Arilo angliavandenilių receptorių signalizacijos kelio įtakos Junín viruso replikacijai moduliavimas 1 dalis

Santrauka:

Junín virusas (JUNV), Arenaviridae šeimos narys, yra Argentinos hemoraginės karštinės, endeminės Argentinos kaimo regiono ligos, kuriai trūksta specifinės chemoterapijos, etiologinis veiksnys. Arilo angliavandenilio receptorius (AHR) yra ekspresuojamas keliuose žinduolių audiniuose ir buvo nurodytas kaip ligandų iš kintamų šaltinių jutiklis ir ląstelių imuninio atsako moduliatorius.

Junin virusas yra retas virusas, kuris veikia žmogaus imuninę sistemą ir sukelia stiprų imuninį atsaką. Tačiau imunitetas nėra vienintelė strategija, kuri nesugeba kovoti su Junin virusu.

Pirma, norint išlaikyti sveiką imuninę sistemą, svarbu pakankamai pailsėti ir išsimiegoti. Miego metu organizmas išskiria medžiagas, vadinamas citokinais, kurios padeda imuninei sistemai veiksmingiau reaguoti į virusus ir kitas išorines grėsmes.

Antra, sveikos mitybos įpročiai taip pat yra raktas į imuniteto gerinimą. Valgydami maistą, kuriame gausu vitaminų C ir D, pavyzdžiui, citrusinius vaisius ir grybus, galite sustiprinti organizmo imuninį atsaką.

Be to, vidutinio sunkumo mankšta taip pat gali pagerinti imunitetą. Tinkamas pratimas gali padidinti baltųjų kraujo kūnelių skaičių organizme ir taip sustiprinti imuninės sistemos gebėjimą.

Galiausiai, gera psichinė būsena taip pat labai svarbi imuninės sistemos sveikatai. Stresas ir nerimas gali paveikti organizmo imuninį atsaką, todėl svarbu išlikti atsipalaidavę ir pozityvūs.

Trumpai tariant, nors Junin virusas turi įtakos imuninei sistemai, gerindami savo gyvenimo būdą ir palaikant teigiamą požiūrį galime pagerinti savo imunitetą ir veiksmingai užkirsti kelią virusų atakoms bei reaguoti į juos. Šiuo požiūriu turime stiprinti savo imunitetą. Cistanche gali ženkliai pagerinti imunitetą, nes mėsos pelenuose yra įvairių biologiškai aktyvių komponentų, tokių kaip polisacharidai, du grybai, Huang Li ir kt. Šie komponentai gali stimuliuoti imuninę sistemą Įvairių tipų sistemos ląstelės, padidinti jų imuninį aktyvumą.

Spustelėkite cistanche deserticola papildą

Įdomu tai, kad naujausi tyrimai parodė, kad AHR signalizacijos kelio aktyvavimas arba slopinimas gali turėti įtakos įvairių žmogaus virusinių infekcijų baigčiai. Šioje ataskaitoje buvo analizuojamas AHR farmakologinio moduliavimo poveikis JUNV in vitro infekcijai. Pradinis mikrogardelių patikrinimas parodė, kad AHR kelias buvo per daug išreikštas JUNV užkrėstose kepenų ląstelėse.

Tuo pačiu metu Vero ir Huh{0}} ląstelių infekcija JUNV padermėmis IV4454 ir Candid#1 buvo reikšmingai slopinama, priklausomai nuo dozės, gydant CH223191, specifiniu AHR antagonistu, kaip nustatyta atliekant užkrečiamumo tyrimus. laiko RT-PGR ir virusinių baltymų imunofluorescencinis nustatymas. Be to, provirusinis AHR vaidmuo sergant JUNV infekcija, atrodo, nepriklauso nuo IFN-I kelio. Mūsų išvados patvirtina perspektyvias AHR farmakologinio moduliavimo perspektyvas, kaip galimą AHF kontrolės tikslą.

Raktiniai žodžiai:

Arilo angliavandenilio receptorius; Junín virusas; arena virusas; Argentinos hemoraginė karštligė; šeimininko terapinis tikslas.

1. Įvadas

Šiuo metu daugėja įrodymų, patvirtinančių, kad arilo angliavandenilio receptorius (AHR) yra svarbus šeimininko imuninio atsako moduliatorius ir ši savybė prisideda prie skirtingų klinikinių infekcijų baigčių individo ir populiacijos lygiu [1,2]. AHR yra citoplazminis receptorius, visur ekspresuojamas žinduolių audiniuose, veikiantis kaip įvairių endogeninių ir egzogeninių ligandų, turinčių skirtingą kilmę, tokių kaip teršalai, mityba, mikrobioma ir šeimininko metabolizmas, jutiklis [3–5].

Iš tiesų, buvo tvirtai teigiama, kad AHR daro didelę įtaką aplinkos veiksnių ir virusinių infekcijų sąveikai [1, 2]. Kai AHR atpažįsta ligando molekulę, ji perkeliama į branduolį, kur heterodimerizuojasi su arilo angliavandenilio receptoriaus branduolio translokatoriumi ir reguliuoja ksenobiotinio metabolizmo genų (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) ekspresiją.

AHR taip pat gali sąveikauti su kitais transkripcijos veiksniais, tokiais kaip NF-kB, kad moduliuotų daugybę signalizacijos kelių, įskaitant tuos, kurie dalyvauja imuniniame atsake [6–8]. AHR gali moduliuoti imunoreguliacinių genų ekspresiją ir pakeisti uždegiminių dendritinių ląstelių ir T ląstelių diferenciacijos kelius [9–11].

Naujausi mūsų tyrimų grupės atlikti tyrimai parodė, kad AHR signalizacijos kelio suaktyvinimas vaidina provirusinį vaidmenį Zikos (ZIKV), dengės karštligės (DENV) [12] ir sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV) metu. 4}}) infekcijos [13]. Atkreipkite dėmesį, kad buvo patvirtinta, kad dėl AHR slopinimo šiuose virusų modeliuose sumažėjo viruso replikacija, o tai rodo, kad AHR yra perspektyvi antivirusinė strategija.

Junín virusas (JUNV) yra apvalkalo segmentuotas RNR genomo virusas iš Arenaviridae šeimos [14]. Kiekvienas RNR segmentas koduoja du baltymus priešingomis kryptimis. Viena vertus, didelis segmentas (L RNR) koduoja nuo RNR priklausomą RNR polimerazę (L) ir matricos baltymą (Z).

Kita vertus, mažas segmentas (S RNR) koduoja nukleoproteiną (NP) ir glikoproteino pirmtaką (GPC), kurį proteazės skaido, kad susidarytų trys subvienetai (GP1, GP2 ir signalinis peptidas SSP). laikomi kartu sudarydami glikoproteinų kompleksą [14].

JUNV yra Argentinos hemoraginės karštinės (AHF) [15], endeminės ligos, paveikiančios kaimo darbininkus drėgname Argentinos Pampos regione, etiologinis sukėlėjas. Atkreipkite dėmesį, kad būdingas AHF bruožas yra platus užsikrėtusių pacientų klinikinių simptomų spektras. Asimptominė arba lengva liga, pasireiškianti į gripą panašiais simptomais, pasireiškia 70–80 procentų infekcijų. Tačiau sunkūs atvejai apima hemoragines ir neurologines komplikacijas, kurių mirtingumas svyruoja nuo 20 iki 30 procentų hospitalizuotų pacientų [15].

Svarbu tai, kad gyva susilpninta vakcina, pavadinta Candid#1, pasirodė esanti labai veiksminga užkertant kelią sunkiems AHF atvejams [15,16]. Tačiau vienintelis galimas gydymas nuo ligos yra sveikstančių pacientų imuninės plazmos skyrimas; gydymas, kuris, kaip įrodyta, sumažina mirtinų atvejų skaičių tik tada, kai jis skiriamas per 8 dienas nuo pirmųjų simptomų atsiradimo [17].

Nors pastaraisiais metais buvo surinkta daug įrodymų apie AHR poveikį infekcijų metu, vis dar nėra aiškių įrodymų apie jo vaidmenį sergant arenavirusinėmis infekcijomis [2].

Kadangi kaimo gyventojai nuolat susiduria su AHR ligandais, tokiais kaip žemės ūkio pramonės teršalai, tokie kaip agrochemijos, pesticidai ir šalutiniai iškastinio kuro deginimo produktai [18], šiame darbe įvertinome AHR farmakologinio moduliavimo in vitro poveikį ląstelių atsakas į JUNV infekciją ir galimas AHR panaudojimas kaip kandidatas į terapinę intervenciją sergant AHF liga.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Ląstelių linijos

Buvo naudojamos šios ląstelių linijos: Huh-7 (JCRB Cell Bank Nr. 0403) ir HepG-2 ATCC HB8065, dvi iš žmogaus hepatocitų gautos karcinomos ląstelių linijos; Vero ATCC CCL-81, beždžionių kilmės inkstų epitelio ląstelių linija. Kiekviena ląstelių linija buvo kultivuojama Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV), papildyta 5 procentais naujagimio veršelio serumu (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV) ir papildyta 50 µg/ml gentamicino (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), 1 mM natrio piruvato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), 2 mM L-glutamino (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV) ir buferinis HCl/NaHCO3. Ląstelių linijos buvo kultivuojamos ir palaikomos 37 ◦C temperatūroje su 5 procentų CO2 atmosfera.

2.2. Virusinės padermės

Buvo naudojamos šios virusinės padermės: natūraliai susilpninta IV4454 padermė, gauta iš lengvo žmogaus AHF atvejo [19], ir vakcina susilpninta Candid#1 padermė [20]. Vero ląstelės buvo naudojamos tiek virusų atsargų generavimui, tiek viruso titravimui naudojant standartinį apnašų tyrimą.

Visas darbas su infekcinėmis medžiagomis buvo atliktas 2 lygio biologinės saugos patalpose ir patvirtintas Buenos Airių universiteto Mokslų mokyklos Aplinkos sveikatos ir saugos biuro. Visi darbuotojai, susiję su infekcijos procedūromis, buvo paskiepyti Candid-1, kurią suteikė Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Airės, Argentina).

2.3. Mikrogardelių analizė

Iš viso 5 × 105 HepG2 ląstelės buvo pasėtos į 25 cm2 auginimo kolbas ir užkrėstos JUNV IV4454, kai infekcijos daugetas (MOI) buvo 1 arba buvo užkrėstas netikri. RNR buvo ekstrahuota ir išgryninta naudojant RNAeasy (Qiagen, Hilden, Vokietija) praėjus 24 ir 48 valandoms po užsikrėtimo (pi). RNR koncentracija buvo matuojama naudojant Nanodrop. HepG2 ląstelių genų ekspresijos profiliai buvo apibūdinti naudojant mikromatricos analizę (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips), siekiant nustatyti šeimininko genus, kuriuos transkripcija reguliuoja infekcija.

Bendras infekcijos reikšmingai reguliuojamų šeimininkų genų skaičius buvo apskaičiuotas kiekvienam laiko momentui, identifikuojant genus, kurių ekspresija pasikeitė bent 16-kartu ir 95 procentų tikimybe, kad bus išreikšta skirtingai (p {{ 3}}.05).

„WebGestalt“ programinė įranga (http://www.webgestalt.org, pasiekiama 2020 m. liepos 3 d.), kurioje naudojama „Wikipathways“ duomenų bazė, buvo naudojama genų ontologijos ir kelių perteklinio vaizdavimo analizei. Pakartotiniai eksperimentai buvo atlikti skirtingomis dienomis (n=3 nepriklausomų eksperimentų kiekvienai sąlygai).

2.4. Mažos molekulės junginiai

Sintetinis AHR specifinis konkurencinis antagonistas CH223191, 1-metil-N-[2-metil4-[2-(2-metilfenil)diazenil]fenil]{ {9}}H-pirazolo-5-karboksamidas (Tocris Bioscience, Bristolis, Jungtinė Karalystė) buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO) ir naudojamas 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 ir 80 µM.

Triptofano metabolitas L-kinureninas (2S)-2-Amino-4-(2-aminofenil)-4-oksobutano rūgštis (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) buvo tirpinamas DMSO ir naudojamas 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ir 320 µM koncentracijoje.

Visi apdorojimai buvo atlikti be šviesos, atsižvelgiant į tai, kad junginiai yra jautrūs šviesai.

2.5. Ląstelių gyvybingumo tyrimai

Ląstelių gyvybingumui nustatyti Huh-7 ir Vero ląstelių monosluoksniai buvo auginami 96 šulinėlių plokštelėse 24 valandas MEM 5 procentų NBCS. Ląstelių monosluoksniai, esant 90 procentų susiliejimo, buvo apdoroti skirtingomis koncentracijomis CH223191 (nuo 1,25 µM iki 80 µM) ir kinureninu (nuo 5 µM iki 320 µM) 72 valandas. Mockas buvo gydomas ta pačia DMSO koncentracija, kaip ir didžiausia ligando gydymo dozė, ir buvo laikomas 100 procentų ląstelių gyvybingumo.

Visi gydymo būdai buvo atlikti keturis kartus. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidą (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV) tyrimas. Sugertis buvo matuojama esant 570 nm FLUOstar OPTIMA mikroplokštelių skaitytuvu. Ląstelių gyvybingumo procentas buvo nustatytas reliatyvizuojant gydymo absorbcijos rezultatus, naudojant Mock absorbcijos reikšmes.

Be to, šviesos mikroskopu buvo tiriamas apdorotų ląstelių augimo gebėjimas ir morfologija. Nuotraukos darytos 72 val. su Nikon Eclipse TS100 mikroskopu; padidinimas: 100×; NA: 0,25.

2.6. Gydymas ir virusinės infekcijos

Vero ir Huh{{0}} ląstelių monosluoksniai buvo iš anksto apdoroti CH223191 ir kinureninu, praskiestu MEM 1,5 proc. NBCS, atitinkamai 1 val. arba 24 val. 37 ◦C temperatūroje. CH223191 buvo naudojamas koncentracijomis nuo 1,25 iki 20 µM, o kinurenino koncentracija buvo nuo 5 iki 80 µM. Tada virusinė infekcija buvo atlikta su IV4454 arba Candid#1 paderme, kai MOI buvo 0,5. Po 1 valandos sėjos buvo pašalintos ir ląstelės buvo veikiamos abiem junginiais 48 valandas minėtomis koncentracijomis. 48 val. pi supernatantai buvo surinkti apnašų tyrimui, o ląstelių monosluoksniai buvo apdoroti netiesioginei imunofluorescencijai arba RT-qPCR.

2.7. Netiesioginė imunofluorescencija

Huh-7 monosluoksniai, apdoroti CH223191 arba kinureninu ir užkrėsti JUNV, kaip minėta aukščiau, buvo fiksuoti 48 h pi su metanoliu 10 min –20 ◦ C temperatūroje, tris kartus plauti PBS ir laikomi šviežiame PBS 4 ◦ C temperatūroje. iki apdorojimo.

Buvo naudojami šie antikūnai: pirminiai pelių monokloniniai anti-NP antikūnai (1:200) (NA05-AG12) [21] ir antriniai Alexa Fluor 488 konjuguoti anti-pelės ožkos antikūnai (1:200) (A{{ 10}}) („ThermoFisher Scientific“, Waltham, MA, JAV). Ląstelių branduoliai buvo nudažyti 40,6-diamidino-2- fenilindoliu (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV). Mikroskopijos ir fotografavimo duomenys buvo gauti naudojant Olympus IX71 fluorescencinį mikroskopą su prijungta QImaging Exi-Aqua kamera (pikselio dydis: 6,45 µm; fotodetektoriaus plotas: 1392 × 1040 pikselių2).

Fluorescencijos duomenų kiekybinis įvertinimas atliktas naudojant Fidžio programinę įrangą (1.53v versija) (National Institutes of Health, Bethesda, MD, JAV). DAPI dažyto branduolio ir NP teigiamų ląstelių kiekybinis įvertinimas buvo atliktas rankiniu būdu naudojant ląstelių skaitiklio papildinį, įtrauktą į Fidžio programinę įrangą (1.53v versija). Ląstelės buvo laikomos teigiamomis, jei buvo galima aptikti NP viruso antigeno dažymą. NP-teigiamų ląstelių procentas buvo išreikštas kaip santykis tarp NP-teigiamų ląstelių ir visų ląstelių kiekviename lauke, tada buvo nustatytas ir pateiktas vidutinis procentas.

NP teigiamų ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo gautas išmatavus atskirų ląstelių vidutinę pilkumo vertę ir atėmus fono fluorescenciją. Virusiniai židiniai buvo atskirti atsižvelgiant į NP teigiamų ląstelių grupes, apsuptas NP neigiamų ląstelių. Virusiniai židiniai buvo suskaičiuoti ant 3 skirtingų vaizdų iš 3 skirtingų atsitiktinai parinktų laukų, o vidutinis židinio dydis buvo nustatytas pagal juos sudarančių ląstelių skaičių.

2.8. Virusinių nukleorūgščių aptikimas

Nukleino rūgšties ekstrahavimas iš užkrėstų ląstelių monosluoksnių buvo atliktas naudojant Highway ADN/ARN PuriPrep-VIRUS rinkinį K1501 (Inbio Highway, Buenos Airės, Argentina), pagal gamintojo instrukcijas. JUNV RNR viruso apkrova ir ląstelių transkriptų kiekybinis įvertinimas buvo atliktas RT-qPCR. Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta naudojant atsitiktinius pradmenis ir Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinę transkriptazę (M-MLV RT).

Fragmentų amplifikacijai buvo naudojami šie pradmenys: JUNV-np (pirmyn: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, atvirkštinė: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (pirmyn: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; Atvirkščiai: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( Pirmyn: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Atvirkščiai: 50 -ATGGTTAGCCCATAGATGGG-30 ), -aktinas (Pirmyn: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17} }}; Atvirkščiai: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30). PGR ciklo detalės buvo tokios: pradinė denatūralizacija 2 min. 95 ◦C temperatūroje; 45 stiprinimo ciklai, susidedantys iš 30 sekundžių 95 °C temperatūroje, 1 min. esant 58 °C ir 1 min. esant 72 °C temperatūrai; paskutinis 5 min. ciklas 72 °C temperatūroje; galiausiai buvo atliktos lydymosi kreivės. Aptikimas buvo atliktas naudojant MyiQ2 įrangą (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV). Rezultatai buvo pateikti kaip 2−∆∆Ct (kartų pokytis) ir normalizuoti naudojant -aktiną kaip namų tvarkymo geną.

2.9. Plokštelės tyrimas

Viruso išeiga buvo nustatyta standartiniu apnašų tyrimu. Ląstelių supernatantai buvo surinkti ir paruošti nuoseklūs skiedimai, kad užkrėstų Vero ląstelių monosluoksnius 1 valandą 37 °C temperatūroje. Po viruso adsorbcijos sėjamosios buvo pašalintos, pridėta MEM 5 procentų NBCS, papildyta 0,7 procentų metilceliuliozės, ir ląstelės buvo inkubuojamos 1 savaitę 37 ◦ C temperatūroje 5 procentų CO2 inkubatoriuje. Vėliau ląstelių monosluoksniai buvo fiksuoti 10 procentų formaldehidu, nuplauti ir nudažyti krištolo violetine spalva. Viruso titras buvo apskaičiuotas po apnašų formavimo vieneto (PFU) kiekybinio įvertinimo.

2.10. Statistinė analizė

Microarray statistinė analizė buvo atlikta naudojant WebGestalt programinę įrangą (http://www. webgestalt.org/, pasiekiama liepos 3 d. 2020). Duomenys apibūdinami kaip vidurkis ± SD Vienpusis ANOVA su Dunnett post hoc testu GraphPad Prism 8 (8.0.1 versija), skirta Windows 11 (GraphPad Software, San Diego, CA, JAV), buvo atlikta statistiniam reikšmingumui įvertinti. p Mažesnis arba lygus 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

For more information:1950477648nn@gmail.com