RPX1 inaktyvavimas Arabidopsis sukelia atsparumą Plutella Xylostella per homoterpeno DMNT kaupimąsi

Abstraktus

Lepidopterinis augalų kenkėjas Plutella xylostella labai riboja Brassica auginimą. Čia mes pranešame apie naują RPX1 (atsparumo P. xylostella) vaidmenį atsparumui šiam Arabidopsis thaliana kenkėjui. Mutantas rpx1‐1 atbaido P. xylostella lervas, o maitinimasis rpx1‐1 mutantu stipriai pažeidžia peritrofinės matricos struktūrą lervų vidurinėje žarnoje, taip neigiamai paveikdamas lervų augimą ir lėliavimą. Šis atsparumas atsiranda dėl gynybinių junginių, įskaitant monoterpeną (3E)-4,8-dimetil-1,3,7-nonatrieną (DMNT), kaupimosi dėl PENTACYCLIC TRITERPENE SYNTHASE 1 (PEN1), kuris koduoja pagrindinis DMNT biosintetinis fermentas. P. xylostella užkrėtimas ir žaizdos sukelia RPX1 baltymo degradaciją, o tai gali greitai reaguoti į vabzdžių užkrėtimą. RPX1 inaktyvacija ir per didelė PEN1 ekspresija nėra susiję su neigiamais augalų augimo kompromisais, tačiau turi daug didesnę sėklų gamybą nei laukinio tipo, esant P. xylostella užkrėtimui. Šis tyrimas siūlo naują augalų molekulinio veisimo prieš P. xylostella strategiją.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

  RAKTINIAI ŽODŽIAI

atsparumas kenkėjams, antrinis metabolizmas, lakiosios emisijos

1|ĮVADAS

Kenkėjai vabzdžiai ne tik mažina pasėlių derlių, bet ir daro įtaką augalininkystės produktų kokybei (Johnson & Züst, 2018; Wu ir kt., 2016; Zhao ir kt., 2016). Tarp jų deimantinė kandis Plutella xylostella yra plačiai paplitęs ir kenksmingas lepidopterinis kenkėjas, mintantis kryžmažiedžiais augalais, tokiais kaip žiediniai kopūstai ir kopūstai, todėl patiria didžiulius ekonominius nuostolius. Šiuo metu žemės ūkio valdyme kenkėjų kontrolė naudojant agrochemines medžiagas (pvz., pesticidus) buvo labai sėkminga ir plačiai taikoma, tačiau šis metodas tampa problemiškas dėl galimo aplinkos užterštumo ir grėsmės žmonių sveikatai (Shakeel ir kt., 2017). Alternatyvus požiūris į augalininkystę yra genetiškai modifikuotų pasėlių, pasižyminčių padidintu atsparumu kenkėjams, naudojimas, pavyzdžiui, Bacillus thuringiensis (Jouzani ir kt., 2017) arba kitų heterologinių entomotoksinių baltymų (Douglas, 2018) augalų ekspresijai. Buvo dedamos didelės pastangos siekiant nustatyti naujus P. xylostella kontrolės būdus žemės ūkyje; tačiau veiksmingi genai, natūralūs pesticidai ir atspari gemalo plazma išlieka riboti (Zhou & Jander, 2021). Per nuolatines ginklavimosi varžybas su vabzdžių kenkėjais augalai išvystė įvairius gebėjimus kovoti su vabzdžių atakomis. Atitinkamai augalai sintezuoja apsauginių metabolitų masyvus, tokius kaip benzoksazinoidai (Handrick ir kt., 2016; Varsani ir kt., 2019), metilbenzoatas (Feng ir Zhang, 2017) ir serotoninas (Lu ir kt., 2018). kenkėjų sužalojimas. Jazmono rūgštis (JA), dar vadinama „žaizdų hormonu“, atlieka pagrindinį vaidmenį įvairiuose su žaizdomis susijusiuose žalos atsakuose, kuriuos sukelia vabzdžių užkrėtimas (Lortzing ir Steppuhn, 2016). Vis daugiau įrodymų rodo, kad JA veikia sinergiškai ir (arba) antagonistiškai su kitais fitohormonais, tokiais kaip salicilo rūgštis (SA) ir etilenas (Costarelli ir kt., 2020; Ma ir kt., 2019). Be tiesioginės gynybos, vabzdžių atakų pažeisti augalai išskiria įvairius lakius junginius, kurie pritraukia natūralius žolėdžių priešus (Gols, 2014). Iš šių sudėtingų lakiųjų mišinių homoterpeno junginiai (3E)-4,8-dimetil-1,3,7-nonatrienas (DMNT) ir (E,E)-4,8,12-trimetil-1,3,7, 11-tridekatetraenas (TMTT) buvo pastebėtas daugelyje augalų rūšių, tokių kaip Arabidopsis (Lee ir kt., 2010; Sohrabi ir kt., 2015), ryžiai (Li ir kt., 2018), kukurūzai (Gouinguené ir kt., 2005). Richter ir kt., 2016) ir medvilnę (Liu ir kt., 2018). Keletas tyrimų taip pat parodė, kad DMNT veikia kaip signalinė molekulė, kuri skatina apsaugą nuo žolėdžių augalų ir augalų komunikacijos metu (Arimura ir kt., 2000; Meents ir kt., 2019). Pavyzdžiui, patyrus žalą dėl kramtomųjų vabzdžių, kai kurios saldžiosios bulvės išskiria DMNT, dėl ko kaimyniniuose saldžiųjų bulvių augaluose sistemiškai sukelia proteazės inhibitoriaus patempimą ir jie tampa nevirškinami vabzdžiams (Meents ir kt., 2019). Panašūs rezultatai buvo pastebėti ir arbatos augalams (Jing ir kt., 2020). Neseniai nustatėme, kad DMNT vaidina svarbų vaidmenį naikinant P. xylostella lervas, nes suardo peritrofinės matricos (PM) barjerą vabzdžių vidurinėje žarnoje (Chen ir kt., 2021).

Aukštesniuose augaluose DMNT ir TMTT biosintezės keliai buvo gerai apibūdinti atliekant atvirkštinę genetiką ir biochemines analizes. Kukurūzuose DMNT ir TMTT susidaro oksidaciniu būdu skaidant (E)-nerolidolį ir (E,E)-geranillinalolį dviem P450 monooksigenazėmis CYP92C5 ir CYP92C6 (Richter ir kt., 2016). Medvilnėje du CYP genai (GhCYP82L1 ir GhCYP82L2) yra atsakingi už (E)-nerolidolo pavertimą DMNT ir (E,E)-geranilo linalolio pavertimą TMTT (Liu ir kt., 2018). Arabidopsis šaknyse DMNT katalizuojamas iš pirmtako C30 triterpeno diolio, kanabidiolio, citochromo P450 monooksigenazės, koduojamos šaknims būdingo geno CYP705A1 (Sohrabi ir kt., 2015). Tyrimas, kuriame mielės buvo naudojamos kaip pavyzdinis organizmas, parodė, kad kanabidiolį iš 2,3-oksidoskvaleno gamina kanabidiolio sintazė PEN1 (Xiang ir kt., 2006), o jos ekspresija sinergiškai susijusi su CYP705A1 (Sohrabi ir kt.). ., 2015). Nepaisant to, pagrindinių genų reguliavimas DMNT biosintezėje iš esmės nežinomas. Šiame tyrime aprašytas RPX1 genas koduoja naują dangtelį surišantį baltymą (CBP), kuris yra eukariotinės iniciacijos faktoriaus 4E (eIF4E) genų šeimos narys. Augaluose eIF4E šeimą sudaro eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E ir nCBP, kurie atlieka esminį vaidmenį inicijuojant nuo dangtelio priklausomą mRNR transliaciją (Rhoads, 2009). eIF4E šeimos nariai yra pagrindiniai recesyvinio atsparumo bulvių virusui Y (PVY) – žalingiausiam bulvių derliui ir kokybei įtakos turinčiam patogenui – šaltiniai, o CRISPR-Cas9 technologijos panaudojimas, nukreiptas į eIF4E1 geną, išplečia Solanum tuberosum bulvių viruso Y atsparumo spektrą. (Lucioli ir kt., 2022). Panašiai CRISPR/Cas9 tarpininkaujantis maniokos eIF4E izoformų nCBP-1 ir nCBP-2 redagavimas sumažina simptomų, kuriuos sukelia maniokos rudos spalvos ruožo liga, sunkumą ir dažnį (Gomez ir kt., 2019). Be to, Arabidopsis tyrimai rodo, kad nCBP trūkumas turi įtakos ribojant augalų virusų judėjimą iš ląstelės į ląstelę (Keima ir kt., 2017). Nepaisant to, nebuvo pranešta apie nCBP funkciją žolėdžių gynyboje. Čia mes naudojame integracinį metodą, kad funkcionaliai apibūdintume Arabidopsis geną RPX1, kuris vaidina svarbų vaidmenį augalų atsparumui P. xylostella. Mūsų rezultatai rodo, kad RPX1 numušimas lemia skirtingai išreikštus genus (DEG) ir junginių kaupimąsi. Vienas iš reguliuojamų genų yra PEN1, kuris yra labai svarbus DMNT biosintezei. Rpx1 mutanto užkrėtimas ir DMNT kaupimasis paveikia P. xylostella PM struktūrą ir sukelia lervų vystymosi defektus bei mirtį. Kiti įrodymai rodo, kad P. xylostella užkrėtimas ir žaizdos sukelia RPX1 baltymų skaidymą, o tai savo ruožtu gali sukelti augalų atsparumą vabzdžiams.

2|MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1|Augalinės medžiagos ir augimo sąlygos

Arabidopsis sėklos buvo užsakytos iš Notingemo Arabidopsis Stock Center (NASC, http://Arabidopsis.info/). Sėklos buvo sterilizuotos paviršiuje, pasėtos į Murashige ir Skoog (MS) terpę ir stratifikuotos 5 laipsnių kampu augimo kameroje trumpos dienos fotoperiodu (8 val. šviesoje, 16 val. tamsoje) 3 dienas. Tada jie buvo perkelti į 22 laipsnius šiltnamyje, ilgos dienos fotoperiodu (16 val. šviesoje, 8 val. tamsoje), normaliai prižiūrint augalus.

2.2|Pasirinkimo (pirmenybė) ir be pasirinkimo eksperimentai ir biologiniai tyrimai

P. xylostella kiaušiniai buvo įsigyti iš Henan Jiyuan Baiyun Company (katė: HJB004, sukurta 2009 m., dauginami moksliniams tyrimams kontroliuojamoje aplinkoje) ir inkubuojami augimo kameroje, nustatytoje 26 laipsnių, 16 val. šviesoje/8 val. tamsoje. Pasirinktiems eksperimentams mes perkėlėme 3 savaičių amžiaus Arabidopsis augalus (atitinkamai aštuonis laukinio tipo ir mutantus) į bandymų bakus, kurie buvo prijungti prie kiekvieno stiklinio mėgintuvėlio galo, o likę eksperimentiniai veiksmai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau ( Chen ir kt., 2021). Buvo naudojamos ketvirtosios stadijos lervos, o į kiekvieną eksperimentinį pakartojimą buvo įtraukta 15 lervų.

Eksperimentui be pasirinkimo 3 savaičių laukinio tipo ir mutantiniai augalai buvo perkelti į atskiras ir pusiau atviras Petri lėkštes, kuriose buvo tiek pat 15 s-instar P. xylostella lervų. Tolesni veiksmai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau (Chen ir kt., 2021).

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

2.3|Atsparių Arabidopsis mutantų prieš P. xylostella atranka

P. xylostalle atsparumo atrankai surinkome 179 Arabidopsis T-DNR įterpimo mutantus. Mutantai buvo auginami MS terpėje ir persodinami į P7 vazonus (dydis: 7 × 7 cm) ilgos dienos augimo sąlygomis (22 laipsniai, 16 h šviesa / 8 h tamsa). Kad išvengtume galimo aplinkos poveikio, vazonus kasdien kilnodavome ir kaitėme. Pradiniam mutantų patikrinimui sukūrėme du pakartojimus, kiekvieną mutantą augindami dviejuose vazonuose, o kaip kontrolę naudodami Col‐0 augalus. Po 2 savaičių augimo po transplantacijos, visiems mutantams buvo atliktas trečiosios stadijos P. xylostella lervų pirmenybės testas, lyginant juos su Col‐0, kaip aprašyta aukščiau. Mutantai, kurių lervos pirmenybės skiriasi nuo Col‐{10}}, buvo laikomi kandidatams atspariais arba jautriais mutantais ir buvo atrinkti tolesniam eksperimentiniam patvirtinimui ir funkciniams tyrimams.

2.4|Plazmidžių konstravimas ir genų transformacija

RPX1pro: RPX1 konstrukcijai RPX1 genomą koduojanti sritis su 1,6 kb seka prieš srovę ir 1 kb seka pasroviui buvo PCR amplifikuota iš genominės DNR, išskirtos iš Col‐0. Surinktas DNR fragmentas buvo klonuotas į pGreenII-0179 vektorių ir transformuotas į rpx1-1 mutantą, naudojant floral dip metodą (Clough & Bent, 1998). Norint sukurti RPX1pro: RPX1‐GFP, RPX1 promotorius (1,6 kb), koduojantis regionas ir 1 kb 3′ netransliuotos sekos buvo PCR amplifikuotos iš Col‐0 genominės DNR. GFP fragmentas buvo amplifikuotas iš plazmidės, turinčios GFP sekas. Šie DNR fragmentai buvo surinkti į pGreenII-0179 vektorių naudojant perpjovimo ir surišimo metodą, o po to transformuoti į rpx1-1 mutantą. 35Spro: RPX1-FLAG konstrukcijai RPX1 koduojančios sekos buvo amplifikuotos PCR iš cDNR, atvirkštinės transkribuotos iš Col-0 mRNR. PGR fragmentas buvo klonuotas į pCambia1300-FLAG vektorių, naudojant infuzijos metodą (Clontech) ir transformuotas į Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SINTAZĖ 1) ir 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Šių genų kodavimo sekos buvo PGR amplifikuotos iš Col‐0 cDNR ir liguotos į vektorių pL-3GNLS. Dirbtinė mikroRNR (amiR), nukreipta į PEN1, buvo sukurta taip, kaip aprašyta anksčiau (Schwab ir kt., 2006), amplifikuota naudojant plazmidę pRS300 kaip šabloną ir surišta į modifikuotą pCambia1300m vektoriaus versiją. Visos pradmenų sekos išvardytos pagalbinėje informacijoje: S1 lentelėje.

2,5|Glutationo s-transferazės (GST) ir citochromo P450 (CYP450) aktyvumo P. xylostella lervose tyrimai

Po to, kai antrosios stadijos P. xylostella lervos buvo šeriamos Col-0 arba rpx1-1 daigais 72 valandas, jos buvo surinktos ir susmulkintos iki smulkių miltelių skystame azote. Tyrimai buvo atlikti naudojant GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, katė: A004) ir CYP450 aktyvumo analizės rinkinius (Beijing Huabaitai Biology Company, kat.: P450), pagal gamintojo instrukcijas. Kiekvienas tyrimas turėjo tris biologinius pakartojimus ir kiekvieną pakartojimą sudarė 30 P. xylostella lervų.

2.6|Smurfų tyrimai

Trijų savaičių Col‐0 arba rpx1‐1 daigai buvo naudojami antros stadijos P. xylostella lervoms šerti. Tyrimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau, su nedideliais pakeitimais (Chen ir kt., 2021). Buvo panaudoti šeši biologiniai pakartojimai, kurių kiekviename buvo 15 P. xylostella lervų.

2.7|Mikroskopinis lervų PM struktūros stebėjimas

Lervų PM struktūros anatominė analizė ir lervos žarnyno parafino skerspjūvio analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau (Chen ir kt., 2021).

2,8|Genų ekspresijos analizė ir transkripto sekos nustatymas (RNA-seq)

Col‐{{0}} ir rpx1‐1 daigai buvo auginami ilgos dienos augimo sąlygomis (16 val. šviesiai, 8 val. tamsoje) 22 laipsnių temperatūroje. Transkripto sekai nustatyti buvo naudojami dviejų savaičių Col‐0 ir rpx1‐1 daigai. Kiekviename mėginyje buvo trys biologiniai pakartojimai. Visa RNR buvo išgauta naudojant RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, katalogo numeris: DP441). Pirmosios krypties cDNR buvo susintetintos atvirkštinės transkripcijos būdu, naudojant One-Step RT sistemą (Takara Bio) pagal gamintojo instrukcijas. qRT-PGR buvo atlikta naudojant specifinius geno pradmenis, išvardytus Pagalbinėje informacijoje: S1 lentelėje, naudojant Roche Light Cycler 48{16}} prietaisą. RNA-seq bibliotekų konstravimas ir seka buvo atlikta naudojant Biomarker (Pekinas, Kinija) Illumina HiSeq platformoje. Galiausiai panaudojome edgeR diferencinės išraiškos analizei atlikti (nustatyta reikšmingo skirtumo riba:|log2foldchange|Didesnis arba lygus 1, p < 0,05). Buvo atlikti trys Col‐0 ir rpx1‐1 biologiniai pakartojimai, o skirtingai išreikšti genai yra išvardyti duomenų rinkinyje S1.

2,9|DMNT ir DMNT-2H ekstrahavimo ir dujų chromatografijos bei masės spektrometrijos (GC-MS) analizė Arabidopsis

DMNT ekstrahavimas ir analizė buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau su nedideliais pakeitimais (Sohrabi ir kt., 2015). Atliekant tyrimus, DMNT ekstrahavimui ir matavimui buvo naudojami 2 g 3 savaičių Arabidopsis sodinukų.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|DMNT paruošimas ir apibūdinimas

DMNT buvo susintetintas, kaip aprašyta anksčiau, su nedideliais pakeitimais (HJ Huang ir Yang, 2007). Trumpai tariant, į 500 ml apvaliadugnę kolbą su teflonu dengta magnetine maišymo juosta buvo įpilta 1 g (6,48 mmol) alilo alkoholio ir 50 ml dichlormetano. Tirpalas buvo intensyviai maišomas ir apdorojamas 3,6 g aktyvaus mangano dioksido, po to kas 2-3 valandas įpilama 1-2 g oksidatoriaus, kol reakcija baigsis. Tada produktas buvo naudojamas norimam junginiui generuoti per vytinimo reakciją. DMNT struktūra ir grynumas buvo patvirtinti 1H branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) ir 13C BMR spektroskopiniais metodais.

2.11|P. xylostella gydymas DMNT

Tyrimai buvo atlikti Petri lėkštelėse, padengtomis skaidriomis plastikinėmis plėvelėmis su daugybe skylių. DMNT buvo praskiestas parafino aliejuje (Sigma-Aldrich) iki norimos dozės (2,5 nmol / L–25 μmol / L) ir įšvirkščiamas į pašarą, kaip aprašyta tekste. Visi tyrimai buvo atlikti šešiais biologiniais pakartojimais, kurių kiekvienas buvo sudarytas iš 15 lervų. Lervų augimas užfiksuotas fotografiniais dokumentais. Pašarai, sušvirkšti tokiu pat kiekiu parafino aliejaus tirpiklio, buvo naudojami kaip kontrolė.

2.12|JA ir SA kiekio matavimas Arabidopsis sodinukuose

Tyrimus atliko Nanjing Convinced-test Technology Company. Dviejų savaičių Col‐{{0}} ir rpx1‐1 daigai buvo užkrėsti 15 s‐instar P. xylostella lervų, o kontrolė buvo neužkrėstų daigų. Ant kiekvieno užkrėstos grupės augalo uždėjome po dvi lervas, kad įsitikintume, jog visi augalai buvo užkrėsti. Po 24 valandų augalų mėginiai buvo paimti ir greitai užšaldyti skystame azote JA ir SA nustatymui. Mėginiai buvo susmulkinti iki smulkių miltelių skystame azote ir ekstrahuoti izopropanolio-vandens-vandenilio chlorido rūgšties ekstrahavimo tirpalu, po to įdedant 8 ul deuteruotos salicilo rūgšties (D-SA) ir dihidrojazmono rūgšties (2HJA) (1 ug). /ml kiekvienas) kaip vidiniai standartai. Tada buvo pridėta dichlormetano ir tirpalas gerai maišomas ant rotatoriaus 3 0 min. Centrifuguojant 13, {{1{{20}}}} aps./min 5 min., buvo gauta apatinė organinė fazė, ji išdžiovinta azotu ir vėl ištirpinta metanolyje (0 .1% skruzdžių rūgšties), tada centrifuguojama esant 13,000 g 10 min. Galiausiai supernatantas buvo filtruojamas per 0,22 μm organinio filtro membraną ir analizuojamas naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją kartu su masės spektrometrija (HPLC‐MS/MS). Visi ekstrahavimo etapai buvo atlikti 4 laipsnių temperatūroje. JA ir SA tapatybės buvo nustatytos remiantis tikslinių medžiagų piko laiku ir atitinkamų jonų masės ir krūvio santykiu (m/z). JA ir SA kiekybinis įvertinimas buvo pritaikytas naudojant tiesinės regresijos lygtį, gautą iš vidinių standartinių kreivių. Vidinio standarto kreivei gauti buvo paruošti SA ir JA etaloniniai tirpalai su 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 ir 200 ng/ml gradientais, naudojant tirpiklį metanolį (0,1 % skruzdžių rūgštį). ir vidiniai etaloniniai tirpalai, kurių galutinė koncentracija yra 20 ng/ml, buvo įtraukti į faktinį sklypą. Tiesiškumo anomalijos buvo pašalintos iš standartinių kreivių lygčių. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|DMNT transportavimo Arabidopsis analizė

DMNT buvo ištirpintas DMSO ir pridėtas į MS terpę be gliukozės. Trijų savaičių Arabidopsis augalai buvo perkelti į mėgintuvėlius, o jų šaknys panardintos į MS terpę su DMNT arba DMSO (kontrolė). Siekiant išvengti užteršimo, mėgintuvėliai buvo padengti dviem parafilmo sluoksniais, o plėvelėje padaryta nedidelė skylutė, per kurią augalų šaknys buvo išdėstytos MS terpėje tolesniam augimui. Po 24 valandų buvo pašalintos apdorotų augalų šaknys ir jų lapai buvo naudojami P. xylostella maitinimui, o tada buvo analizuojamas lervų išgyvenamumas ir jauniklių skaičius. Tas pats eksperimentas buvo pakartotas su auginimo terpe, kurioje kaip kontrolė buvo 2H pažymėtas DMNT arba DMSO. Po 24 valandų inkubacijos lapai buvo surinkti ir apdoroti GC-MS analizei. Siekiant atmesti galimybę, kad DMNT gali išgaruoti iš DMNT terpės į oro dalis ir sukelti užteršimą, kontrolinė grupė buvo sudaryta tokiu pačiu būdu, tačiau augalų šaknys buvo palaidotos drėgna medvilne ir nebuvo panardintos į DMNT terpę. Po 24 valandų oro dalys buvo paimtos tolesniam biologiniam tyrimui arba DMNT aptikimui naudojant GC-MS.

Cistanche tubulosa privalumai- stiprinti imuninę sistemą

2.14|RPX1 baltymų ekstrahavimas ir imunoblotinė analizė Arabidopsis po P. xylostella užkrėtimo ir žaizdų gydymo

Nustatėme dviejų tipų transgeninio RPX1pro gydymo būdus: RPX1‐GFP ir 35Spro: RPX1‐FLAG Arabidopsis sodinukus: P. xylostella užkrėtimas ir žaizdos. Užsikrėtus lervomis, Arabidopsis daigus auginome 2 savaites ir šėrėme antros stadijos lervoms (ant kiekvieno daigelio padėkite bent po vieną lervą), po 15-120 min lervos pašalinamos, o užkrėsti daigai buvo atrinkti ir nuimti. tolesni eksperimentai. Norėdami imituoti žaizdas, mes panaudojome 1 ml švirkšto adatą, kad kiekviename Arabidopsis lape būtų padaryta skylė. Po 15–120 min augimo daigai surenkami.

Norėdami nustatyti, ar P. xylostella užkrėsti augalai gali sukelti RPX1 degradaciją, Col‐0 sodinukus užkrėtėme P. xylostella 15–120 min. ir išbandėme jo įtaką RPX1‐GFP transgeniniuose augaluose. Visi mėginiai buvo susmulkinti iki miltelių skystame azote, o po to vienodi kiekiai užkrėsto ir neužkrėsto Col-0 buvo atskirai sumaišyti su tokiu pat kiekiu RPX1-GFP audinių ir inkubuojami tirpale 4 laipsnių temperatūroje 15 min. Galiausiai mišinys buvo centrifuguotas, o supernatantas buvo atliktas imunoblotingo analize. Western blot analizei visi baltymai buvo ekstrahuoti baltymų ekstrahavimo buferiu [50 mmol/L Tris‐HCl pH8,0, 2,5 mmol/L EDTA pH8,0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL ( t./t.), 10 % glicerolio (v/v), 7 % 2-merkaptoetanolio (v/v), 1 mmol/l PMSF ir 1 × proteinazės inhibitorių kokteilio (Roche)]. Tada baltymų ekstraktas buvo naudojamas PAGE atskyrimui ir imunoblotavimo analizei su antikūnais prieš GFP (Roche, praskiedimas: 1/1000) ir FLAG (Abcam, skiedimas: 1/2000). Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant Tanon 5200 chemiliuminescencinės analizės sistemą.

3|REZULTATAI

3.1|Arabidopsis rpx1 mutantas pagerino atsparumą P. xylostella

Norėdami nustatyti genus, susijusius su P. xylostella atsparumu, surinkome 179 Arabidopsis mutantus ir auginome juos kontroliuojamame šiltnamyje. Praėjus dviem savaitėms po transplantacijos, atlikome trečiosios stadijos P. xylostella lervų pirmenybės testą, reaguodami į kiekvieną mutantą ir laukinio tipo Col‐0. Šiame atrankos eksperimente 15 mutantų parodė skirtingą įtaką lervų pasirinkimui (duomenys nerodomi), ir vienas iš jų buvo pasirinktas šiam tyrimui ir pavadintas rpx1-1 (atsparumas P. xylostella). RPX1 koduoja naują dangtelį surišantį baltymą (nCBP) (Ruud ir kt., 1998). T-DNR įterpimo mutantas buvo SALK_131503, o RPX1 geno ekspresija buvo žymiai sumažinta, palyginti su laukinio tipo Col‐0 (1a pav., Pagalbinė informacija: S1a pav., Pagalbinė informacija: lentelė S1). Netoliese pasodinti rpx1-1 augalai parodė žymiai mažesnį P.xylostella lervų pažeidimo lygį nei laukinio tipo augalai (pagalba: S1b pav.).

1 PAVEIKSLAS Inaktyvuojant RPX1, Arabidopsis sukelia atsparumą Plutella xylostella. a) RPX1 genų struktūra (At5g18110). Oranžinės dėžutės žymi egzonus, o vientisos linijos žymi intronus ir neišverstus regionus. T-DNR įterpimas į SALK_131503, pavadintas rpx1-1, yra ketvirtajame egzone. (b) P. xylostella lervos dažniausiai juda link laukinio tipo Col-0 ir RPX1 komplementacijos linijų (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com), palyginti su rpx1-1. (c) Col‐ palyginimas. 0, rpx1‐1 ir RPX1com lapai užkrėsti P. xylostella. (d) P. xylostella lervas smarkiai paveikė rpx1-1, palyginti su laukinio tipo Col‐0 ir RPX1com linijomis, atsižvelgiant į lervos ūgį, dydį ir spalvą. (e, f) P. xylostella lervos, šeriamos rpx1-1, rodo didesnį mirtingumą (e) ir mažesnį jauniklių atsiradimo dažnį (f), palyginti su laukinio tipo Col‐0 ir RPX1com linijomis. (g, h) P. xylostella lervos, šeriamos rpx1‐1 augalais, padidino glutationo S-transferazės (GST, g) ir citochromo P450 (CYP450, h) aktyvumą, o RPX1com maitinamų lervų aktyvumas nesiskyrė nuo tų 0 kolonoje. (b, e–h) duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem Skirtingos kiekvieno apdorojimo raidės rodo reikšmingą skirtumą (vienpusė dispersijos analizė, n=3 b, g, h, n {{ 36}} e, f).

Norėdami nustatyti mechanizmą, kuriuo grindžiamas rpx1-1 atsparumas P. xylostella užkrėtimui, atlikome pirmenybės ir be pasirinkimo testus. Pirmenybės eksperimentuose P. xylostella lervos buvo dedamos stiklinio mėgintuvėlio centre vienodu atstumu nuo Col‐0 ir rpx1‐1 sodinukų po 10–6{{11} } min, žymiai daugiau lervų susirinko Col-0 pusėje nei rpx1-1 pusėje (1b pav.). Nepasirinkimo eksperimentuose mes atskirai šerėme Col-0 ir rpx1-1 sodinukus P. xylostella lervoms ir pastebėjome, kad Col-0 prarado daugiau lapų audinių nei rpx1-1 mutantas (1c pav.). Norėdami patvirtinti, kad RPX1 buvo pastebėtą atsparumą sukeliantis genas, į rpx1-1 mutantą įtraukėme RPX1 komplementacijos konstrukciją. Šios RPX1 komplementacijos linijos (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1, RPX1com) buvo jautrios P. xylostella užkrėtimui, kaip nustatyta pirmenybės ir nepasirinkimo testais (1b, c pav.), kurie rodo, kad RPX1 yra susijęs su Arabidopsis atsparumu. P. xylostella.

3.2|P. xylostella lervų augimą neigiamai veikia rpx1-1 mutacija

Norėdami ištirti P. xylostella fiziologinį atsaką į šėrimą rpx1‐1 mutantais, apžiūrėjome lervų vystymąsi po šėrimo 3 savaičių Col‐0, rpx1‐1 ir RPX1com linijų augalais. Lervų, maitinamų rpx1-1 augalais, kūno dydis buvo labai pažeistas. Lervų kūno spalva taip pat skyrėsi nuo lervų, šeriamų Col‐0 augalais. Tačiau mes nepastebėjome tokių pokyčių lervose, šeriamose RPX1com sodinukais (1d pav.). Tolesnė fenotipinė analizė parodė, kad P. xylostella lervų, šeriamų rpx1‐1, mirtingumas ir jauniklių skaičius buvo mažesnis nei tų, kurios buvo šeriamos Col‐0 arba RPX1com (1e, f pav.). Be to, lervos, šeriamos rpx1-1, pasižymėjo didesniu GST ir CYP450 fermentiniu aktyvumu, kurie yra organų ar audinių pažeidimo biologiniai žymenys (Cheng ir kt., 2018; Mikstacki ir kt., 2015). Col‐0 ir RPX1com (1g, h pav.), o tai rodo, kad lervos audinys gali būti sužalotas maitinant rpx1‐1.

3.3|P. xylostella lervų vidurinė žarna pažeidžiama po šėrimo rpx1‐1 augalais

Pastebėjome, kad rpx1‐1 maitinamos lervos sunaudojo mažiau augalų audinių ir pagamino daug mažiau išmatų nei tos, kurios buvo šeriamos laukinio tipo Col‐0; todėl iškėlėme hipotezę, kad gali būti paveiktas rpx1‐1 šeriamų lervų virškinimas. Norėdami patikrinti, ar lervų, maitinamų rpx1‐1, žarnyne įvyko nuotėkis, atlikome „Smurf testą“. Lervos, šeriamos laukinio tipo Col‐0 ir RPX1com linijomis, ištuštino dažus ir dažų lervų kūne vizualiai neliko, o rpx1‐1 maitinamos lervos išlaikė daug dažų. vidurinė žarna ir aplinkiniai audiniai, o lervos pasidarė mėlynos (2a pav.). Kiekybinė mėlynųjų („Smurf“) ir normalių („no Smurf“) lervų analizė parodė, kad maitinant rpx1-1 augalus daugiau nei tris kartus pasireiškė „Smurf“ individai, palyginti su tais, kurie buvo šeriami laukinio tipo Col‐{{ 14}} arba RPX1com (2b pav.). Šie rezultatai rodo, kad rpx1-1 maitinimas gali sukelti pažeidimus ir didesnį pralaidumą lervų vidurinėje žarnoje.

3.4|P. xylostella peritrofinė matrica pažeidžiama maitinant rpx1‐1 daigus

Toliau išpjaustėme ir išskyrėme peritrofinę matricą (PM) iš lervų, maitinamų Col‐{{0}}, rpx1‐1 ir RPX1com sodinukais, kad galėtume atlikti struktūrinę analizę stereomikroskopu. Palyginti su lervų, maitinamų Col‐0 ir RPX1com, nepažeistomis ir stambomis PM, lervos, šeriamos rpx1‐1, pasižymėjo pažeistomis savybėmis ir buvo plonos, palaidos ir nenuoseklios (2c–f pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti PM žalos charakteristikas, gavome skersines lervų mėginių dalis. Hematoksilin-eozino (HE) dažymo rezultatai atskleidė, kad lervų, maitinamų Col-0, PM buvo storas ir nepažeistas ir kad tarp PM ir vidurinės žarnos epidermio ląstelių buvo ekperitrofinė erdvė (ES) (2g pav.). Priešingai, PM lervų, maitinamų rpx1‐1, vidurinėje žarnoje buvo labai sutrikęs, o žarnyno turinys buvo arti žarnyno sienelės (ne, 2h pav.). Kai lervos buvo šeriamos RPX1com sodinukais, jų PM ir ES reikšmingai nepasikeitė (2i, j pav.). Šie rezultatai patvirtina, kad RPX1 numušimas pakenkė P. xylostella lervų PM.

3,5|DMNT kiekio kaupimasis rpx1‐1 suteikia atsparumą P. xylostella lervoms

Norėdami ištirti, ar RPX1 numušimas nekeičia Arabidopsis metabolitų formos ir sukelia atsparumą P. xylostella lervoms, palyginome lakiuosius organinius junginius (LOJ), išsiskiriančius iš rpx1‐1 ir laukinio tipo Col‐0 augalų. Keturi LOJ (heksanolis, 3-etil-5metilas, oktansas, 2,6-dimetilas, nonanas, 2,6-dimetilas ir DMNT) buvo skirtingai kaupiami tarp rpx1-1 ir Col-0 (3a pav.). Norėdami toliau išskaidyti rpx1‐1 molekulinį mechanizmą esant P. xylostella atsparumui, atlikome RNR-seq analizę. Palyginti su Col‐0, rpx1‐1 mutantas turėjo 211 skirtingai išreikštų genų (DEG) (pagalbinė informacija: duomenų rinkinys S1). KEGG sodrinimo analizė parodė, kad šie DEG priklausė daugiau nei 20 skirtingiems metabolizmo keliams, įskaitant seskviterpenoidų ir triterpenoidų biosintezę, alfa-linoleno rūgšties metabolizmą ir tirozino metabolizmo kelius (3b pav., Pagalbinė informacija: S2 lentelė). Pažymėtina, kad labiausiai praturtintas kelias buvo seskviterpenoidų ir triterpenoidų biosintezė, kurią sudarė trys DEG: At4g15340, At5g42600 ir At5g48010 (3b paveikslas, pagalbinė informacija: S2a – c paveikslas). Pranešama, kad At4g15340 koduoja PEN1, oksidoskvaleno ciklazę, kuri 2,3-oksidoskvaleną paverčia arabidioliu ir skatina biologiškai aktyvaus DMNT sintezę per CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi ir kt., 2008). At5g42600 koduoja mineralų sintazę 1 (MRN1), kuri yra pagrindinis mineralų biosintezės komponentas. At5g48010 koduoja talanolio sintazę (THAS), fermentą, dalyvaujantį talianolio biosintezėje. Buvo pranešta, kad marneralas ir talianolis dalyvauja palaikant augalų vystymąsi (Field & Osbourn, 2008; Go ir kt., 2012) (pagalba: S3 pav.). Ištyrėme galimą MRN1 ir THAS vaidmenį atsparumui vabzdžiams, tirdami P. xylostella pirmenybę, mirtingumą ir jauniklių skaičių, šerdami juos transgeniniais Arabidopsis daigais, per daug ekspresuojančiais MRN1 (35Spro: MRN1) ir THAS (35Spro: THAS) (palaikomas). Informacija: S4a,b pav. Nebuvo aptiktas reikšmingas skirtumas tarp dviejų transgenų ir laukinio tipo Col‐0 (pagalbinė informacija: S4c – n pav.), o tai rodo, kad rpx1‐1 vabzdžių atsparumas greičiausiai nepriklauso nuo šių dviejų genų.

2 PAVEIKSLAS RPX1 inaktyvacija pažeidžia peritrofinės matricos (PM) struktūrą lervos vidurinėje žarnoje. a) Reprezentatyvūs lervų, maitinamų Col‐0, rpx1‐1 ir RPX1com linijomis, vaizdai, rodantys dažų susilaikymą, kaip rodo jų mėlyna išvaizda, pavyzdžiui, animacinio filmo Smurfas personažas. b) Rezultatų kiekybinis įvertinimas parodytas a punkte. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem; skirtingos raidės rodo reikšmingą skirtumą (vienpusė dispersijos analizė, n=6). (c–f) PM ultrastruktūra lervų, maitinamų Col‐0 (c), rpx1‐1 (d) ir RPX1com linijomis (e, f). Atkreipkite dėmesį, kad lervų, maitinamų Col‐0 ir RPX1com, dalelės yra putlios ir nepažeistos, tačiau lervų, maitinamų rpx1‐1, dalelės yra plonos, gležnos ir kai kuriuose regionuose nepertraukiamos. (g–j) Skersinis pjūvis ir dažymas hematoksilino-eozinu rodo PM pažeidimus iš lervų, maitinamų Col‐0 (g), rpx1‐1 (h) arba RPX1com linijomis (i, j). [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

Terpenoidų biosintezės praturtėjimas atliekant KEGG analizę (3b pav.) ir diferencinis DMNT kaupimasis, aptiktas rpx1‐1 (3a pav.), rodo, kad DMNT gali būti vienas iš junginių, susijusių su augalų atsparumu P. xylostella. Panašiai kaip ir ankstesnėse ataskaitose, kuriose DMNT buvo vos aptiktas atliekant GC‐MS analizę Col‐0 (Liu ir kt., 2018; Sohrabi ir kt., 2015), galėjome aptikti pėdsakus DMNT neužkrėstame Col‐0 (4a, b pav.). Priešingai, DMNT lygis buvo labai praturtintas (~ 8 ng/g) rpx1-1, o RPX1com linijose buvo labai mažas DMNT lygis, panašus į Col‐0 augaluose (4 pav.). Be to, užsikrėtus P. xylostella, DMNT lygis padidėjo (~20 ng/g) rpx1‐1, o tai buvo didesnis nei Col‐0 ir RPX1com linijose (4 pav.). . Mes susintetinome DMNT in vitro naudodami modifikuotą metodą (Chen ir kt., 2021). Remiantis ankstesniais stebėjimais (Chen ir kt., 2021), DMNT slopino P. xylostella augimą, kaip rodo pirmenybė (2,5 μmol/L) ir veiksmingumas be pasirinkimo (0,25–25 μmol/L) ( Pagalbinė informacija: S5a, b pav. Be to, HE dažymo rezultatai atskleidė, kad kontrolinių lervų PM buvo storas ir nepažeistas (pagalbinė informacija: S5c paveikslas), o lervų, 48 valandas apdorotų 2,5 μmol/L DMNT, PM buvo plona ir kai kuriuose regionuose nepertraukiama (pagalba informacija: S5d pav.). Apibendrinant, mūsų išvados rodo, kad rpx1-1 mutacija sukelia DMNT kaupimąsi, o tai prisideda prie P. xylostella lervų žudymo Arabidopsis. JA ir SA yra antriniai augalų metabolitai, glaudžiai susiję su biotiniu stresu. Norėdami nustatyti, ar šios medžiagos prisideda prie rpx1‐1 atsparumo vabzdžiams, patikrinome JA ir SA lygius Col‐0 ir rpx1‐1 prieš ir po užkrėtimo P. xylostella. Negydomomis sąlygomis reikšmingo JA ir SA kiekio skirtumo tarp rpx1‐1 ir Col‐0 augalų nebuvo (pagalba: S6 pav.), o abiejų hormonų lygiai reikšmingai padidėjo praėjus 24 val. po užkrėtimo P. xylostella. . Pažymėtina, kad po užkrėtimo SA kiekis buvo žymiai mažesnis rpx1‐1, palyginti su Col‐0, tuo tarpu JA kiekis rpx1‐1 buvo daug didesnis nei Col‐0 (pagalba: S6 pav.).

3 PAVEIKSLAS Lakiųjų junginių ir genų ekspresijos, skirtingai praturtintų tarp Col‐0 ir rpx1‐1, palyginimas. (a) Skirtingai praturtinti lakieji junginiai Col-0 ir rpx1-1 buvo aptikti dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS) metodu. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem; žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą (*p < 0.05, **p < 0.01, dvipusis nesuporuotas t-testas). b) Col‐0 ir rpx1‐1 transkriptominė analizė. KEGG analizė apie kelio praturtėjimą iš skirtingai išreikštų genų tarp Col-0 ir rpx1-1 mutanto. Vienas praturtintas kelias (raudona rodyklė) yra susijęs su seskviterpenoidų ir triterpenoidų biosinteze ir susideda iš trijų genų, kaip parodyta paveikslėlyje. [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

3.6|RPX1 reguliuoja DMNT kaupimąsi priklausomai nuo PEN1

Norėdami ištirti PEN1 indėlį į rpx1-1 reguliuojamą DMNT kaupimąsi, sukūrėme konstrukciją, kurioje yra dirbtinė miRNR (PEN1amiR), ir pavertėme ją rpx1-1 mutantais. Taip pat sukūrėme PEN1 pernelyg didelės raiškos konstrukciją, kuri buvo transformuota į Col‐0 (35pro: PEN1/Col‐{{10}}). Genų ekspresijos analizė parodė, kad PEN1 buvo numuštas (4-7 kartus) PEN1amiR/rpx1-1, palyginti su rpx1-1, ir buvo per daug išreikštas (~2,5 karto) 35Spro: PEN1, palyginti su Col‐0 (5a pav.). Šiose transgeninėse linijose RPX1 ekspresijai neturėjo įtakos PEN1 numušimas ar per didelė ekspresija (5b pav.). Užsikrėtus P. xylostella 6–24 valandas, PEN1 ekspresija buvo žymiai padidinta Col‐0 ir rpx1‐1, o daug didesnė PEN1 ekspresija buvo pasiekta rpx1‐1 po 24 valandų užkrėtimo (5c pav.). . Tada išmatavome DMNT turinį Col‐0, rpx1‐1, PEN1amiR/rpx1‐1 ir 35Spro: PEN1/Col‐{{50}}. Be P. xylostella užkrėtimo, rpx1-1 gamino didesnį DMNT kiekį nei Col‐0 (5d, e, f, k, l pav.) ir kai PEN1 buvo numuštas dirbtine mikroRNR rpx1‐1 (PEN1amiR). /rpx1-1), DMNT lygis buvo sumažintas, o jų lygis buvo daug mažesnis nei rpx1-1 (5d, g, h, m, n pav.). Užsikrėtus lervoms, DMNT lygis Col-0 ir rpx1-1 sodinukuose buvo žymiai padidintas, tačiau PEN1amiR/rpx1-1 sodinukuose DMNT lygis negalėjo būti sukeltas ir buvo daug mažesnis nei rpx1-1 (5d pav., g, h, m, n), o tai rodo, kad PEN1 gali atlikti svarbų vaidmenį RPX1 reguliuojamoje DMNT biosintezėje, kaip parodyta pagalbinėje informacijoje: S3 paveikslas. Atsižvelgiant į tai, DMNT buvo labai sukauptas 35Spro: PEN1/Col‐0 sodinukuose (5d pav., i, j, o, p).

4 PAVEIKSLAS RPX1 praradimas padidina dimetil-1,3,7-nonatrieno (DMNT) kaupimąsi. a) DMNT dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS) analizė Col‐{5}}, rpx1‐1 ir RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1) linijose. DMNT standartas rodomas apačioje. (b) DMNT bendroji jonų chromatografija (TIC), gauta iš Col-0, rpx1-1 ir RPX1com. c) DMNT kiekis padidėja rpx1-1 mutante, bet grįžta į laukinio tipo lygį RPX1com transgeniniuose augaluose. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem; skirtingos raidės rodo reikšmingą skirtumą (vienpusė dispersijos analizė, n=3). [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

3.7|PEN1 prisideda prie P. xylostella žudymo rpx1-1

Atsižvelgdami į pastebėjimą, kad PEN1 numušimas gali susilpninti DMNT kaupimąsi, sukeltą RPX1 inaktyvacijos (5 pav.), Atlikome PEN1 numušimo ir per didelės transgeninės Arabidopsis ekspresijos biologinius tyrimus, kad parodytume jo biologinį vaidmenį. Mes nustatėme, kad P. xylostella lervos nerodė pirmenybės amiR‐PEN1/rpx1‐1 augalams, palyginti su Col‐0 (pagalbinė informacija: S7 pav.). Tuo tarpu P. xylostella lervų, šeriamų PEN1‐amiR/rpx1‐1, mirtingumas ir jauniklių skaičius didesnis nei rpx1‐1, o lervų, šeriamų 35Spro: PEN1/Col‐0, mirtingumas ir mažesnis. normos nei maitinamos Col‐0 (6a, b pav.). Remiantis šiais rezultatais, tolesni „Smurf testas“ ir transekcijos eksperimentai parodė, kad PEN1-amiR/rpx1-1 žarnos ir PM buvo normalios ir nepažeistos, palyginti su lervomis, maitinamomis rpx1-1 (6c, d, g, h pav.). ir per didelė PEN1 ekspresija padarė didelę žalą P. xylostella lervų vidurinei žarnai ir PM (6c, d, i, j pav.). Šie rezultatai rodo, kad PEN1 numušimas gali slopinti neigiamą poveikį lervų augimui, kurį sukelia RPX1 inaktyvacija, todėl vaidina svarbų vaidmenį rpx1-1-sukeltame toksiškame įtakoje P. xylostella lervoms.

3,8|DMNT transportuoja Arabidopsis iš šaknų į oro dalis 

Pranešama, kad PEN1 daugiausia išreiškiamas Arabidopsis šaknyse (AC Huang ir kt., 2019; Sohrabi ir kt., 2015) (pagalba: S8a paveikslas), o tai skiriasi nuo rezultatų, kuriuos parodė rpx1-1 antenos dalys. toksiškumas P. xylostella, priklausomas nuo PEN1 (6 pav.). Todėl suformulavome alternatyvią hipotezę: augalai DMNT sintetina daugiausia šaknyse ir perneša į oro dalis, kur skatina atsparumą vabzdžiams. Norėdami patikrinti šią hipotezę, atlikome du DMNT transportavimo tyrimus. Pirmajame tyrime (7a pav.) 3–3-savaičių senumo Arabidopsis sodinukų šaknis inkubavome skystoje augalų auginimo terpėje, turinčioje 2,5 μmol/L DMNT, naudodami DMSO kaip kontrolę. Po 24 valandų kultivavimo iškirpome Arabidopsis lapus ir pasiūlėme juos P. xylostella lervoms. Palyginti su DMSO kontrole, DMNT apdorotų augalų lapai sukėlė žymiai didesnį lervų mirtingumą ir mažesnį jauniklių skaičių nei kontrolinis (7b, c pav.). Antrajame eksperimente, kurio tikslas buvo gauti tolesnį nepriklausomą DMNT transportavimo patvirtinimą, DMNT pažymėjome 2 H ir į skystą augalų auginimo terpę įdėjome DMNT‐ 2 H. Po 24 valandų inkubacijos DMNT‐2H buvo labai praturtintas lapuose (7d – i pav.). Siekdami atmesti galimybę, kad DMNT gali išgaruoti iš skystos auginimo terpės į orą ir užteršti augalų oro dalis, nustatėme lygiagrečią kontrolę, kuri buvo atlikta taip pat, kaip 7a paveiksle, išskyrus tai, kad Arabidopsis šaknys nebuvo panardintos į skystį. augimo terpė. Rezultatai parodė, kad augalų oro dalyse DMNT‐ 2 H nebuvo aptikta (pagalbinė informacija: S8b, c pav.). Taigi, mes siūlome, kad DMNT iš šaknų, kur jis gaminamas, persikeltų į Arabidopsis lapus, kur sukelia kenkėjų mirtį.

5 PAVEIKSLAS PEN1 vaidina svarbų vaidmenį dimetil-1,3,7-nonatrieno (DMNT) kaupimuisi rpx1-1. (a) PEN1 ekspresijos analizė Col‐0, rpx1‐1, PEN1 numušimas rpx1‐1 fone (PEN1‐amiR/rpx1‐1) ir PEN1 ekspresija (35Spro:PEN1/Col‐{{2{{) 22}}}}) eilutės. (b) RPX1 išraiška Col‐{{30}}, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 ir 35Spro:PEN1/Col‐0. (c) PEN1 ekspresiją sukelia Plutella xylostella užkrėtimas Col‐0 ir rpx1‐1. (d) DMNT kaupimosi tarp Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 ir 35Spro:PEN1/Col‐0 palyginimas. (e–j) lakiųjų medžiagų, išmetamų iš Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (GC-MS) analizė ir 35Spro: PEN1/ Col‐0 (i, j) linijos. (k–p) DMNT TIC, užfiksuotas iš Col‐0 (k), rpx1‐1 (l), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (m, n) ir 35Spro: PEN1/Col‐0 (o, p) linijų , atitinkančius (e–j) duomenis. (a–d) duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem; skirtingos raidės rodo reikšmingą skirtumą (vienpusė dispersijos analizė, n=3). [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

3,9|RPX1 yra suardomas dėl P. xylostella užkrėtimo ir žaizdų gydymo

Mes parodėme, kad PEN1 ekspresija buvo padidinta rpx1-1 ir Arabidopsis sodinukuose, užkrėstuose P. xylostella lervomis (5a, c pav.), todėl padidėja tikimybė, kad RPX1 taip pat gali reaguoti į lervų užkrėtimą. Norėdami patvirtinti šią prognozę, ištyrėme galimą RPX1 atsaką į P. xylostella užkrėtimą. Genų ekspresijos analizė parodė, kad RPX1 buvo išreikštas skirtinguose audiniuose (pagalbinė informacija: S9a paveikslas), tačiau neturėjo reikšmingo atsako į 6–24 valandų lervų užkrėtimą (pagalba: S9b pav.). Todėl mes patikrinome RPX1 baltymų lygį RPX1pro: RPX1-GFP transgeniniuose augaluose, atlikdami imunoblotingą. Rezultatai parodė, kad be lervų užkrėtimo RPX1-GFP buvo stabilus per 0‐12{{40}} min.; priešingai, 15 minučių užsikrėtus lervomis, RPX1-GFP pradėjo irti; po 120 min., RPX1-GFP baltymas nuolat mažėjo iki maždaug 6 % pradžios laiko taško (8a pav., Pagalbinė informacija: S10a pav.). Kaip kontrolė, Arabidopsis sodinukuose, kuriuose yra GFP transgeno, GFP buvo gana stabilus po lervų užkrėtimo (8b pav.). Norėdami atmesti galimą GFP žymos įtaką RPX1 stabilumui, sukūrėme transgeninius RPX1 augalus su FLAG žyma (35Spro: RPX1-FLAG), kad galėtume atlikti lervų užkrėtimo eksperimentus, kurie parodė nuoseklius rezultatus, kad RPX1-FLAG taip pat gali suardyti lervos. užkrėtimas, panašus į RPX1-GFP (8c pav.). Vabzdžių užkrėtimas dažnai sukelia augalų žaizdas, o fizinė žala gali iš dalies imituoti žolėdžių vabzdžių maitinimosi procesą. Norėdami parodyti, ar sužalojimas gali sukelti RPX1 degradaciją, adata padarėme skyles augalų lapuose, kad imituotų žaizdas, ir nustatėme, kad RPX1-GFP suskaidė po 30 min. gydymo (8d pav., Pagalbinė informacija: S10b pav.). Kad geriau suprastume RPX1 degradacijos priežastį užkrėtus P. xylostella, RPX1-GFP transgeninių augalų audinius kartu tirpale 15 min inkubavome su Col-0, kuris buvo užkrėstas P. xylostella 15–120 min. arba Col-0 audinius be užkrėtimo. Imunoblotavimo analizė parodė, kad RPX1‐GFP lygis mėginiuose, inkubuotuose su iš anksto užkrėstu Col‐0, buvo daug mažesnis nei tų, kurių Col‐0 buvo neužkrėstas (8e pav.), o tai rodo, kad P. xylostella užkrėtimas sukėlė kai kuriuos Col‐0 veiksnius ar signalus. tai gali sukelti RPX1 degradaciją.

3.10|rpx1-1 mutacija suteikia pranašumą augalų vystymuisi ir dauginimuisi

Bendras žolėdžiams būdingų gynybinių reakcijų bruožas yra kompromisas tarp atsparumo kenkėjams ir augalų augimo bei dauginimosi (Li ir kt., 2018). Norėdami nustatyti, ar RPX1 lokuso genotipui taikomi tokie kompromisai, palyginome Col‐{{10}} ir rpx1‐1 mutantų sėklų gamybą. Nesant P. xylostella užkrėtimo, sėklų derlius iš vieno augalo buvo panašus tarp dviejų genotipų (pagalbinė informacija: S11 pav.). Priešingai, 3 savaičių amžiaus rpx1‐1 ir Col‐{17}} augalus veikiant 15 s-instar P. xylostella užkrėtimui tik 72 valandas, galutinis Col‐0 sėklų derlius sumažėjo tris kartus, o sėklų derlius rpx1-1 reikšmingai nepaveikė. Be to, RPX1com sėklų derlius buvo panašus į Col‐0, bet daug mažesnis nei rpx1‐1, o tai rodo, kad RPX1 inaktyvavimas suteikia pranašumą sėklų auginimui užkrėtus lervomis (pagalba: S11 pav.). Taip pat įvertinome 35Spro: PEN1 transgeninio Arabidopsis sėklų gamybą ir pastebėjome, kad per didelė PEN1 ekspresija padidino sėklų derlių tiek lervų užkrėstomis, tiek neužkrėstomis sąlygomis (pagalba: S11 pav.). Šie rezultatai rodo, kad rpx1-1 mutacija ir didesnė PEN1 ekspresija suteikia atsparumą P. xylostella, nesant tipiškai susijusio augimo kompromiso, išryškinant RPX1 ir PEN1 potencialą molekulinėse veisimo programose, kuriomis siekiama pagerinti pasėlių gamybą.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

4|DISKUSIJA

Kenkėjai smarkiai sumažina agronominį derlių ir kokybę, todėl augalų apsauga yra prioritetinis ir ilgalaikis ūkininkų ir selekcininkų tikslas. Šiame tyrime mes nustatėme Arabidopsis mutantą rpx1‐1, kuris parodė didelį atsparumą P. xylostella, svarbiam lepidopteriniam pasėlių kenkėjui. Mūsų analizė atskleidė, kad rpx1-1 mutacija padidino PEN1 transkripto lygį, DMNT kaupimąsi ir pagerino augalų atsparumą kenkėjams. Mes taip pat parodėme, kad RPX1 baltymas gali būti suskaidytas dėl lervų užkrėtimo ir žaizdų gydymo.

6 PAVEIKSLAS PEN1 prisideda prie didesnio rpx1‐1 atsparumo Plutella xylostella. (a, b) PEN1‐amiR transgenas žymiai sumažina rpx1‐1 atsparumą P. xylostella užkrėtimui, o 35Spro: PEN1 sustiprina atsparumo efektą, kaip rodo P. xylostella lervų mirtingumas (a) ir jauniklių atsiradimo (b) rodikliai. . (c) Reprezentatyvūs lervų, maitinamų Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 ir 35Spro, vaizdai: PEN1 daigai rodo dažų susilaikymą, kaip rodo jų mėlyna išvaizda, kaip Smurfų animacinis filmas. charakteris. d) c punkte nurodytų vaizdų kiekybinio įvertinimo rezultatai. (e–j) Skersinis pjūvis ir dažymas hematoksilineozinu rodo PM pažeidimus iš lervų, maitinamų Col‐0 (e), rpx1‐1 (f), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (g, h) ir 35Spro: PEN1 sodinukai (i, j). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem; skirtingos raidės kiekvieno gydymo metu rodo reikšmingą (a, b, d) skirtumą (vienpusė dispersijos analizė, n=6). [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

Atliekant testus be pasirinkimo, rpx1-1 mutantas parodė didelį atsparumą P. xylostella užkrėtimui (1c pav.). Ir atvirkščiai, P. xylostella lervos, maitinamos rpx1‐1 augalais, parodė sunkius neigiamus vystymosi sutrikimus (1d, e pav.). Šie fenotipai yra priskiriami RPX1 inaktyvacijai, nes RPX1 komplementacijos linijos (RPX1com) yra tokios pat jautrios kaip laukinio tipo Col‐0 (1c–e pav.), o tai patvirtina išvadą, kad RPX1 yra susijęs su atsparumu kenkėjams. Be lervų žudymo, rpx1-1 mutantas taip pat turėjo ilgalaikį poveikį lervų vystymuisi, įskaitant lėliavimą (1f pav.), todėl sumažėjo kenkėjo dauginimasis.

7 PAVEIKSLAS Dimetil-1,3,7-nonatrienas (DMNT) pernešamas iš Arabidopsis šaknų į lapus. a ) DMNT transportavimo tyrimo, naudojant Arabidopsis sodinukus, iliustracija. DMNT buvo ištirpintas Murashige ir Skoog skystoje terpėje. Po 24-valandos kultivavimo šaknys buvo išpjautos, o lapai buvo naudojami Plutella xylostella lervoms šerti, siekiant įvertinti mirtingumą ir jauniklių skaičių. (b, c) DMNT, pernešamas iš šaknų į lapus, lemia didesnį P. xylostella lervų mirtingumą (b) ir mažesnį jauniklių atsiradimo (c) skaičių. (d–f) 2 H pažymėtas DMNT (DMNT‐ 2 H) transportuojamas nuo šaknų iki lapų. DMNT-2H buvo ištirpintas skystoje MS terpėje, kaip nurodyta (a), 24 valandas, o tada lapai buvo nuimami GC-MS analizei (e). DMSO buvo naudojamas kaip kontrolė (d). DMNT‐ 2 H standartas parodytas kaip nuoroda (f). (g–i) DMNT‐2H TIC, gautas atliekant transportavimo tyrimus, parodytus (d–f). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem, (b, c) n=6, p-reikšmės rodomos šalia histogramos stulpelių, kad būtų rodomas reikšmingas skirtumas (dviejų uodegų nesuporuotas t-testas). Atkreipkite dėmesį, kad daugiau transportavimo tyrimų valdiklių yra pagalbinėje informacijoje: S8 pav. [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

Be to, pirmenybės testai parodė, kad laukinio tipo Col‐{{0}} ir rpx1‐1 mutantai gali išskirti skirtingus lakiuosius junginius; vienas iš jų yra DMNT, kuris veiksmingai atbaido kenkėjus (1b, 3a pav., Pagalbinė informacija: S5a pav.). Remdamiesi aukščiau pateiktais rezultatais, siūlome, kad DMNT kaupimasis rpx1‐1 yra viena iš apsinuodijimo vabzdžiais priežasčių. Buvo pranešta, kad JA ir SA signalizacijos keliai yra susiję su atsparumu vabzdžiams (Costarelli ir kt., 2020; Lortzing ir Steppuhn, 2016). Šiame tyrime po 24 valandų šėrimo vabzdžiais JA ir SA kiekis tiek Col‐0, tiek rpx1‐1 mutantuose padidėjo, o SA kiekio padidėjimas rpx1‐1 buvo žymiai mažesnis nei Col‐0. JA kiekio padidėjimas buvo daug didesnis (pagalba: S6 pav.), o tai rodo, kad JA ir SA taip pat gali atlikti svarbų vaidmenį rpx1‐1 atsparumui P. xylostella. Todėl siūlome, kad tiek tiesioginis, tiek netiesioginis rpx1‐1 poveikis padidintų Arabidopsis atsparumą vabzdžiams.

8 PAVEIKSLAS RPX1 baltymų degradaciją sukelia Plutella xylostella užkrėtimas ir žaizdų gydymas. (a) RPX1-GFP iš RPX1pro: RPX1-GFP transgeniniai augalai degraduoja užkrėtus P. xylostella 15-12{19}} min. (b) Kaip kontrolė pagal a punktą, pati GFP iš 35Spro: GFP transgeniniai augalai nedegraduoja užkrėtus lervomis. c) RPX1 vėliavėlė iš 35Spro: RPX1 vėliavėle esantys transgeniniai augalai suyra nuo lervų užkrėtimo. (d) RPX1-GFP iš RPX1pro: RPX1-GFP transgeniniai augalai suardomi gydant žaizdą 15–120 min. (e) RPX1-GFP iš RPX1pro: RPX1-GFP transgeniniai augalai suyra, kai audiniai yra inkubuojami tirpale su audiniais iš Col-0 augalų, kurie buvo užkrėsti P. xylostella 15-120 min. Vertės, esančios žemiau imuninio blotingo juostelių, rodo santykinį baltymų gausą, įvertintą naudojant ImageJ. Visi šie eksperimentai buvo pakartoti mažiausiai tris kartus ir pateikiami reprezentatyvūs rezultatai. Daugiau eksperimentinių duomenų su nepriklausomomis transgeninėmis linijomis parodyta pagalbinėje informacijoje: S10 pav. [Spalvotą figūrą galite peržiūrėti adresu wileyonlinelibrary.com]

Pateikiame keletą įrodymų, parodančių, kaip PEN{{0}}tarpininkaujantis DMNT kaupimasis prisideda prie RPX1 funkcijų, susijusių su augalų atsparumu P. xylostella. PEN1, pagrindinis genas, priklausantis seskviterpenoidų ir triterpenoidų biosintezės keliui, buvo nustatytas atlikus rpx1-1 mutanto RNR-seq duomenų KEGG analizę (3b pav.), Suteikdamas ryšį tarp RPX1, PEN1 ir DMNT (Sohrabi ir kt. , 2015). Kad DMNT yra vienas iš priežastinių junginių, naikinančių kenkėjų lervas, DMNT susikaupė daugiau rpx1‐1 mutantuose nei Col‐0 (3a pav.), tačiau RPX1com linijų lygis buvo pakeistas į Col‐0 ( 4a–c pav.). Be to, chemiškai susintetintas DMNT gali atbaidyti ir nužudyti P. xylostella lervas (pagalba: S5a, b pav.), o tai atitinka rpx1‐1 rezultatus (1b, e pav.). Be to, transgeniniai augalai, per daug ekspresuojantys PEN1, pagamino daugiau nei keturis kartus daugiau nei DMNT Col-0 ir suteikė panašų atsparumą P. xylostella kaip rpx1-1 (5d, i, j, o, p ir 6 paveikslai).

Svarbu tai, kad sumažinus PEN1 transkripto lygį rpx1‐1, blokuojama DMNT biosintezė (5d, g, h, m, n pav.) ir sušvelninamas P. xylostella lervų, kurios yra jautrios P. xylostella užkrėtimui, naikinantis poveikis (6a, b pav. ). Šie bendri rezultatai rodo, kad PEN1 mutacija gali slopinti RPX1 inaktyvavimo funkciją atsparumui kenkėjams. RPX1 pažeidimas sukelia didesnį PEN1 gausumą (5a pav.), Vis dėlto, kaip tiksliai RPX1 reguliuoja PEN1 ir tarpininkauja DMNT biosintezei, reikia atlikti tolesnius tyrimus. Kadangi prognozuojama, kad RPX1 yra naujas dangtelį surišantis baltymas, priklausantis eIF4E šeimai (Rhoads, 2009; Ruud ir kt., 1998), gali būti, kad RPX1 gali paveikti PEN1, paveikdamas jo mRNR stabilumą arba baltymų transliacijos efektyvumą, o tai bus svarbus veiksnys. tema būsimame tyrime. Be to, reikia pažymėti, kad P. xylostella užkrėtimas rpx1-1 mutante (5d pav.) vis tiek gali sukelti DMNT lygį iki aukštesnio lygio, o tai rodo, kad gali būti keletas kitų DMNT kaupimąsi reguliuojančių būdų, nepriklausančių nuo RPX1. DMNT buvo aptiktas daugelyje augalų rūšių, tokių kaip Arabidopsis (Sohrabi ir kt., 2015), medvilnė (Liu ir kt., 2018) ir kukurūzai (Richter ir kt., 2016). Be to, ji suteikia netiesioginę apsaugą nuo žolėdžių kenkėjų, pritraukdama plėšrūnus, leisdama augalams pašalinti kenkėjų grėsmes (Kappers ir kt., 2005; Lee ir kt., 2010; Li ir kt., 2018). Neseniai pranešėme, kad jis gali atbaidyti ir nužudyti P. xylostella lervas, pažeisdamas PM lervos vidurinėje žarnoje (Chen ir kt., 2021). Čia mes nustatėme, kad PM struktūra gali būti labai pažeista, kai lervos buvo šeriamos rpx1‐1 arba PEN1 per daug ekspresuojančiais sodinukais (2c – j ir 6i, j paveikslai). Šie rezultatai atitinka anksčiau aprašytų DMNT eksperimentų (Chen ir kt., 2021) išvadas, dar kartą patvirtindami pasiūlymą, kad DMNT kaupimasis rpx1‐1 gali būti vienas iš veiksnių, prisidedančių prie kenkėjų atbaidymo ir mirties. RPX1 priklauso eIF4E genų šeimai (Rhoads, 2009) ir dalyvauja augalų virusų judėjime iš ląstelės į ląstelę (Keima ir kt., 2017). Tačiau ar DMNT kaupimasis susijęs su augalų atsparumu virusams, lieka neaišku. PEN1 yra konkrečiai išreikštas Arabidopsis šaknyse, kur katalizuoja DMNT biosintezę (Sohrabi ir kt., 2015).

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Šiame tyrime nuosekliai nustatėme aukštą PEN1 ekspresiją šaknyse ir labai mažą ekspresiją lapuose (pagalbinė informacija: S8a pav.). Pastebėjome, kad rpx1‐1 mutanto lapai buvo toksiški P. xylostella lervoms (1 pav.), o tai rodo, kad DMNT kaupimasis ir su tuo susijęs kenkėjų atsparumas lapuose negali būti tiesiog paaiškintas maža PEN1 ekspresija šiuose audiniuose. Reikšmingai, mes nustatėme, kad DMNT gali būti transportuojamas iš augalų šaknų į oro dalis, kaip rodo DMNT transportavimo tyrimai ir GC-MS analizė lapų ekstraktų iš augalų, inkubuotų su DMNT-2H šaknyse (7 pav.). Kaip šis junginys pernešamas augaluose, neaišku, ir tai gali būti tolesnio tyrimo tema. Augalai įvairiais būdais gali toleruoti vabzdžių atakas ir su jais kovoti. Čia, atlikdami RPX1pro: RPX1-GFP ir 35Spro: RPX1-FLAG transgeninių augalų imunoblotavimo analizę, nustatėme, kad užkrėtus P. xylostella RPX1 baltymas gali greitai suirti (8a, c paveikslas, pagalbinė informacija: S10a pav.), tuo tarpu , mRNR ekspresijos lygiu RPX1 liko nepakitęs (pagalbinė informacija: S9b pav.). Šiuo metu lieka neaišku, kaip skaidomas RPX1 baltymas, tačiau mūsų duomenys pirmiausia rodo, kad baltymų skilimo mechanizmas gali būti susijęs su sužeidimo signalizacijos keliais (8d pav., Pagalbinė informacija: S10b pav.).

Be to, P. xylostella iš anksto užkrėstas Col-0 sukėlė RPX1-GFP degradaciją skirtinguose augaluose (8e pav.), o tai rodo, kad P. xylostella užkrėtimas augaluose gali sukelti signalų kaupimąsi, o tai savo ruožtu gali sukelti RPX1 degradacija. Ateityje bus įdomu išsiaiškinti signalų tapatybę. Ši RPX1 skilimo savybė yra svarbi augalams, todėl gali kauptis DMNT ir greitai reaguoti į kenkėjų žalą (pagalba: S3 pav.). Padidėjęs augalų atsparumas kenkėjams dažnai nukenčia nuo tinkamumo. Pastebėjimas, kad rpx1-1 mutacija padidina atsparumą (1 pav.) ir didesnę sėklų gamybą (pagalbinė informacija: S11 pav.) Arabidopsis be didelių kompromisų, yra daug žadantis būdas inžineriniams augalams, turintiems didesnį atsparumą kenkėjams. Pavyzdžiui, genomo redagavimas naudojant CRISPR‐Cas9 yra galingas pasėlių gerinimo įrankis (Yang ir kt., 2017), leidžiantis įvesti mutacijas RPX1 ir potencialiai išplėsti jo taikymą įvairiems augalams.

NUORODOS

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) Herbivory-induced volatiles Lima pupelių lapuose sukelia gynybinius genus. Gamta, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. ir kt. (2021) Lakusis DMNT tiesiogiai apsaugo augalus nuo Plutella xylostella, suardydamas peritrofinės matricos barjerą vabzdžių vidurinėje žarnoje. eLife, 10, e63938.

Cheng, X., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, H., Mao, T. ir kt. (2018) Šilko liaukų pažeidimas ir transkripcijos atsakas į detoksikuojančius su fermentais susijusius Bombyx mori genus veikiant foksimui. Chemosphere, 209, 964–971.

Clough, SJ ir Bent, AF (1998) Gėlių panardinimas: supaprastintas metodas Arabidopsis thaliana transformacijai, kurią sukelia agrobakterijos. Augalų žurnalas, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. ir kt. (2020) Salicilo rūgštis, kurią sukelia žolėdžių šėrimas, antagonizuoja jazmono rūgšties sukeltą augalų apsaugą nuo vabzdžių atakų. Plant Signaling & Behavior, 15, e1704517.

Douglas, AE (2018) Strategijos, kaip padidinti pasėlių atsparumą vabzdžių kenkėjams. Kasmetinė augalų biologijos apžvalga, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) Gėlių kvapas, metilbenzoatas, yra veiksmingas žalias pesticidas. Mokslinės ataskaitos, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Metabolinis diversifikavimas nepriklausomas operono tipo genų grupių surinkimas skirtinguose augaluose. Mokslas, 320, 543–547.

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK ir kt. (2012) Mineralinės sintazės, kuri yra labai svarbi Arabidopsis augimui ir vystymuisi, nustatymas. Augalų žurnalas, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Tiesioginė ir netiesioginė cheminė apsauga nuo vabzdžių daugiatrofinėje sistemoje. Plant, Cell & Environment, 37, 1741–1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K. ir kt. (2019) Vienalaikis CRISPR/Cas9 tarpininkaujantis maniokos eIF4E izoformų nCBP-1 ir nCBP-2 redagavimas sumažina maniokos rudųjų dryžių ligos simptomų sunkumą ir dažnį. Augalų biotechnologijos žurnalas, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA ir Turlings, TCJ (2005) Trijų parazitinių vapsvų anteninis elektrofiziologinis atsakas į vikšrų sukeltas lakiąsias medžiagas iš kukurūzų (Zea mays), medvilnės (Gossypium herbaceum) ir karvės žirnių (Vigna unguiculata). Journal of Chemical Ecology, 31, 1023–1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. ir kt. (2016) 8-O-metilintų benzoksazinoidų gynybinių junginių biosintezė kukurūzuose. Augalų ląstelė, 28, 1682–1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. ir kt. (2019) Specializuotas metabolinis tinklas selektyviai moduliuoja Arabidopsis šaknų mikrobiotą. Mokslas, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Moenocinolio ir jo analogų sintezė naudojant BT-sulfoną Julia-Kocienski olefinavime. Tetraedro laiškai, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. ir kt. (2020) Žolėdžių sukeltas DMNT, katalizuojamas CYP82D47, vaidina svarbų vaidmenį skatinant nuo JA priklausomą žolėdžių atsparumą kaimyniniuose arbatos augaluose. Plant, Cell & Environment, 44, 1178–1191.

Johnson, SN & Züst, T. (2018) Klimato kaita ir vabzdžių kenkėjai: pasipriešinimas nėra beprasmis? Augalų mokslo tendencijos, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: sėkmingas insekticidas, turintis naujų aplinkos savybių ir naujienų. Taikomoji mikrobiologija ir biotechnologija, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Terpenoidų metabolizmo genetinė inžinerija pritraukia asmens sargybinius į Arabidopsis. Mokslas, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara‐Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N. ir kt. (2017) eIF4E izoformos nCBP trūkumas riboja augalų viruso, koduojančio trijų genų blokavimo baltymus Arabidopsis thaliana, judėjimą iš ląstelės į ląstelę. Mokslinės ataskaitos, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Žolėdžių ir gėlių monoterpenų sukeltos lakiosios medžiagos yra biosintetinamos vieno P450 fermento (CYP82G1) Arabidopsis. . Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 21205–21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Hu, L., Machado, RAR ir kt. (2018) Metabolinio perėjimo tarp amarų ir vikšrų atsparumo grūduose konvergencija. Mokslo pažanga, 4, eaat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. ir kt. (2018) Dviejų Gossypium hirsutum P450 fermentų, dalyvaujančių DMNT ir TMTT biosintezėje, identifikavimas ir funkcinė analizė. Augalų biotechnologijos žurnalas, 16, 581–590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Jazmonatų signalizacija augaluose formuoja augalų ir vabzdžių sąveikos ekologiją. Dabartinė nuomonė vabzdžių moksle, 14, 32–39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Wang, L., Tan, Y., Huang, J. ir kt. (2018) Ryžių atsparumas vabzdžių kenkėjams, kurį sukelia serotonino biosintezės slopinimas. Gamtos augalai, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) CRISPR‐Cas9 nukreipimas į eIF4E1 geną išplečia bulvių viruso Y atsparumo spektrą Solanum tuberosum L. cv. desirée. Mikrobiologijos sienos, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Naujas etileno ir jazmono rūgšties takų atsakas į ryžiuose esantį auskarų čiulpiantį vabzdį. Naujasis fitologas, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW ir kt. (2019) Lakusis DMNT sistemiškai sukelia nuo jazmonatų nepriklausomą tiesioginę apsaugą nuo žolėdžių saldžiųjų bulvių (Ipomoea batatas) augalų lapuose. Mokslinės ataskaitos, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska‐Banaszak, O., Skrzypczak‐Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Glutathione S-transferase as a toxicity indikator in general anesthesia: genetics and biocheminė funkcija. Journal of Clinical Anesthesia, 27, 73–79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: nauji šeimos nariai, nauji įpareigojantys partneriai, nauji vaidmenys. Biologinės chemijos žurnalas, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG ir kt. (2016) Lakiųjų homoterpenų DMNT ir TMTT gamybos biosintetinių būdų apibūdinimas Zea mays. Augalinė ląstelė, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ ir Browning, KS (1998) Naujo Arabidopsis thaliana dangtelį surišančio baltymo identifikavimas ir apibūdinimas. Biologinės chemijos žurnalas, 273, 10325–10330.