo PA. Nors tiek PA, tiek AA, fermentacijos metabolitai iš C. acnes, turi panašų afinitetą FFAR2 surišimui20, santykinai mažesnis AA veiksmingumas silpninant tirozinazės aktyvumą melanocituose patvirtina terapinį PA, kaip postbiotiko prieš melanogenezę, potencialą.

Nuotraukas žalojantis UVR poveikis odai sulaukė didelio dėmesio. Apsaugos nuo saulės ir antihiperpigmentacijos produktai yra plačiai naudojami, tačiau jų saugumas, prasiskverbimas į odą ir terapinis veiksmingumas vis dar kelia abejonių49. Nors avobenzonas yra įprastas kremų nuo saulės komponentas dėl didelio veiksmingumo prieš UV spindulius, jis yra nestabilus fotonuotraukoje, todėl nėra saugus, o kraujyje buvo aptiktas po ilgalaikio naudojimo50,51. Veiksmingo odos balinimo sukūrimas blokuojant tirozinazės ekspresiją fermentacijos metabolitais iš probiotinių bakterijų arba polimerų, kaip anglies šaltinio, yra veiksmingas ir natūralus būdas slopinti melanogenezę38,39. Kadangi gyvų probiotikų naudojimas kosmetikos gaminiuose yra griežtai reglamentuotas, jų teigiamo poveikio skatinimas fermentuojant gyvų probiotinių bakterijų metabolitus tapo įmanoma pritaikymu. Be to, PF68, kaip prebiotikas, gali paskatinti SCFA gamybą iš C. acnes fermentacijos ir buvo naudojamas siekiant pagerinti biologinį stabilumą ir padėti įvairioms terapinėms medžiagoms, tokioms kaip 6-merkaptopurino pripildytos mikrosferos, sąveikaujant su žmogaus kūnu52. Be to, PF68 gali būti įtrauktas į ląstelių membranas ir perkelti į ląsteles ir buvo naudojamas kaip stabilus antimikrobinių medžiagų gelio nešiklis, padidinantis vaisto paviršiaus tirpumą gydant odą12, 23. Todėl PF68 buvo laikomas saugiu ir efektyviu pasirinkimu kuriant vaistus ir kosmetiką. Be PF68, kaip fermentacijos iniciatoriaus, padidinančio C. acnes fermentacijos aktyvumą, funkcijos, jis taip pat gali būti adjuvantas, mažinantis veiksmingas vaistų reagentų dozes ir gerinant blogai vandenyje tirpių vaistų tirpumą.

Apskritai šie rezultatai rodo, kad PA-FFAR2 sąveika gali būti pagrindinis probiotikų ar postbiotikų poveikio UVR sukeltai hiperpigmentacijai mechanizmas. PA gydymas neturėjo įtakos melanocitų proliferacijai. Palyginti su cheminėmis terapijomis, probiotikų metabolitai yra švelnesni ir natūralūs53. Nors tikslus mechanizmas, kuriuo C. acnes PF68 fermentacijos metabolitai slopina melanogenezę, nėra aiškus, šio tyrimo duomenys rodo, kad dalyvauja SCFAs-FFAR{5}}tirozinazės kelias. Šie rezultatai yra naudingi būsimam klinikiniam pigmentacijos sutrikimų gydymui ir kosmetikos, plečiančios balinamųjų produktų pritaikymo spektrą, kūrimui. Galiausiai, probiotikų įvairovė siūlo individualius hiperpigmentacijos gydymo būdus ir geresnių produktų kūrimą.

cistanche ekstrakto privalumai: odos balinimas