Cistanche Tubulosa ekstrakto metabolizmas in vitro ir in vivo normalioms ir lėtinėms nenuspėjamo streso sukeltos depresijos žiurkėms

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li ir kt

SANTRAUKA

Neseniai buvo patvirtinta, kad Cistanche tubulosa, viena iš Cistanches Herba rūšių, turi antidepresinį veiksmingumą lėtinio nenuspėjamo streso (CUS) žiurkėms, atkuriant žarnyno mikrobiotos homeostazę. Šiame straipsnyje mes siekiame ištirti C. tubulosa metabolinį profilį normaliose ir CUS sukeltos depresijos modelio žiurkėse in vitro ir in vivo. Naudojant UPLC-Q-TOF-MS, in vitro virškinimo trakto metabolizmas.Cistanche tubulosa ekstraktas(CTE) buvo įvertintas tiek normalioms, tiek CUS žiurkėms. Tuo pačiu metu CTE metabolizmas in vivo(Cistanche tubulosa ekstraktas)sveikoms ir depresija sergančioms žiurkėms taip pat buvo tiriamas žiurkių šlapimas ir išmatos. Iš viso atitinkamai 20 ir 26 metabolitai buvo apibūdinti iš normalių ir CUS žiurkių metabolizmo in vitro ir in vivo. CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo metabolizuojamas į aglikonus ir feniletanoidinių glikozidų (PhG) ir iridoidinių glikozidų skilimo produktus, tiek normalios, tiek prislėgtos žiurkės žarnyno mikrobiotos in vitro. II fazės aglikonų metabolitai ir PhG bei iridoidinių glikozidų skilimo produktai buvo pagrindiniai metabolitai žiurkių šlapime ir išmatose. Be to, metabolinis gebėjimas generuoti antrinius glikozidus ir aglikonus depresija sergančių žiurkių žarnyno mikrobiotoje buvo daug silpnesnis nei normalioje žiurkių žarnyno mikrobiotoje, o tai buvo priskirta sutrikusioms glikozidų hidrolazėms, kurias gamina žarnyno mikrobiota CUSdepresijos žiurkėms. Šio tyrimo rezultatai padėjo suprasti CTE antidepresantų savybių metabolinį procesą ir terapinį mechanizmą.

Raktažodžiai: Cistanche tubulosa, Depresija Metabolizmas, In vitro, In vivo, Žarnyno mikrobiota

1. Įvadas

Cistanches Herba oficialiai užregistruota kaip džiovinti sultingi Cistanche deserticola (YC Ma) ir C. tubulosa (Schrenk) stiebai, naudojami inkstų nepakankamumui, impotencijai, moterų nevaisingumui, morbidleukorėjai, gausiai metroragijai ir senatviniam vidurių užkietėjimui gydyti [1]. Šiuolaikiniai farmakologiniai tyrimai parodė, kad Cistanches Herba pasižymi įvairiomis biologinėmis savybėmis, tokiomis kaip antineurodegeneracija, imunoreguliacija ir priešuždegiminis poveikis [2,3]. Mūsų ankstesni tyrimai tai patvirtinoCistanche tubulosa ekstraktas(CTE), kuriuos sudaro 48,6 proc. feniletanoidinių glikozidų (PhG), 6,9 proc. iridoidinių glikozidų ir 2{5}},0 proc. viso sacharidų, gali žymiai palengvinti lėtinio nenuspėjamo streso (CUS) sukeltų depresinių žiurkių depresijos simptomus. atkuria žarnyno mikrobiotos homeostazę [4]. Naujausi tyrimai rodo, kad žarnyno mikrobiotos sudėties pokyčiai buvo susiję su depresijos vystymusi ir progresavimu [5,6]. Mikrobų genčių santykinis gausumas CUSdepresyvių modelių žiurkėms buvo labai sutrikęs, palyginti su normaliomis kontrolinėmis grupėmis [7]. Depresija sergančių pacientų žarnyno mikrobiotos įvairovė ir turtingumas taip pat buvo reikšmingai pakitęs [8]. Be to, įvairūs junginiai, įskaitant feniletanoidinius glikozidus (PhG) ir iridoidinius glikozidus, buvo laikomi pagrindinėmis Cistanches Herba [2,3] sudedamosiomis dalimis, kurios lengvai metabolizuojamos į antrinius glikozidus ir aglikonus, įskaitant hidroksitirozolį (HT), 3,4-dihidroksifenetilą. glikozidas, deglikozilinta genipozido rūgštis ir kt., kurią sukelia žmogaus žarnyno mikrobiota. Šie metabolitai lengviau absorbuojami žarnyne ir atlieka biologinį aktyvumą, atitinkantį prototipo komponentą[9–11]. Taigi, manome, kad depresijos atsiradimo ir vystymosi metu žarnyno mikrofloros struktūros sutrikimas neišvengiamai paveiks geriamųjų tradicinių kinų vaistų (TCM) metabolizmą virškinimo trakte, be to, paveiks šeimininko fiziologinę būklę. Dauguma esamų Cistanches Herba medžiagų apykaitos duomenų gauti iš medžiagų apykaitos tyrimų su sveikais gyvūnais[12–15]. Todėl būtų kliniškai svarbiau ištirti CTE metabolinį profilį(Cistanche tubulosa ekstraktas)patologinėje būsenoje, siekiant išsiaiškinti jo biologiškai aktyvius komponentus ir suprasti jo antidepresinio veiksmingumo mechanizmą.

Šiame tyrime siekiame apibūdinti CTE metabolinius profilius(Cistanche tubulosa ekstraktas)tiek sveikoms, tiek CUS sukeltoms depresinio modelio žiurkėms, naudojant itin efektyvią skysčių chromatografiją, skrydžio laiko kvadrupolio masės spektrometriją (UPLC-Q-TOF-MS). Skrandžio sultys, žarnyno skystis ir normalių ir depresinių patologinių žiurkių mikrobiota buvo naudojamos CTE metaboliniam procesui imituoti.(Cistanche tubulosa ekstraktas)virškinimo trakte in vitro, nepriklausomai ir nuosekliai. In vivo metabolitai taip pat išaiškinami išgėrus CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalioms ir CUS žiurkėms. Šis tyrimas suteikia naujų įžvalgų apie CTE metabolizmą ir aktyvius metabolitus(Cistanche tubulosa ekstraktas)dėl depresijos.

2. Medžiaga ir metodai

2.1. Medžiaga

Išdžiovinti C. tubulosa stiebai buvo surinkti iš Hetiano apygardos (Sindziangas, Kinija). Kupono mėginių autentiškumą patvirtino prof. Xiaobo Li ir jie buvo deponuoti Šanchajaus Jiao Tong universiteto (Šanchajus, Kinija) Farmacijos mokyklos herbariume. Ekstrahavimo metodas buvo naudojamas kaip nurodyta ankstesniame mūsų leidinyje [4]. TheCistanche tubulosa ekstraktas(CTE) mėginiai buvo laikomi 4 laipsnių temperatūroje ir prieš naudojimą vėl ištirpinami steriliu vandeniu. CTE sterilūs vandens tirpalai(Cistanche tubulosa ekstraktas)tada mėginiai buvo filtruojami per 0,22 μm membraną, o filtratai buvo surinkti į sterilius mėgintuvėlius.

Echinakozidą tiekė Dr. Pengfei Tu laboratorija, Pekino universitetas (Pekinas, Kinija). Akteozidas, izoakteozidas, 2′-acetillakteozidas ir cistanosidas A buvo įsigyti iš Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Čengdu, Kinija). Hidroksitirozolis, kavos rūgštis, 3,4-dihidroksibenzenpropiono rūgštis, 3-hidroksifenilpropiono rūgštis ir 3-fenilpropiono rūgštis buvo nupirkta iš Aladdin IndustrialInc. (Šanchajus, Kinija). Kiekvieno komponento grynumas HPLC-UV metodu buvo nustatytas > 95 proc. HPLC kokybės acetonitrilas buvo įsigytas iš Merck (Darmštatas, Vokietija). Dejonizuotas vanduo buvo paruoštas iš distiliuoto vandens naudojant Milli-Q vandens valymo sistemą (Millipore, Bedford, MA, JAV). Visi kiti naudojami reagentai ir cheminės medžiagos buvo analitinės kokybės.

2.2. Eksperimentai su gyvūnais

Sprague-Dawley žiurkių patinai (200 ± 20 g) buvo įsigyti iš Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pekinas, Kinija) ir apgyvendinti Šanchajaus JiaoTong universiteto (Šanchajus, Kinija) laboratorinių gyvūnų centre. Gyvūnai buvo laikomi grupėse, kontroliuojamoje kambario temperatūroje (25 ± 2 laipsniai, santykinė oro drėgmė 55 ± 10 proc.) su 12:12 h šviesos ir tamsos ciklu. Žiurkėms 1 savaitę buvo leista laisvai patekti į įprastą laboratorinių žiurkių maistą ir vandenį. Gyvūnų įrengimus ir protokolus patvirtino Šanchajaus Jiao Tong universiteto (Šanchajus, Kinija) gyvūnų etikos komitetas.

Po savaitės aklimatizacijos dvylika naivių žiurkių buvo atsitiktinai suskirstytos į dvi grupes (n=6), kontrolinę ir lėtinio nenuspėjamo streso (CUS) grupę. CUS žiurkės buvo sukurtos kaip ir ankstesnėje ataskaitoje [4], kurios buvo veikiamos įvairių stresorių: baltojo triukšmo (100 dB) 1 val., nakties žemo intensyvumo stroboskopinis apšvietimas (120 blyksnių per minutę), vandens trūkumas 24 valandas, tuščias. vandens buteliai 1 val. (po vandens trūkumo), maisto trūkumas 24 val., fizinis suvaržymas (1–2 val.), priverstinis plaukimas (5 min.), nešvarus narvas 24 val. (200 ml vandens 100 g pjuvenų patalyne), uodegos suspaudimas ( 1 min.), šokas 30 min., 45 laipsnių narvelio pakreipimas 24 val. ir naktinis apšvietimas (12 val.). Stresoriai buvo taikomi nuolat ir atsitiktinai 4 savaites, detalus išdėstymas aprašytas S1 lentelėje. Po 4 savaičių streso, kaip aprašyta anksčiau, buvo atliktas sacharozės pirmenybės testas, atviro lauko testas ir šėrimo naujovių slopinimo testas [4]. CUS ir elgsenos testo metmenys parodyta S1 pav. Atlikus elgsenos testus, iš kiekvienos žiurkės buvo paimtos mažiausiai 4 išmatų granulės ir įdėtos į sterilius kūginius mėgintuvėlius CTE analizei in vitro(Cistanche tubulosa ekstraktas)medžiagų apykaitą.

2.3. CTE metabolizmas virškinimo trakte(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalios ir CUS žiurkės in vitro

2.3.1. CTE metabolizmas(Cistanche tubulosa ekstraktas)imituotose skrandžio ir žarnyno sultyse

Penkiasdešimt miligramų CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo pridėta atitinkamai į 10 ml imituotų skrandžio sulčių ir žarnyno sulčių. Tada CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo inkubuotas 37 laipsnių temperatūroje 4 valandas skrandžio sultyse ir 6 valandas žarnyno sultyse. Kultivuojamas mišinys (1 ml) buvo užgesintas 3 ml vandeniu prisotinto n-butanolio iš karto 0 ir 4 val. skrandžio sultyse, o 0 ir 6 val. žarnyno sultyse. Naudoto mėginio apdorojimo metodas buvo aprašytas anksčiau [9].

2.3.2. CTE metabolizmas(Cistanche tubulosa ekstraktas)pagal normalią ir CUS žiurkių žarnyno mikrobiotą

Švieži normalių ir CUS žiurkių išmatų mėginiai pirmiausia buvo sumaišyti ir homogenizuoti su 25 kartus didesniu GAM sultinio tūriu. Nuosėdos buvo pašalintos filtruojant per tris marlės gabalus. Tada suspensija buvo inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje anaerobiniame inkubatoriuje, kuriame oras buvo pakeistas dujų mišiniu (H2 5 proc., CO2 10 proc., N2 85 proc.). Penkiasdešimt miligramų CTE buvo pridėta į 5 ml normalios ir CUS žiurkės išmatų suspensijos atskirai, ir suspensija buvo inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje 48 valandas. Išaugintas mišinys buvo pašalintas ir ekstrahuotas vandeniu prisotintu butanoliu 0, 12, 24 ir 48 val. Mėginių apdorojimo metodas buvo aprašytas anksčiau [9].

2.3.3. Nuoseklus CTE metabolizmas(Cistanche tubulosa ekstraktas)skrandžio sulčių, žarnyno sulčių, normalios ir CUS žiurkių žarnyno mikrobiotos

Pirma, 100 mg CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo pridėta į 1{{10}} ml imituojamų skrandžio sulčių ir inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje 4 valandas. Visa reakcija buvo sustabdyta 3 kartus didesniu tūriu vandeniu prisotintu n-butanoliu ir centrifuguojama esant 3000 aps./min. 15 min., po to supernatantas išgarinamas azoto srove. dujos 37 laipsnių temperatūroje. Antra, likutis vėl ištirpinamas 0, 4 ml sterilaus vandens, įpilamas į 8 ml imituojamų žarnyno sulčių ir inkubuojamas 37 laipsnių temperatūroje 6 valandas. Mėginys su skrandžio sultimis buvo paruoštas tokiu pačiu būdu. Galiausiai, likutis vėl ištirpinamas 0, 3 ml sterilaus vandens, atitinkamai pridedamas prie 6 ml normalių ir CUS žiurkių išmatų suspensijų ir inkubuojamas 37 laipsnių temperatūroje 48 valandas anaerobiniame inkubatoriuje. Vienas mililitras reakcijos buvo užgesintas 3 ml vandeniu prisotinto n-butanolio iš karto 0 ir 4 val. skrandžio sultyse, 0 ir 6 val. žarnyno sultyse ir 0, 12, 24 ir 48 val. žiurkės žarnyno mikrobiotoje. . Mėginys buvo apdorotas identiškai CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)imituotose skrandžio sultyse.

2.4. CTE metabolizmas(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalios ir CUS žiurkės in vivo

Tada kiekviena dviejų grupių žiurkė buvo laikoma atskirame metaboliniame narve. Po naktinio badavimo, kuris leido laisvai patekti į vandenį, visoms žiurkėms per agastrinį mėgintuvėlį buvo sušvirkšta 2 ml vandens. Tušti šlapimo ir išmatų mėginiai buvo paimti iš visų žiurkių nuo 0 val. iki 12 val. Be to, CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)(400 mg/kg) buvo suleidžiama per zondą. Šlapimo ir išmatų mėginiai buvo renkami nuo 0 iki 24 valandų. Visi šlapimo ir išmatų mėginiai buvo nedelsiant laikomi –80 laipsnių temperatūroje.

Šlapimo ir išmatų mėginiai iš normalių ir CUS žiurkių buvo iš anksto apdoroti, kaip aprašyta anksčiau [12]. Visi gauti mėginiai buvo analizuojami UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analitinis metodas

UPLC buvo atlikta naudojant Waters ACQUITY UPLC sistemą (WatersCorp., Milford, MA, JAV) su ACQUITY UPLC BEH C18 kolonėle (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , JAV) gradientiniu eliuavimu naudojant {{10}},1 proc. skruzdžių rūgšties acetonitrilo (A) ir 0,1 proc. skruzdžių rūgšties vandenyje (B), esant 0,4 ml/min. . Gradiento profilis buvo: 0–5 min (A: 5–20 proc.), 5-7,5 min (A: 20-30 proc.), 7,5-10 min (A: 30-70 proc.), 10-11 min (A) : 70–100 proc.), ir buvo laikomas 1,5 min. Gradientas buvo grąžintas iki 5 procentų per 0,5 min. ir buvo laikomas 2,5 min kitam paleidimui. Įpurškimo tūris buvo 3 μL. Kolonėlės krosnies temperatūra buvo nustatyta iki 35 laipsnių.

Masių spektrometrija buvo atlikta naudojant Waters Vion IMS masės spektrometrą (Waters Corp., Milford, MA, JAV). Jonizacija buvo atlikta neigiamo elektropurškimo (ESI−) režimu. MS parametrai buvo tokie: kapiliarinė įtampa, −2.0 kV; kūgio įtampa, 20 V; šaltinio temperatūra, 120 laipsnių; desolvacijos temperatūra, 500 laipsniai ; kūgio ir desolvacijos dujų srautai, atitinkamai 50 ir 1000 l/h. Norint tiksliai išmatuoti masę, leucinas-enkefalinas buvo naudojamas kaip užrakto masė [M–H]– jonui generuoti (m/z 554,2615). MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) eksperimentas su dviem skenavimo funkcijomis buvo atliktas taip: 1 funkcija (maža energija): m/z 50–1000, 0,25 s skenavimo laikas, 0,02 s tarpskenavimo delsa, 6 eV susidūrimo energija; 2 funkcija (didelė energija): m/z50–1000, 0,25 s nuskaitymo laikas, 0,02 s tarpinio nuskaitymo delsa, susidūrimo energijos tempas 20–45 eV.

2.6. Duomenų apdorojimas

Duomenys buvo apdoroti naudojant UNIFI 1.8.1 programinę įrangą (Waters Corp., Milford, MA, JAV), kad būtų galima identifikuoti metabolitus pagal tikslius viso nuskaitymo neapdorotus duomenis, surinktus per MSE. Junginiai buvo identifikuoti pagal tikslią masę, fragmentus didelės energijos masės spektrometrijoje. Intensyvumo slenkstis buvo nustatytas kaip 100,0. Taikinio identifikavimas, fragmentų atitikties tolerancija ir kiti parametrai buvo nustatyti automatiškai.

3. Rezultatai

3.1. CUS sukeltos depresijos žiurkės elgesio pokyčiai

Žiurkės, turinčios CUS sukeltų depresijos simptomų, buvo vertinamos atliekant elgesio testus, įskaitant sacharozės pasirinkimo testą, atviro lauko testą ir naujovių slopinimo šėrimo testą. Studento t testas atskleidė, kad sacharozės pirmenybė sacharozės pirmenybės teste (p < 0,001),="" bendras="" atstumas,="" įveiktas="" atliekant="" atviro="" lauko="" testą="" (p="">< 0,001),="" ir="" vėlavimas="" valgyti="" naujovių="" slopinto="" maitinimo="" teste="" (p="">< 0,01)="" buvo="" reikšmingi.="" skiriasi,="" palyginti="" su="" kontroline="" grupe="" po="" 4-savaitės="" cus="" gydymo="" (1="" pav.).="" šios="" išvados="" parodė,="" kad="" lėtinio="" nenuspėjamo="" streso="" modelis="" buvo="" sėkmingai="">

3.2. CTE cheminių sudedamųjų dalių apibūdinimas(Cistanche tubulosa ekstraktas)

Išsami CTE prototipų sudedamųjų dalių analizė(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo atlikta UPLC-Q-TOF-MS. Iš viso 27 sudedamosios dalys iš CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo aptikti ir preliminariai apibūdinti, įskaitant 20 PhG, 5 iridoidus ir iridoidinius glikozidus ir 2 oligosacharidus. Išsami informacija, įskaitant sulaikymo trukmę, tikslius MS ir MS/MS fragmentų jonus, yra pateikta pagalbinėje informacijoje (S2 lentelė), kad būtų galima suprasti šių cheminių sudedamųjų dalių struktūrą. UPLC-Q-TOF-MS bendra jonų chromatograma (TIC) CTE parodyta S2 pav.

3.3. CTE metabolizmas virškinimo trakte(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalios ir CUS žiurkės in vitro

Šiame tyrime galimi CTE metabolitai(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalių ir CUSrats in vitro buvo aptikti iš TIC ir identifikuoti naudojant elementinių kompozicijų ir MS / MS fragmentų masės spektrų derinį, palyginus juos su kontroliniais mėginiais. Visi CTE metabolitai(Cistanche tubulosa ekstraktas)Imituotose skrandžio ir žarnyno sultyse normali ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiota yra išvardyta 1 lentelėje.

3.3.1. CTE metabolizmas(Cistanche tubulosa ekstraktas)imituotose skrandžio ir žarnyno sultyse

Septyni CTE metabolitai(Cistanche tubulosa ekstraktas)imituotose skrandžio sultyse buvo preliminariai identifikuoti pagal tikslią masę ir MSE fragmento informaciją: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 min.), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min.), M5 (m/z 45,1 H217 45,1 H 145,1 H). 2,60 min.), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min.), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min.), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 3 min., ir 5,8 min.) .1968, C29H36O15, 5,81 min.). Deglikozilinimas, dehidroksilinimas, dehidrogenizavimas ir izomerizacija buvo laikomi pagrindiniais CTE metabolizmo būdais skrandžio sultyse. Nustatyta, kad M4 ir M5 molekulinė masė yra 2 Da ir 16 Da mažesnė nei jų prototipo komponento dekafeoilaktozido, todėl jie buvo atitinkamai identifikuoti kaip dehidrogenuoti ir dehidroksilinti produktai. M12 buvo identifikuotas kaip echinakozido izomeras, gaminantis tuos pačius jonus kaip ir echinakozidas, esant m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Tie patys metabolitai buvo aptikti po CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)inkubacija žarnyno sultyse. Pažymėtina, kad kofeilo grupė, esanti PhGs C-6′ padėtyje, buvo lengvai metabolizuojama žarnyno sulčių virškinimo fermentų, kad susidarytų dekofeilo metabolitai ir kavos rūgštis.

3.3.2. CTE metabolizmas(Cistanche tubulosa ekstraktas)pagal normalią ir CUS žiurkių žarnyno mikrobiotą

Iš CTE iš viso biologiškai transformuota 20 metabolitų(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalaus rato žarnyno mikrobiota buvo aptikta ir identifikuota (2 pav.). Remiantis rezultatais buvo pastebėta, kad PhG suskaidomi iki aglikono hidroksitirozolio (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min.) ir kavos rūgšties (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min.) buvo toliau metabolizuojami iki M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min.), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min.), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, C10H12O4, 4,15 (min.), 4,15. , C9H10O3, 4,36 min.) dehidroksilinant, redukuojant ir metilinant. Be to, centriniai medžiagų apykaitos keliai, gaminantys tiesioginius PhG prototipų junginių metabolitus iš CTE normalioje žiurkės žarnyno mikrobiotoje, yra redukcija, metoksilinimas, deglikozilinimas, kofeoilas, dehidrogenizacija ir izomerizacija.

Po inkubacijos CUS sukeltoje depresijoje žiurkės žarnyno mikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo paverstas 20 metabolitų tais pačiais metabolizmo keliais kaip ir normalios žiurkės.

3.3.3. Nuoseklus CTE metabolizmas skrandžio sultimis, žarnyno sultimis, normalia ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiota

Po nuoseklaus inkubavimo skrandžio sultyse, žarnyno sultyse, normalioje ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiotoje, CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo metabolizuotas į 14 metabolitų (iš jų 8 su skrandžio sultimis, 7 su žarnyno sultimis, 11 su normaliomis ir 10 su CUS žiurkės žarnyno mikrobiota). Tarp jų M2(HT) ir M11 (3-hidroksifenilpropiono rūgštis, 3-HPP) buvo galutiniai PhG metabolitai po nuoseklios CTE inkubacijos.(Cistanche tubulosa ekstraktas)skrandžio sultyse, žarnyno sultyse ir žarnyno mikrobiotoje. Nebuvo reikšmingo metabolitų skirtumo tarp normalių ir CUS žiurkių.

M8, M9, M14, M17, M19 ir M20 buvo aptikti tik nepriklausomame CTE metabolizme normalios ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiotos. Šie metabolitai daugiausia buvo tarpiniai metaboliniai produktai, kurie tiriant nuoseklų CTE metabolizmą buvo visiškai metabolizuoti į galutinius metabolitus, todėl juos sunku aptikti.

3.3.4. Skirtumai tarp CTE metabolizmo greičio pagal normalią ir CUS rato žarnyno mikrobiotą

Išsiaiškinti CTE metabolizmo greičio skirtumus(Cistanche tubulosa ekstraktas)pagal normalią ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiotą, santykinis 27 prototipų junginių ir 20 metabolitų kiekis po inkubacijos su skrandžio sultimis, žarnyno sultimis, normalia ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiota buvo nustatytas atskirai ir nuosekliai (S3 ir S4 lentelės). Rezultatai parodė, kad nors reikšmingų skirtumų tarp CTE nebuvo(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalių ir depresinių žiurkių metabolitų, buvo pastebėtas reikšmingas jų metabolizmo greičio skirtumas. Pavyzdžiui, C2 ir C5 buvo identifikuoti kaip 8-epilogano rūgštis arba jos izomeras. Normaliuose mėginiuose jie buvo visiškai metabolizuojami per 12 valandų inkubacijos. Tačiau patologiškai prislėgtoje žiurkių žarnyno mikrobiotoje jie buvo kruopščiai metabolizuojami po 48 valandų inkubacijos. Buvo akivaizdu, kad normalios žiurkės metabolizmas buvo greitesnis nei CUS žiurkės. Panašūs rezultatai buvo rasti naudojant C18 (izoakteozidą). Be to, pažymėtina, kad M12 (echinakozido izomerizacija) ir M16 (tubulozido A izomerizacija) smailės plotas normaliuose mėginiuose buvo daug didesnis nei CUS mėginiuose, o tai rodo, kad CTE izomerizacijos reakcija.(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo labiau paplitęs normalioje žiurkės žarnyno mikrobiotoje, nei depresija sergančioje žiurkės žarnyno mikrobiotoje.

3.4. CTE metabolizmas normaliose ir CUS žiurkėse in vivo

Lyginant CTE gydytos grupės biologinius mėginius su tuščiaisiais biologiniais mėginiais, iš viso buvo gauti 26 CTE metabolitai (1–26 junginiai).(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo aptiktos nenormalios ir CUS žiurkės (2 lentelė). Įprastos normalių ir CUS žiurkių šlapimo mėginių UPLC chromatogramos pateiktos 3 pav.

3.4.1. CTE metabolitų apibūdinimas normaliame ir CUS raturine

Iš viso 18 in vivo CTE metabolitų(Cistanche tubulosa ekstraktas)normalių žiurkių šlapimo mėginiai buvo preliminariai nustatyti. PhG skilimo metabolitai, įskaitant HT ir CA, ir tolesnis jų sulfatavimas (junginys 1, 2, 3, 5, 8 ir 16), metilinimas (6, 21, 22 ir 24) ir metoksilinimo (13 ir 14) metabolitai buvo pagrindinių metabolitų normaliame žiurkės šlapime. Iridoidiniai glikozidai buvo lengvai metabolizuojami į aglikonus (23, 25 ir 26) deglikozilinimo būdu. Pažymėtina, kad normaliame žiurkės šlapimo mėginyje nebuvo aptiktas joks prototipo komponentas.

Depresinės žiurkės šlapimo mėginyje buvo 22 CTE metabolitai(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo aptikti ir apibūdinti. Patologiniame žiurkės šlapime buvo aptiktas vienas prototipo junginys, 8-epilogano rūgštis. Kiti metabolitai atitiko randamus normaliame žiurkės šlapime, įskaitant sulfatuotus metabolitus (1, 2, 3, 8, 10 ir 16), metilintus metabolitus (6, 11, 19 ir 22), metoksilintus metabolitus (13 ir 14). HT ir CA, ir iridoidinių glikozidų aglikonus (25 ir 26).

3.4.2. CTE metabolitų apibūdinimas(Cistanche tubulosa ekstraktas)įprastose ir CUS žiurkių išmatose

Šiame tyrime tik vienas CTE metabolitas (20 junginys, 3-HPP).(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo nustatytas normaliose žiurkės išmatose. Dauguma PhG pirmiausia buvo suskaidyti iki CA, todėl toliau metabolizuojami į pagrindinį mikrobų metabolitą 3-HPP. CUS žiurkės išmatų mėginyje buvo detaliai apibūdinti 3 metabolitai, įskaitant sulfatuotą 3-HPP (16 junginys) ir sulfatuotą HT (2 ir 3 junginiai).

3.4.3. Skirtumai tarp normalių ir CUSrats CTE metabolitų in vivo

Išgėrus CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas), in vivo metabolitai parodė akivaizdžius sveikų ir depresinių modelių žiurkių skirtumus. 21 metabolitas (junginys 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 ir 19–26) buvo aptiktas tiek sveikų, tiek CUS žiurkių mėginiuose. 23 junginys (deglikozilinta genipozido rūgštis) buvo nustatytas tik sveikų žiurkių mėginiuose, o junginiai 4 (HT), 7 (8-epilogano rūgštis), 15 (3, 4-dihidroksibenzenpropiono rūgštis) ir 18 ({{ 19}}HPP gliukuronido konjugacija) buvo aptikta tik CUS modelio žiurkių mėginiuose. Apibendrinant galima pasakyti, kad prototipo sudedamosios dalys buvo aptiktos tik CUS žiurkėms, o daugiau II fazės metabolitų buvo aptikta normalioms žiurkėms.

4. Diskusija

Šiame tyrime trys in vitro inkubacijos modeliai, įskaitant skrandžio sultis, žarnyno sultis, normalią ir CUS žiurkės žarnyno mikrobiotą, buvo naudojami nepriklausomai ir nuosekliai, siekiant ištirti CTE virškinimo trakto metabolinį profilį.(Cistanche tubulosa ekstraktas)in vitro. Nustatyta, kad PhGsand iridoidiniai glikozidai CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)CUS sukelta depresinė žiurkės žarnyno mikrobiota buvo lengvai metabolizuojama į antrinius glikozidus ir aglikonus. Po to CTE metabolizmas in vivo(Cistanche tubulosa ekstraktas)taip pat buvo patikrinta normalioms ir CUS žiurkėms. Siūlomi CTE metaboliniai keliai(Cistanche tubulosa ekstraktas)sveikų ir CUS sukeltų depresinių žiurkių organizme parodyta 4 pav. PhG, tokie kaip echinakozidas ir akteozidas, buvo metabolizuojami į HT ir CA, o CA toliau metabolizuojamas į pagrindinį mikrobinį metabolitą 3-HPP. Tada HT, CA ir 3-HPP buvo metabolizuojami į sulfatuotus, metilintus ir metoksilintus metabolitus. Iridoidiniai glikozidai, įskaitant genipozido rūgštį, kankanosidą A ir kankanosidą N, buvo metabolizuojami į jų aglikonus deglikozilinimo būdu. Tai taip pat parodė, kad PhG ir iridoidiniai glikozidai CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)CUS žiurkėms buvo lengvai metabolizuojami į antrinius glikozidus ir aglikonus. Šie metabolitai paprastai pasižymi geresne absorbcija žarnyne ir biologiniu prieinamumu, kad vėliau absorbuotųsi į kraują ir sukeltų biologinį aktyvumą [16–18]. Verta paminėti, kad PhG virškinimo trakte buvo paplitusi izomerizacija, atitinkami metabolitai buvo nustatyti palyginus su jų prototipų junginių UPLC sulaikymo laiku, remiantis optimizuotu idealiu UPLC gradiento profiliu.

Kofeino rūgštis buvo pagrindinis CTE skilimo produktas(Cistanche tubulosa ekstraktas)depresinės patologinės žiurkės žarnyno mikrobiotos. Ankstesnėse publikacijose buvo pranešta, kad kavos rūgštis sukelia antidepresinį poveikį atliekant priverstinio plaukimo testą su pelėmis. Po priverstinio plaukimo testo žymiai sumažėjo tiek smegenų kilmės neurotrofinio faktoriaus (BDNF) mRNR lygis priekinėje žievėje, tiek TrkB mRNR lygis amigdaloje, o ankstesnį sumažėjimą žymiai slopino kavos rūgštis [19]. Hidroksitirozolis buvo PhG aglikonas, kuri apsaugo neurogenezę ir pažinimo funkcijas, užkertant kelią streso sukeltam nervinio baltymo BDNF sumažėjimui [20]. Taigi būtina daugiau dėmesio skirti kai kuriems biologiškai aktyviems metabolitams (ty HT ir CA), kuriuos paskyrus per burną transformuoja žarnyno mikrobiota.

Be to, šios išvados įrodo, kad depresyvios žarnyno mikrobiotos metabolinis gebėjimas generuoti antrinius glikozidus ir aglikonus buvo žymiai silpnesnis nei nenormalios žiurkės žarnyno mikrobiotos. Priežastis greičiausiai siejama su depresijos sukeltais struktūriniais žarnyno mikrobiotos pokyčiais, dėl kurių sumažėja žarnyno mikrobiotos gaminamų metabolinių fermentų aktyvumas [21]. Įdomu tai, kad ankstesnis tyrimas parodė, kad Bacteroidetes užkodavo gausiausius glikozidų hidrolazės ir polisacharidų liazės genus, skirtus glikozidų hidrolizei ir kompleksinių angliavandenių skaidymui su pašalinimo mechanizmu [22]. Konkrečiai, Bacteroides spp. įskaitant B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis ir B. ksilanizolvenai parodė dominuojantį bendrą genų, koduojančių GH ir PL, skaičių. Parabacteroides distasonis taip pat turi tas pačias savybes [22]. Ankstesni tyrimai patvirtino, kad 28-dienos nenuspėjamas streso stimuliavimas sumažino santykinį Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas ir Weissella genčių gausumą, o žiurkėms padidino Ruminococcus ir Deinococcus [4]. Pažymėtina, kad Bacteroides ir Parabacteroides buvo du gausiausi mikrobų taksonai, kurių santykinis gausumas normaliose žiurkėse sudarė apie 20 procentų. Po gydymo CUS santykinis Bacteroides ir Parabacteroides gausa smarkiai sumažėjo iki maždaug 5 procentų depresinių modelių žiurkėse. Todėl tai neišvengiamai sukels bendro GH ir PL fermentų skaičiaus sumažėjimą CUS žiurkėse ir dar labiau sutrikdys deglikozilintą reakciją, kurią sukelia CUS slegianti žarnyno mikrobiota po geriamojo CTE vartojimo.(Cistanche tubulosa ekstraktas)žiurkių modeliuose.

5. Išvada

Šiame tyrime buvo sukurtas ir pritaikytas UPLC-Q-TOF-MS metodas metabolitų atrankai ir identifikavimui.Cistanche tubulosa ekstraktasnormalioms ir CUS depresija sergančioms žiurkėms in vitro ir in vivo. Rezultatai parodė, kad CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas)buvo metabolizuojamas į aglikonus ir PhG bei iridoidinių glikozidų skilimo produktus tiek sveikos, tiek nuslopintos žarnyno mikrobiotos. Išgėrus CTE(Cistanche tubulosa ekstraktas), II fazės aglikonų metabolitai ir PhG bei iridoidglikozidų skilimo produktai daugiausia buvo rasta žiurkių šlapime. Metabolinis gebėjimas generuoti antrinius glikozidus ir aglikonus depresyvioje rato žarnyno mikrobiotoje buvo daug silpnesnis nei normalios žiurkės žarnyno mikrobiotos, kuri buvo priskirta sutrikusioms glikozidhidrolazėms, kurias gamina žarnyno mikrobiota CUS sergančiose žiurkėse. Šis tyrimas suteikia naują perspektyvą vėliau. CTE plėtra(Cistanche tubulosa ekstraktas)kaip potencialus antidepresantas.

Padėkos

Šis darbas buvo paremtas Kinijos nacionalinės pagrindinių mokslinių tyrimų ir plėtros programos (2017YFC1702400) dotacijomis.

A priedas. Papildomi duomenys

Papildomus šio straipsnio duomenis galite rasti internete adresu HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Iš: ' In vitro ir in vivo metabolizmasCistanche tubulosa ekstraktasnormalioms ir lėtinėms nenuspėjamo streso sukeltos depresijos žiurkėmsYang Li ir kt

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Nuorodos

[1] Kinijos farmakopėjos komisija, Kinijos Liaudies Respublikos farmakopėja, 2015 m. leidimas, China Medical Science Press, Pekinas, Kinija, 2015 m., p. 135 I dalis.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Cistanche rūšių cheminių sudedamųjų dalių analizė, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: jos chemijos, farmakologijos ir farmakokinetikos savybių apžvalga, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Į antidepresantus panašus poveikisCistanche tubulosa ekstraktasdėl lėtinio nenuspėjamo streso žiurkėms atkuriant žarnyno mikrobiotos homeostazę, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Žarnyno ir smegenų ašis: kaip mikrobiomas veikia nerimą ir depresiją, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Naujausi pokyčiai siekiant suprasti žarnyno mikrobiotos vaidmenį smegenų sveikatai ir ligoms, Ann. NY Akad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Žarnų mikrobiotos ir išmatų metabolinio fenotipo kitimai, susiję su depresija pagal 16S rRNR genų seką ir LC/ MS pagrįsta metabolomika, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, „Bliuzo perkėlimas: su depresija susijusi žarnyno mikrobiota sukelia žiurkės neuroelgesio pokyčiai, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Cistanches Herba vandens ekstrakto metabolizmas žmogaus virškinimo trakte in vitro: metabolizmo profilio išaiškinimas, pagrįstas išsamiu metabolitų identifikavimu skrandžio sultyse, žarnyne. sultys, žmogaus žarnyno bakterijos ir žarnyno mikrosomos, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Echinakozido metabolitų, kuriuos gamina žmogaus žarnyno bakterijos, identifikavimas naudojant itin efektyvią skysčių chromatografiją/kvadrupolio skrydžio laiko masės spektrometriją, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, trijų tipiškų feniletanoidinių glikozidų metabolitų iš Cistanches Herba atranka ir identifikavimas, atliktas žmogaus žarnyno bakterijų, naudojant UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Greitas Cistanche deserticola ir C. tubulosa metabolitų metabolitų ir C. tubulosa vandens ekstrakto skirtumų nustatymas žiurkėse UPLC metodu. Q-TOF-MS kombinuota modelio atpažinimo analizė, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, sistemingai apibūdinkite echinakozido ir akteozido metabolitus iš Cistanche tubulosa žiurkių plazmoje, tulžyje, šlapime ir išmatose remiantis UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Metodas, kaip nustatyti nuoseklius metabolitus tipiškas feniletanoido glikozidas, echinakozidas, pagrįstas skysčių chromatografijos jonų gaudymo laiku
skrydžio masių spektrometrijos analizė, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism of Echinakozido, gero antioksidanto, žiurkėms: jo tulžies metabolitų išskyrimas ir identifikavimas, Narkotikų Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Žolinių vaistų ir žarnyno mikrobiotos sąveikos molekulinių mechanizmų supratimas, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Ginsenozidų absorbcija ir išsidėstymas po geriamojo Panax notogenseng ekstrakto skyrimas žiurkėms, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Žarnyno mikrobiotos sąveika su funkciniais maisto komponentais ir maistinėmis medžiagomis, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kavos rūgštis sumažina žievės BDNF mRNR ekspresijos sumažėjimą, sukeltą priverstinio poveikio. plaukimo stresas pelėms, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Motinos hidroksitirozolio vartojimas pagerina neurogenezę ir pažinimo funkciją esant prenataliniam stresui. palikuonys, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Žarnyno mikrobiotos įtaka vaistų metabolizmui ir toksiškumui, eksperto nuomonė. Narkotikų metab. Toksikolis. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Angliavandenių aktyvių fermentų gausa ir įvairovė žmogaus žarnyno mikrobiotoje, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.