Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Spustelėkite čia, jei norite gauti informacijos apie šio straipsnio II dalį (Įvadas, medžiaga ir metodai).

Normalaus žmogaus inkstų proksimalinio vamzdelio ir glomerulų beveik vienaląsčių proteomikos profiliavimas

Tara K. Sigdel¹, Paulius D. Piehowskis², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adamas C. Swensenas², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroederis¹, Izabella Damm¹, Svastika Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* ir Minnie M. Sarwal¹* Inkstų tiksliosios medicinos projekto (KPMP) konsorciumui

¹Daugiaorganinės transplantacijos skyrius, Kalifornijos universiteto Chirurgijos skyrius, San Franciskas, San Franciskas, CA, Jungtinės Valstijos

²Ramiojo vandenyno šiaurės vakarų nacionalinė laboratorija, Biologijos mokslų skyrius, Ričlandas, Vašingtonas, Jungtinės Valstijos

³Aplinkos molekulinių mokslų laboratorija, Ramiojo vandenyno šiaurės vakarų nacionalinė laboratorija, Ričlandas, Vašingtonas, Jungtinės Valstijos

⁴Patologijos skyrius, Mičigano universitetas, Ann Arbor, MI, JAV

Raktiniai žodžiai:glomerulų, masės spektrometrija, vienos ląstelės analizė, proteomika,inkstas

Molekuliniai vertinimai vienos ląstelės lygmeniu gali paspartinti biologinius tyrimus, nes pateikiami išsamūs ląstelių organizavimo ir audinių nevienalytiškumo vertinimai tiek ligos, tiek sveikatos atveju. Žmogusinkstasturi sudėtingų daugialąsčių būsenų su įvairiomis funkcijomis, kurių didžiąją dalį dabar galima visiškai panaudoti su naujausiomis technologinėmis pažangomis audinių proteomikoje beveik vienos ląstelės lygmeniu. Aptariame pagrindinius žingsnius taikant šį masių spektrometrija (MS) pagrįstą proteomikos metodą normalaus žmogaus poskyriams analizuoti.inkstas, kaip Kidney Precision Medicine Project (KPMP) dalis. Naudodami ~ 30–40 lazeriu užfiksuotų mikro išpjaustytų inkstų ląstelių, nustatėme daugiau nei 2500 žmogaus baltymų, būdingųproksimalinis vamzdinis(PT; n=25 baltymų) ir glomerulų (Glom; n=67 baltymų) regionųinkstasir jų unikalias medžiagų apykaitos funkcijas. Šiame bandomajame tyrime pateikiamas planas, kaip pritaikyti mūsų beveik vienos ląstelės proteomikos darbo eigą kitų inkstų mikrokompartmentų analizei platesniu mastu, siekiant išsiaiškinti inkstų tarpląstelinės funkcijos sutrikimus normaliame inkste, taip pat skirtingas etiologijas. ūminės ir lėtinėsinkstų liga.

cistanche gali pagerinti inkstų funkciją

Įvadas

Naujausi molekulinio profiliavimo pažanga, ypač transkripcijos analizė vienos ląstelės lygmeniu, gali atskleisti retas ląstelių populiacijas nevienalyčiuose klinikiniuose audiniuose, o tai prisideda prie mūsų supratimo apie inkstų biologiją ir jos molekulinius procesus (1–7). Yra nepatenkintas poreikis sukurti metodus, kurie galėtų suteikti išsamią biologinę informaciją RNR ir DNR lygiais ir taip pat leistų atlikti vienos ląstelės proteominio audinio analizę.

Proteominės technologijos, skirtingai nei genomika, gali suteikti funkcinės informacijos apie ląstelių būsenas ir reguliavimo tinklus (2). Masių spektroskopija (MS) pagrįstos proteomikos technologinis iššūkis yra pradinės medžiagos apribojimas. Skirtingai nuo transkriptomikos, proteomika neleidžia molekulinės amplifikacijos. Dėl šio fakto buvo dedamos didelės pastangos padidinti MS pagrįstos proteomikos analitinį jautrumą, įskaitant technologijų miniatiūrizavimą ir didesnį elektros purškimo jonizacijos šaltinio efektyvumą (8, 9), todėl analitinis jautrumas dabar yra pakankamas, kad būtų galima aptikti vieno žinduolio baltymus. ląstelės. Nepaisant didelio analitinio jautrumo, proteominis pritaikymas mažiems mėginių kiekiams sukėlė papildomų iššūkių, tokių kaip nespecifinė baltymų ir peptidų adsorbcija į reakcijos vamzdelių paviršius, neefektyvi virškinimo kinetika, valymo poreikis ir pristatymo iššūkiai. Mūsų grupė neseniai pranešė apie beveik vienos ląstelės proteomikos (nscProteomics) metodą HeLa ląstelėse, kuris suteikia labai novatorišką ir jautrią technologiją, skirtą mėginių, kurių baltymų kiekis yra mažesnis nei nanogramos, proteomų matavimams iš nedidelio skaičiaus ląstelių (10). Šiam metodui reikalinga labai pritaikyta mėginių apdorojimo įranga, todėl jį sunku perkelti į kitas tyrimų laboratorijas. Žmogaus apdorojimasinkstasaudiniams per šį vamzdyną reikėjo daug dėmesio skirti protokolo kūrimui, kad būtų optimizuotas audinių išsaugojimas ir ląstelių gaudymas.

Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme tam, kad pateiktume gaires, kaip sėkmingai išmatuoti proteominį tardymą įvairiuose poskyriuose.inkstas, beveik vienos ląstelės lygmeniu, su šiais rezultatais: (i) optimalaus inkstų audinio surinkimo ir saugojimo nscProteomics įvertinimas; ii) atitinkamo nscProteomics etaloninio standarto identifikavimas; (iii) Inksto audinio storio optimizavimas lazerinio gaudymo mikrodisekcijai (LCM); (iv) LCM parametrų optimizavimas; v) nscProteomics metodo, naudojant LC-MS pagrįstą, visiškai automatizuotą mikro POTS metodą (μPOTS; apdorojimas viename inde, skirta pėdsakų mėginiams), aprašymas (11); (vi) „nscProteomics“ duomenų analizė.

Kad įvykdytume pirmiau minėtas užduotis, apdorojome 11 unikalių žmoniųinkstasbiopsijos ir sukurti protokolai bei metodikos, skirtos rinkti, apdoroti ir tirti žmogaus proteominę raišką.inkstasμPOTS mėginiai. Sujungus su labai jautria LC-MS, mes demonstruojame visiškai automatizuotą μPOTS metodą, kuris užtikrina atkuriamumą ir suteikia kiekybinius ~3,{2}} baltymų proteominius matavimus nuo 10 iki 100 lazeriu fiksuojamų mikro išpjaustytų (LCM) inkstų ląstelių. aprėpties lygis, anksčiau pasiektas tik tūkstančiams ląstelių (12–17). Šis tyrimas padės molekuliniu būdu apibūdinti audinių ląstelių heterogeniškumą ir patologiją inkstų biopsijose iš pacientų, sergančių skirtingomis ūminės ir lėtinės inkstų ligos priežastimis. Ši unikali technologija gali atskleisti proteominį heterogeniškumą ir unikalius baltymų žymenis skirtinguoseinkstasligų potipius ir postruktūrius, kurie bus susiję su ligos patogeneze, prognoze ir rizikos stratifikacija. Tyrimas apibendrintas 1 pav.

1 pav. Beveik vienos ląstelės proteomikos (nscProteomics) darbo eiga optimizuota žmogaus apdorojimuiinkstasaudinių. Darbo eiga apima optimalaus identifikavimąinkstasaudinių surinkimas ir saugojimas, nscProteomics metodo inkstų ląstelėms nscProteomikos metodo fiksavimo lazeriu mikrodissekcijos kokybės kontrolė.

Eksperimentinės procedūros

Studiju dizainas

Scheminis proteominių tyrimų, atliktų su 11 unikalių žmogaus normalių, vaizdasinkstaiparodyta 2A paveiksle. Iš viso buvo atlikti 28 masės spektrometrijos (MS) bandymai, skirti masiniam ir lazeriu gaudymui mikro-dissektuotai (LCM) nscProteomikai suporuotose glomerulinėse (Glom) ir proksimalinėse vingiuotose vamzdinėse (PT) dalyse. Audiniai iš pirmųjų dviejųinkstaibuvo konservuoti kaip FFPE ir optimalios pjovimo temperatūros mišinio (OCT) terpėje. Inkstų audinių problemos dar 9 inkstuose buvo apdorotos tik UŠT (2A pav.).

2 pav. (A) Tyrimo mėginių ir tyrimų santrauka. (B) QC diagrama, skirta proceso atkuriamumui naudojant UŠT audinį. Spektrinio skaičiaus skirtumai tarp baltymų 2 atskiriems bandymams naudojant UŠT audinį buvo pavaizduoti pagal vidutinį baltymų spektrinį skaičių 1 257 baltymams. Siužete mėlyna linija vaizduoja vidutinį skirtumą; raudonos ir žalios linijos rodo atitinkamai 2 SD ir 3 SD ribas. 97,96 procentai baltymų patenka į apskaičiuotą 13,52 atkuriamumo ribą, o tai rodo aukštą atkuriamumo laipsnį. Taip pat matyti, kad proceso, kuriame dalyvauja UŠT audiniai, kintamumas yra mažesnis nei proceso, kuriame dalyvauja FFPE audinys (apskaičiuota atkuriamumo riba: 24,43). (C) 374 bendrų baltymų UŠT ir FFPE spektrinio skaičiaus pasiskirstymo palyginimas. Didesnis skaičius baltymų iš UŠT audinio turi didelį spektrinį skaičių, tuo tarpu baltymams iš FFPE audinio didesnis mažo spektro skaičius. (D) 76 unikalių baltymų FFPE ir 244 unikalių baltymų UŠT spektrinio skaičiaus pasiskirstymo palyginimas. UŠT audiniuose pastebima didesnė mažo spektrinio skaičiaus baltymų dominavimas. Tai gali reikšti, kad UŠT audinių technika yra geresnė norint aptikti mažai gausius baltymus pagal dabartinį scenarijų. Koreliacijos koeficientas tarp baltymų, nustatytų iš 2 UŠT užšaldytų audinių, buvo 0,96 (P <>

Inkstų audinių mėginio paėmimas

Žmogusinkstų audiniaibuvo surinkti iš 11 neidentifikuotų dalinių nefrektomijų, gautų iš Kalifornijos universiteto San Francisko (UCSF) ir Mičigano universiteto (UM), su patvirtintu IRB, kaip bandomosios technologijos galimybių studijos dalis NIH inkstų tiksliosios medicinos srityje. Projektas (KPMP). Tik sveika sritisinkstaskaip nustatė apmokytas patologas, buvo naudojamas šiam tikslui. Mėginiai buvo anonimizuoti su vieninteliu įspėjimu, kad audiniai buvo paimti iš suaugusiųjų. Norint įvertinti optimalų šios technologijos mėginių paėmimo protokolą, iš pradžių ~100 mg audinio iš 2 inkstų buvo padalintas po lygiai ir paruoštas kaip formalinu fiksuotas parafinu įterptas (FFPE) audinių pjūvis arba užšaldytas „Tissue-Plus™“ OCT junginys („Fisher Scientific“). Viena 5 μm ir trys 10 μm storio iš eilės pjūviai buvo iškirpti iš kiekvieno UŠT bloko kriomikrotomu ir pritvirtinti ant 1,0 polietileno tereftalato (PET) membranos stiklelių (Zeiss), skirtų glomerulams irproksimalinis kanalėlisskrodimas. 5 μm storio pjūvis buvo nudažytas H&E, kad būtų galima vizualizuoti pagrindines histologines struktūras. Likusios 10 μm storio sekcijos liko nedažytos. Visos skaidrės buvo laikomos –80 laipsnių temperatūroje iki išpjaustymo.

Cistanche inkstų funkcijos sutrikimui pagerinti

Audinių siuntimo ir apdorojimo poveikio proteominei produkcijai įvertinimas

Norėdami įvertinti vėlavimo poveikį UŠT šaldytų audinių proteominei analizei,inkstastissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 val. kelionė toli, apdorojama antrajame centre ir atvirkščiai. Masinė proteomika buvo atlikta dviem 2 unikaliaisinkstai(inkstai Nr. 3, Nr. 4), įsigyti Mičigano universitete ir išsiųsti į 2 skirtingas vietas (Ohajo valstijos universitetą ir UCSF) MS analizei, naudojant tą patį protokolą ir MS parametrus abiejose vietose. Tada MS važiavimų rezultatai buvo lyginami tarp dviejų vietų.

Baltymų ekstrahavimas ir nusodinimas

Tai buvo atlikta naudojant UŠT ir FFPE audinių paruošimo metodus, siekiant parinkti optimalų audinių proteomikos metodą. UŠT audinys buvo padalintas į 10 μm storio dalis, naudojant kriomikrotomą. Norint pasirinkti minimalų audinių kiekį, reikalingą baltymų ekstrakcijai sergant MS, buvo nupjautos, atšildytos ir perkeltos į mikrocentrifugos mėgintuvėlius trys garbanos (pjūvis, kuris dedamas į Eppendorfo mėgintuvėlį, o ne paskleistas ant stiklelio) ir 5 garbanos šaldyto audinio. kuriame yra 5 mm nerūdijančio plieno rutuliukas (Qiagen), veikiamas žinduolių ląstelių lizės buferiu (įskaitant Benzonase® nukleazės ir proteazės inhibitorių tirpalą; Qiagen) ir homogenizuotas TissueLyser LT (Qiagen) 50 aps./s greičiu 3 min. Baltymų koncentracija buvo kiekybiškai įvertinta (Bradfordo tyrimas; Thermo Scientific) ir iki naudojimo laikoma –20 laipsnių temperatūroje. Audinys saugomas<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Tripsino virškinimas

Maždaug 150 ug viso baltymo (~15 proc. turimos įvesties) buvo veikiami reduktoriais (200 mM DTT ir 100 mM Tris-HCl) ir alkilinančiais reagentais (200 mM jodacetamido ir 100 mM Tris-HCl). ir tada praskiedžiamas vandeniu be RNRazės/DNRazės, kad karbamido koncentracija būtų sumažinta iki 0,6 M. Pridėta 4 ug kiaulių tripsino (Sigma) ir mėginys suardomas 37 laipsnių temperatūroje. Baltymų koncentracija buvo kiekybiškai įvertinta (Bradfordo tyrimas; ThermoScientific) ir MS buvo panaudota 10 ug baltymų.

MS for Bulk Proteomics, siekiant įvertinti optimalų inkstų audinių apdorojimo metodą

Triptinių peptidų mišinys buvo parūgštintas skruzdžių rūgštimi, išvalytas C18 Monospin kolonėlėmis ir analizuojamas naudojant Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS / MS buvo atlikta naudojant didesnės energijos C-spąstų disociaciją (HCD). Masės spektrai buvo analizuojami naudojant Byonic v2.14.27 (baltymų metrika), leidžiantį 12 ppm masės toleranciją. Buvo leidžiamos kintamos potransliacinės modifikacijos, įskaitant oksidaciją, metilinimą, karbamilinimą ir fosforilinimą. Baltymai buvo skirti tik tiems, kurių balai buvo geresni nei 1 procentas klaidingų atradimų dažnis (FDR). Buvo atliktas baltymų gausos ir MS duomenų palyginimas, siekiant pasirinkti optimalų metodąinkstasaudinių surinkimas tarp FFPE ir UŠT.

Mikrodisekcija lazeriu

Nedažytos 5, 10 ir 20 μM storio sekcijos, sumontuotos ant PET stiklelių, buvo dedamos ant Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection sistemos (Zeiss) scenos, kad būtų galima patikrinti optimalų pjovimo storį. Glomerulinis irproksimalinis kanalėlisregionai buvo atrinkti naudojant laisvos rankos įrankį, o skrodimai buvo atlikti 10X objektyvu. Buvo užfiksuotos ~ 4580 μm2 ploto ir 10 uM storio sekcijos, kurios sudarė ~ 40 glomerulų ląstelių, remiantis anksčiau paskelbta sveiko suaugusiojo glomerulų ląstelių įvertinimo formule.inkstas(18). Užproksimalinis vamzdinisląstelių, užfiksavome ~ 2900 μm2proksimalinis vamzdinisląstelių, kurios sudarė ~ 36 ląsteles. Iškirptos sekcijos buvo katapultuotos į 200 μl nepermatomą lipnų dangtelį (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) ir laikomos –80 laipsnių temperatūroje.

Beveik vienos ląstelės proteomika (nscProteomics)

Norint ištirpinti baltymus, surinktus gaudymo dangteliuose su LCM, 10 μL lašelis 0,1 procento DDM 50 mM Tris pH 8 buvo įlašinamas tiesiai į dangtelį. Mėginiai buvo inkubuojami 30 minučių 37 laipsnių temperatūroje Eppendorf ThermoTop termomikseryje, kad būtų sumažintas garavimas, po to centrifuguojama 2, 000 × g 1 minutę, kad lizatas būtų perkeltas į buteliuką. Baltymai buvo sumažinti 5 mM ditiotreitoliu ir inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje 30 min. Alkilinimas buvo atliktas 10 mM jodoacetamidu, inkubuojant 45 minutes tamsoje 25 laipsnių temperatūroje. Tada buvo pridėta 10 ng Ls-C alikvotinė dalis, po to 3 valandas inkubuojama 25 laipsnių temperatūroje. Tada buvo pridėta 10 ng tripsino alikvotinė dalis, po to virškinama per naktį 25 laipsnių temperatūroje. Suvirškinti peptidai buvo sumaišyti su 15 μL 18 MΩ vandens alikvotine dalimi.

LC-MS platforma itin mažiems mėginiams

Peptidų mėginiai (25 μL) buvo atskirti naudojant 60 cm kolonėlę su 50 μm vidiniu skersmeniu ir integruotu emitteriu (naujas tikslas). Kolonėlės buvo supakuotos 1, 7 μm skersmens Waters BEH terpėje. 100-min gradientas buvo gautas naudojant Dionex Ultimate 3000 RSLC nano siurblį (Thermo Scientific). Ši sistema buvo sujungta su QExactive Plus masės spektrometru (Thermo Scientific). Masės spektrai buvo renkami nuo 300 iki 1800 m/z, naudojant 12 populiariausių nuo duomenų priklausomą gavimo metodą. MS1 spektrai buvo surinkti su 35K masės skiriamąja geba, o MS2 - su 17,5K. Siekiant padidinti identifikavimą iš mažo gausumo jonų, buvo naudojamas maksimalus 100 ms IT.

Proteominis duomenų išgavimas

Visi neapdoroti failai buvo apdoroti naudojant MaxQuant (versija 1.5.3.30) funkcijų aptikimui, duomenų bazės paieškai ir baltymų / peptidų kiekybiniam įvertinimui (19) pagal anksčiau aprašytus nustatymus (10). Tandeminių masių spektrų buvo ieškoma UniProtKB/Swiss-Prot žmonių duomenų bazėje (atsisiųsta 2018 m. gruodžio 29 d., kurioje yra 20 417 peržiūrėtų įrašų). MS proteomikos duomenys, skirti nscProteomics, buvo perkelti į ProteomeXchange konsorciumą per PRIDE (20) partnerių saugyklą su duomenų rinkinio identifikatoriais PXD015058 ir 10.6019/PXD015058.

Duomenų analizė

MS duomenys buvo gauti iš PNNL (nscProteomics) ir Stanfordo universiteto (masinė proteomika) atliktų bandymų. Masinei proteomikai. Optimaliam parinkti buvo naudojami šie statistiniai metodaiinkstasaudinių surinkimo metodas, užšaldytas UŠT arba apdorotas kaip FFPE, įvertinus kiekybinę audinių masės proteomiką, i) buvo apskaičiuotas baltymų kiekis/mg lygiaverčio įvesto audinio; (ii) MS atkuriamumas buvo išbandytas naudojant MS išvestį iš FFPE ir UŠT sekcijų iš kiekvieno iš 2 inkstų, paruoštų to paties asmens, naudodamas tą patį protokolą, analizuotas tuo pačiu MS prietaisu, naudojant nustatytą protokolą, kelių dienų intervalu (21). Atkuriamumo riba (22) buvo naudojama siekiant nustatyti apytikslę matavimo skirtumų ribą tarp nuoseklių vieno proceso paleidimų ir procesų palyginimo tikslumo įvertinimą. Apskaičiuotas koreliacijos koeficientas, nurodantis sutapimo laipsnį tarp nuoseklių važiavimų (naudojant tą patį audinį); (iii) Baltymų gausa ir peptidų fragmentų dydžio pasiskirstymas buvo apskaičiuotas, siekiant įvertinti pokyčius, atsiradusius dėl baltymų skilimo, kryžminio susiejimo dėl formalino ir kt. Kiti kokybės kontrolės aspektai, įskaitant (iv) proceso dreifo įvertinimą, palyginti su pakartojimais ir laiku, naudojant bendrą fondą.inkstasnuoroda ir v) šališkumo apskaičiavimas. Griežta kiekybinė analizė ir unikalių baltymų identifikavimas naudojo duomenis tik su baltymais, kurių spektrinis skaičius didesnis nei 5 (23). Tikslus Fisher testas buvo naudojamas norint įvertinti įprastų ir unikalių baltymų, susietų tarp dviejų normalių žmogaus inkstų (1 ir 2), praturtėjimą. Remiantis aukščiau pateikta analize (žr. rezultatus), UŠT užšaldytas audinys buvo pasirinktas kaip surinkimo metodas visoms vėlesnėms analizėms.

Kitas duomenų analizės žingsnis buvo nustatyti, kiekybiškai įvertinti ir patvirtinti baltymų rinkinius, praturtintus arba būdingus ~ 10–100 ląstelių, gautų iš kiekvienos iš dviejų atrinktų.inkstasposkyriai - Glom ir PT regionai, gauti iš to patiesinkstas, urmu ir LCM UŠT sušaldytainkstų audinys(n=9; inkstai Nr. 3–11) ir valdo nscProteomics.

Siekiant išspręsti trūkstamų / neišsamių duomenų problemas, buvo pritaikytas {{0}}pakopinis pusiau konservatyvus filtravimo metodas, o G testas (24) buvo naudojamas siekiant nustatyti, ar duomenų trūksta atsitiktinai (MAR). arba Missing Not At Random (MNAR). Papildomas duomenų patikimumo įvertinimas buvo atliktas griežtai atrenkant baltymus, pastebėtus daugiau nei 50 procentų visų mėginių. T testas buvo naudojamas norint nustatyti, ar baltymai yra reikšmingai praturtinti glommingu arba PT, ir buvo pritaikyta daugkartinė testavimo korekcija (Benjamini-Hochberg FDR), kurios reikšmingumo riba buvo 0, 1. Analizės tikslais santykinio intensyvumo MS duomenys (log 2 transformuoti), gauti iš Glom, PT ir masinių frakcijų iš vienoinkstasbuvo laikomi suporuotais. Mes nustatėme baltymus, praturtintus Glom (su mažu kiekiu PT / urmu) ir unikalius Glom (nėra PT), taip pat baltymus, praturtintus PT (mažas kiekis Glom / urmu) ir unikalius PT (nėra Glom) . Siekiant padidinti pasitikėjimą, praturtinimo analizė buvo atlikta tik naudojant duomenis be trūkstamų verčių kiekvienoje grupėje. Koreliacija tarp įprastų baltymų gausos verčių buvo naudojama norint įvertinti praturtintų poskyrių baltymų sutapimo laipsnį tarp atskirų to paties eksperimento ciklų. Taip pat atlikome kryžminį reikšmingai praturtintų baltymų patvirtinimą kiekviename skyriuje, analizuodami šiuos palyginimus iš unikalių mėginių rinkinių tarp 2 skirtingų 1 ir 2 paleidimo. užklausa, ar žinomi sub-skyriai praturtinti baltymai gali būti lokalizuoti atgal į jų konkrečius regionus viešuose žmogaus baltymų atlaso (https://www.proteinatlas.org/) duomenyse (25).

Cistanche dėl inkstų nepakankamumo simptomų

Cross-Omics duomenų palyginimas / integravimas

Norint įvertinti baltymų ekspresijos atitikimą RNR lygiu, buvo naudojami duomenys, gauti iš vienos ląstelės RNR sekos nustatymo (scRNA Seq), atlikto 10 natūralių nefrektomijų, iš kurių 9 sutampa suinkstainaudojamas nscProteomics. Tam buvo naudojama 10x Genomics Chromium platforma su v3 chemija, naudojant metodą, optimizuotą Sarwal laboratorijoje kaip KPMP konsorciumo audinių apklausos vietą (TIS) (rankraštis, kuriame išsamiai aprašomas metodas ir rezultatai, yra ruošiamas). Šiai kryžminei analizei naudojome transkripto duomenis iš 45 411inkstasląstelės suskirstytos į devynis pagrindinius ląstelių tipus: podocitai, mezangialinės ląstelės, glomerulų endotelis, stroma / intersticis, imuninės ląstelės,proksimalinis kanalėlis, stora kylanti Henlės kilpos galūnė, distalinis / jungiamasis kanalėlis ir surinkimo latakas. Vieno langelio duomenų analizė buvo atlikta naudojant Seurat R paketo 2.3.4 versiją. Kuriama nuodugnesnė šių duomenų analizė (26).

Iš: „Beveik vienos ląstelės proteomikos profiliavimasProksimalinis vamzdinisirGlomerulusnormalaus žmogausInkstasTara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Luoo1, Yinghu Sur1 Yang4, Wei-Jun Qian2* ir Minnie M. Sarwal1*InkstasTiksliosios medicinos projekto (KPMP) konsorciumas

---ORIGINALUS TYRIMŲ straipsnis Priekyje. Med., 2020 m. rugsėjo 17 d. |