Mitochondrijų membranos stabilizavimas, atliktas Angelica Sinensis polisacharidas sergant pelių aplastine anemija

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktus

Siekiant ištirti mitochondrijų membranos stabilizavimo Angelica Sinensis polisacharidu (ASP) mechanizmą sergant pelių aplastine anemija (AA), ICR pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į kontrolines. AA ir ASP gydytos grupės AA grupės pelės buvo gydomos 60Co Y ir intraperitoninėmis ciklofosfamido ir chloramfenikolio injekcijomis. Kontroliniai gyvūnai buvo apšvitinti švinu ir fiziologiniu tirpalu. Gydytos AA pelės buvo šeriamos ASP 2 savaites. Kaulų čiulpų mitochondrijų ultrastruktūra buvo stebima transmisijos elektronų mikroskopu, o kaulų čiulpų branduolių ląstelių (BMNC) transmembraninis potencialas buvo tiriamas fluorescencine spektrofotometrija. Cox ir MDH kiekis terpėje taip pat buvo tiriamas trijose grupėse. BMNC mitochondrijų skaičius ir transmembraninis potencialas kaulų čiulpuose sumažėjo AA grupėje, palyginti su kontroline grupe, bet pagerėjo ASP gydytoje grupėje, palyginti su AA grupė. Visiškas mitochondrijų skilimas ASP gydytoje grupėje buvo žymiai atidėtas (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Raktiniai žodžiai: aplazinė anemija, Angelica Sinensis polisacharidas, mitochondrijos, membranos potencialas, ICR pelės

cistanche ekstraktas: skatina kaulų formavimąsi ir padidina kaulų tankį

Fonas

Aplazinė anemija (AA) yra kraujo sutrikimas, kai pažeidžiami kaulų čiulpai ir su jais susijusios kraujo kamieninės ląstelės, dėl kurių sumažėja raudonųjų kraujo kūnelių, baltųjų kraujo kūnelių ir trombocitų kiekis. Šie trūkumai atskirai vadinami anemija, leukopenija ir trombocitopenija, o kartu vadinami pancitopenija. Cheminių medžiagų, vaistų, radiacijos, radioaktyviųjų medžiagų, spinduliuotę skleidžiančių prietaisų, infekcijos poveikis. imuninė liga, paveldimumas (50 proc. atvejų) ir nežinoma etiologija taip pat gali sukelti AA išsivystymą.

Mitochondrijos laikomos „ląstelių jėgainėmis“, nes jos gamina adenozino trifosfatą (ATP) sistemingai išgaudamos energiją iš maistinių medžiagų molekulių (substratų)[1]. Be to, mtDNR replikuojasi dideliu mutacijų greičiu, nes jai trūksta apsauginių histonų ir veiksmingos DNR atkūrimo sistemos. MtDNR mutacijos yra susijusios su hematologinėmis ligomis, tokiomis kaip įgyta sideroblastinė anemija, mielodisplastiniai sindromai ir įgytas AA [2-4]. Mūsų ankstesnis tyrimas 5] parodė, kad mutacijų sukeltas mitochondrijų kvėpavimo grandinės funkcinis sutrikimas gali būti susijęs su AA pacientų kraujodaros nepakankamumu. Nepriklausomai nuo morfologinių paskutinės stadijos ląstelių mirties požymių (apoptotinės, nekrozinės, autofaginės ar mitozinės), mitochondrijų membranos pralaidumas (MMP) dažnai yra lemiamas įvykis tarp išgyvenimo ir mirties [6]

Remiantis tradicine kinų medicina, Angelica Sinensis padeda suvienyti kraują ir skatinti jo cirkuliaciją [7]. Naujausi tyrimai parodė, kad Angelica Sinensis ekstraktai turi antioksidacinį ir neuroprotekcinį poveikį [8,9]. Tačiau antioksidacinė ASP funkcija lieka neaiški. Šiame tyrime buvo tiriamas ankstyvas ląstelių pažeidimas naudojant mitochondrijų lizės laiko kreivę ir mitochondrijų membraną stabilizuojantį ASP poveikį AA.

Cistanche papildas padidina kaulų tankį ir skatina kaulų formavimąsi

Medžiagos ir metodai

Gyvūnų grupavimas

Šandongo universiteto (Kinija) eksperimentinis gyvūnų centras parūpino sveikų ICR pelių patinų, sveriančių 18-22 g, amžiaus 6-8 sav. Gyvūnai buvo laikomi šiltoje, ramioje aplinkoje su laisva prieiga prie maisto ir vandens. ir aklimatizavosi vieną savaitę prieš pradedant eksperimentus.

Pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į tris grupes: normalią grupę, AA grupę ir gydomą grupę. Aplastinės anemijos modelis buvo sukurtas taip, kaip aprašyta anksčiau [10].

Trumpai tariant, pelės buvo apšvitintos 2.{1}}Gy 60Coy, o paskui tris dienas kasdien į pilvaplėvės ertmę švirkščiant 40 mg/kg ciklofosfamido ir 50 mg/kg chloramfenikolio per dieną. Gydomoji grupė buvo intragastriškai šeriama ASP (200 mg/kg/d, pagal Kinų medicinos žodyną). Kontrolinės grupės ir AA grupės pelės buvo šeriamos į skrandį fiziologiniu fiziologiniu tirpalu (10 ml/kg/d) papildytu maistu. Be to, tyrimo metu visos pelės gavo standartinę dietą. Po 2 savaičių gydymo ASP arba fiziologiniu tirpalu, pelės buvo nužudytos dėl gimdos kaklelio išnirimo.

Hematologinis tyrimas

Trijų grupių uodegos kraujo mėginiai buvo paimti atitinkamai pirmą ir keturioliktą dieną. Periferinio kraujo mėginiuose buvo skaičiuojami leukocitai ir trombocitai, nustatytas Hb kiekis. Baigus eksperimentus, pelės buvo numarintos, o šlaunikaulio tepinėlis buvo paruoštas diferenciniam kaulų čiulpų branduolių ląstelių (BMNC) skaičiavimui (1 pav.).

Perdavimo elektronų mikroskopija

Šlaunikaulio čiulpai buvo ištepti ir supjaustyti į itin plonas dalis. Šlaunikaulio čiulpų kraujodaros ląstelių mitochondrijos buvo analizuojamos ir suskaičiuotos transmisijos elektronų mikroskopu (JEM-2000EX, Japonija) 50 regėjimo laukų.

Mitochondrijų lizės laiko kreivė

Mitochondrijos buvo išskirtos iš pelių BMNC pagal gamintojo pateiktą mitochondrijų izoliavimo rinkinio protokolą (Pierce Biotechnology Inc., JAV). Monoaminooksidazės (MAO) koncentracija rodo mitochondrijų koncentraciją ir buvo nustatyta naudojant 200 V/ml mitochondrijų suspensijas iš 20 serumo kultūrų, per 12 valandų skirtingais laiko momentais (30 min. intervalais). Taip pat nustatytas citochromo oksidazės (Cox) ir malato dehidrogenazės (MDH) kiekis terpėje. Mitochondrijų membranos ir matricos specifinių fermentų koncentracijos laiko kreivių piko laiko analizė parodė mitochondrijų membranos lizės mastą.

Mitochondrijų membranos potencialas

Po išankstinio inkubavimo su MAO arba ASP, išskirtos trijų grupių mitochondrijos buvo pakartotinai suspenduotos 0,5 ml fosfatiniu buferiniu tirpalu (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kinija) ir 10 ul rodamino 123 darbiniame tirpale ( Sigma-Aldrich, JAV) buvo pridėta ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 5% CO2 15 min. Mitochondrijų membranos potencialas buvo analizuojamas srauto citometrijos metodu, naudojant 490 nm sužadinimo bangos ilgį ir 520 nm emisijos bangos ilgį.

Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS 19.{1}} programinę įrangą. Duomenys išreiškiami kaip vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Skirtingoms grupėms palyginti buvo naudojamas studento t testas. P < 0,05="" buvo="" laikomas="" statistiškai="">

cistanche žolė: geresnei kaulų kokybei

Rezultatai

Periferinio kraujo ir BMC skaičius

Naudojant visiškai automatinį kraujo ląstelių analizatorių, nustatyta, kad AA pelių periferinių kraujo ląstelių ir BMC skaičius labai sumažėjo (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Mitochondrijų ultrastruktūra aplastinės anemijos pelėse

AA pelių kaulų čiulpų perdavimo elektroninė mikroskopija parodė, kad gydytoje grupėje mitochondrijų ultrastruktūra žymiai pagerėjo naudojant ASP (2 lentelė ir 1 pav.), o tai rodo, kad ASP stabilizuoja AA pelių mitochondrijas. Kontrolinės grupės mitochondrijų dydis ir forma buvo normalūs. Priešingai. AA grupės mitochondrijos turėjo išsiplėtusias rutulines struktūras, kartu su cristae sutrikimu arba išnykimu (1A-C pav.).

Mitochondrijų membranos potencialas (MMP) aplastinės anemijos pelėms

Kadangi transmisijos elektronų mikroskopija atskleidė mitochondrijų pažeidimus, mes nustatėme ASP poveikį MMP AA pelėms, išmatuodami santykinius Rh 123 fluorescencijos skirtumus tarp trijų grupių, naudodami fluorescencijos spektrofotometrą.

Rezultatai parodė, kad kaulų čiulpų ląstelių Rh 123 fluorescencija AA grupėje (19,6±3,03) buvo mažesnė nei kontrolinės grupės (31,7±2,59, P).<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Ankstyvojo ląstelių pažeidimo mitochondrijų lizės laiko kreivė

Kontrolinėje grupėje mitochondrijų in vitro kultūros Cox ir MDH kiekis pasiekė piką per 3,5 valandos. MAO kiekis kultūroje laikui bėgant reikšmingai nepasikeitė, tačiau COX ir MDH kiekis laikui bėgant palaipsniui didėjo, pasiekdamas piką, o vėliau palaipsniui mažėjo. Taigi, visas ląstelių išleistas mitochondrijų turinys užtruko apie 3,5 valandos, kad pasiektų skilimo piką.

COX ir MDH smailės AA grupėje pasirodė atitinkamai po 1,5 val., 1,375 U/l, 36,732 U/l. COX ir MDH smailės gydomoje grupėje atsirado atitinkamai po 5,5 val., 6,5 val., 1,341 U/l, 33,994 U/. Statistinei analizei buvo naudojami du duomenų rinkiniai kiekvienu laiko momentu. Po 1,5 valandos COX ir MDH lygis AA grupėje buvo žymiai didesnis nei gydytoje (P < 0.05).="" todėl="" pilnas="" mitochondrijų="" skilimas="" serume="" buvo="" žymiai="" atidėtas="" po="" asp="" pridėjimo="" (p="">< 0,05),="" šiek="" tiek="" sumažėjo="" smailė="" (3="">

Diskusija

Aplastinė anemija (AA) yra kaulų čiulpų nepakankamumo sindromas, kuriam būdinga periferinė pancitopenija ir čiulpų hipoplazija. MtDNR mutacijos ir nestabilumas buvo įrodytos keliose ligose. Dėl mitochondrijų disfunkcijos ir sumažėjusio mitochondrijų skaičiaus gali sumažėti mtDNR. Nustatyta, kad sunkios pancitopenijos ir retikulocitopenijos atveju mtDNR delecijos kraujodaros skyriuje atsiranda [11]. Remdamiesi ankstesniais tyrimais [5], ištyrėme, ar ASP gali stabilizuoti AA pelių mitochondrijų membraną.

Angelica Sinensis polisacharido ir geležies kompleksas (APIC) turi ne tik puikų gydomąjį poveikį IDA, bet ir papildo kraują bei skatina kraujotaką [12]. ASP gali būti naudingas gydant ligas, kurias sukelia per didelė hepcidino ekspresija, užkertant kelią Janus kinazei (JAK), motinų sūnui, nuo ekstraląstelinio dekapentaplegio (SMAD) ir 1 signalo reguliuojamos kinazės (ERK) kelių, siekiant sumažinti hepcidino ekspresiją IDA žiurkėms [13]. ]. Qin J nustatė, kad ASP gali pagerinti chondrocitų proteoglikanų (PG) sintezę žiurkės OA modelyje in vivo ir IL-1B stimuliuojamuose chondrocituose in vitro, skatindamas agrekano ir GT, dalyvaujančio PG sintezėje, ekspresiją [14].

Mūsų tyrime AA pelės modelis buvo sukeltas acetilfenilhidrazino, rentgeno spindulių ir ciklofosfamido derinio. AA pelėms statistiškai reikšmingai sumažėjo leukocitų, Hb ir trombocitų kiekis periferiniame kraujyje (1 lentelė), taip pat smarkiai sumažėjo žastikaulio čiulpų ląstelių ir čiulpų palikuonių ląstelių, kurios yra klinikinės AA charakteristikos. AA pelėms, gydomoms ASP, BM ląstelių skaičius laipsniškai padidėjo, palyginti su AA grupe. Be to, buvo paveiktas mitochondrijų skaičius hematopoetinėse ląstelėse. ASP lėmė žymiai didesnį mitochondrijų skaičių gydomoje grupėje, palyginti su AA grupe (1 pav.). Šie rezultatai parodė, kad ASP gali skatinti čiulpų branduolių ląstelių dauginimąsi, padidinti mitochondrijų skaičių ir stabilizuoti mitochondrijų membraną AA pelėse.

Mitochondrijų pažeidimą atspindi mtDNR pažeidimas ir mtRNR transkriptų, baltymų sintezės ir mitochondrijų funkcijos sumažėjimas, dėl kurio gali sumažėti ląstelių energija, sutrikti ląstelių signalizacija ir trukdyti ląstelių diferenciacijai bei apoptozei. Be to, nepakankama mitochondrijų ATP gamyba gali paskatinti chromosomų nestabilumą[15]. Kadangi mtDNR koduoja keturių iš penkių mitochondrijų kvėpavimo kompleksų komponentus, mtDNR pakitimai sukelia mitochondrijų ligą [16-18]. Be mitochondrijų ligos, mtDNR mutacijos yra susijusios su vėžiu, diabetu. širdies ir kraujagyslių ligų. neurodegeneraciniai sutrikimai, hematologinės ligos, tokios kaip leukemija, taip pat normalus senėjimo procesas [19]. Svarbu tai, kad mtDNR mutacijos, taip pat mtDNR kopijų skaičiaus sumažėjimas gali būti patogeniški [20, 21]. Labai svarbu suprasti ląstelių mechanizmus, skirtus palaikyti mtDNR vientisumą ir kopijų skaičių, nes tai gali būti klinikinių intervencijų, skirtų hematologinių ligų, tokių kaip AA, prevencija ir gydymas, tikslai. Dėl šių veiksnių taip pat gali sumažėti energijos apykaita, o tai turės įtakos hematopoetinių kamieninių ląstelių savaiminiam atsinaujinimui ir diferenciacijai.

Šio tyrimo išvados rodo, kad ASP gali pagerinti mitochondrijų ultrastruktūrą ir slopinti transmembraninio potencialo sumažėjimą bei mieloidinių elementų apoptozę, siekiant išgydyti kaulų čiulpų nepakankamumą.

Cistanche ir cistanche ekstraktas: tinka kaulams

Nuorodos

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitochondrijos. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mitochondrijų DNR mutacijos kraujodaros sistemoje. Leukemija, 2004, 18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL ir kt. Mitochondrijų DNR heteroplazminės taškinės mutacijos, turinčios įtakos I citochromo c oksidazės subvienetui dviem pacientams, sergantiems įgyta idiopatine sideroblastine anemija. Blood 1997, 90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ ir kt. Mitochondrijų

4 . Aplastine anemija sergančių pacientų kaulų čiulpų ląstelių DNR aberacijos. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai ir kt. Pilna seka

5. mitochondrijų DNR ir telomero ilgio analizė sergant aplastine anemija.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA sukelia apoptozę žmogaus plaučių vėžio A549 ląstelėse, indukuodamas reaktyviąsias deguonies rūšis ir sumažindamas mitochondrijų membranos potencialą. Int J Mol Med 2010, 25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH ir kt. Vandenyje tirpių polisacharidų iš Angelica Sinensis kraujodaros poveikis pelėms su ūminiu kraujo netekimu. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR ir kt. Neuroprotekcinis Z-ligustilido 8F vaidmuo prieš ICR pelių priekinės smegenų išeminį pažeidimą. Brain Res 2006, 1102:145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y ir kt. Radi Angelica Sinensis, kurio sudėtyje yra Z-ligustilido komponento, skatina suaugusiųjų neurogenezę ir tarpininkauja atsigavimui po pažinimo sutrikimo Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C ir kt. Kaulų čiulpų stromos ląstelių išskiriamo IL-6 ekspresijos lygis pelėms, sergančioms aplastine anemija.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R ir kt. Arole mitochondrijų DNR radiacijos sukeltos mielodisplazijos ir antrinės leukemijos patogenezėje. Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ ir kt. Angelica Sinensis polisacharido ir geležies komplekso poveikis geležies stokos anemijai žiurkėms. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N ir kt. JAK, SMAD ir ERK signalų takų poveikis hepcidino slopinimui polisacharidais iš Angelica Sinensis žiurkėms, sergančioms geležies stokos anemija. Food Funct2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J ir kt. Angelica Sinensis polisacharidų poveikis osteoartritui in vivo ir in vitro: galimas proteoglikanų sintezės skatinimo mechanizmas. Evid Based Complement Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mitochondrijų DNR mutacijos kraujodaros sistemoje. Leukemija, 2004, 18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Raumenų mitochondrijų DNR ištrynimai pacientams, sergantiems mitochondrijų miopatija. Nature 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayre sindromas su raumenų mitochondrijų DNR delecija. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT ir kt. Mitochondrijų DNR mutacija, susijusi su paveldima Leberio optine neuropatija.Science 1988, 242:1427-1430.

19. Wallace DC. Metabolinių ir degeneracinių ligų, senėjimo ir vėžio mitochondrijų paradigma: evoliucinės medicinos aušra. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Skaičių dalykai: žinduolių mitochondrijų DNR kopijų skaičiaus kontrolė. J Genet Genomics 2009, 36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Genetinės mitochondrijų DNR išeikvojimo priežastys žmonėms. Biochim Biophys Acta 2009, 1792:1103-1108.

cistanche ekstraktas: skatina kaulų formavimąsi ir padidina kaulų tankį