MTHFD2 yra medžiagų apykaitos kontrolinis taškas, kontroliuojantis efektorių ir reguliuojantį T ląstelių likimą ir funkciją

Grafinė abstrakcija

Autoriai:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Korespondencija:

jeff.rathmell@vumc.org

Trumpai :

Norint palaikyti greitą T ląstelių proliferaciją, reikalinga nukleotidų sintezė. Sugiura ir kt. rodo, kad de novo purino metabolizmas nukreipia T ląstelių diferenciaciją ir funkciją ir nustato MTHFD2 kaip metabolinį kontrolinį tašką ir terapinį taikinį uždegiminėms ligoms gydyti.

Pabrėžia

• MTHFD2 yra labai svarbus aktyvintoms CD4 T ląstelėms, kad būtų palaikoma de novo purino sintezė

• Nepakankamas MTHFD2 skatina į Treg ląsteles panašius fenotipus ir metabolizmą Th17 ląstelėse d MTHFD2 slopinimas slopina mTORC1 signalizaciją ir keičia histono metilinimą

• MTHFD2 gali būti skirtas apsaugoti nuo uždegimo ir autoimuniteto in vivo

MTHFD2 yra metabolinis kontrolinis taškas, kontroliuojantis efektorių ir reguliuojančią T ląstelių likimą ir funkciją

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darrenas R. Heintzmanas,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Maddenas,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolf,²Arissa C. Young,¹Daltonas L. Greenwoodas,¹Allison E. Sewell,¹Shaileshas K. Shahis,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrikas Foerchas,⁴Timas Bornas,⁴Juanas C. Garcia-Canaveras,⁵Jonas Kariolichas,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵ir Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilto imunobiologijos centras, Patologijos, mikrobiologijos ir imunologijos skyrius, Vanderbilto universiteto medicinos centras, Nešvilis, TN 37232, JAV

²Medicinos departamentas, Hematologijos ir onkologijos skyrius, Vanderbilto universiteto medicinos centras, Nešvilis, TN 37232, JAV

³Ajovos universiteto Patologijos skyrius, Ajovos miestas, IA 52242, JAV

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen centras, Oksfordo mokslo parkas, Oksfordas, JK

⁵Chemijos katedra, Ludwigo vėžio tyrimų instituto Prinstono filialas, Lewiso-Siglerio integracinės genomikos institutas, Prinstono universitetas, Prinstonas, NJ 08544, JAV6 Pagrindinis kontaktas

* Korespondencija: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

SANTRAUKA

Antigeninė stimuliacija skatina T ląstelių metabolinį perprogramavimą, kad atitiktų padidėjusius biosintezės, bioenergetikos ir signalizacijos poreikius. Mes parodome, kad vienos anglies (1C) metabolizmo fermentas metilentetrahidrofolato dehidrogenazė 2 (MTHFD2) reguliuoja de novo purino sintezę ir signalizaciją aktyvuotose T ląstelėse, kad skatintų proliferaciją ir uždegiminių citokinų gamybą. Patogeninėse T pagalbinėse -17 (Th17) ląstelėse MTHFD2 užkirto kelią nenormaliam transkripcijos faktoriaus FoxP3 reguliavimui ir netinkamam slopinamojo pajėgumo padidėjimui. MTHFD2 trūkumas taip pat skatino reguliavimo T (Treg) ląstelių diferenciaciją. Mechaniškai MTHFD2 slopinimas lėmė purino telkinių išeikvojimą, purino biosintetinių tarpinių produktų kaupimąsi ir sumažėjusį maistinių medžiagų jutiklio mTORC1 signalizavimą. MTHFD2 taip pat buvo labai svarbus reguliuojant DNR ir histono metilinimą Th17 ląstelėse. Svarbu tai, kad MTHFD2 trūkumas sumažino ligos sunkumą daugelyje in vivo uždegiminių ligų modelių. Taigi MTHFD2 yra metabolinis kontrolinis taškas, skirtas integruoti purino metabolizmą su patogeninių efektorinių ląstelių signalizavimu, ir yra galimas terapinis taikinys 1C metabolizmo keliuose.

ĮVADAS

Veiksmingam adaptyvaus imuninio atsako mobilizavimui reikalingas tvirtas CD4 ir T ląstelių aktyvavimas, kad ląstelės greitai augtų ir daugintųsi. Tai apima medžiagų apykaitos perprogramavimą, kurį skatina maistinių medžiagų jutiklis mTORC1, iš katabolinės ramybės būsenos į anabolinio augimo būseną, kai reikia didesnių biosintetinių, bioenergetinių ir signalizacijos poreikių. Priklausomai nuo citokinų aplinkos, CD4 ir T ląstelės diferencijuojasi į efektorinius ir reguliavimo pogrupius, turinčius skirtingas metabolines programas, skatinančias jų efektorines funkcijas (Bantug ir kt., 2018; Buck ir kt., 2015). Šių pogrupių pusiausvyra yra labai svarbi normaliam imunitetui, tuo pačiu užkertant kelią uždegiminėms ir autoimuninėms ligoms. Pavyzdžiui, išsėtinei sklerozei (IS) būdingas padidėjęs interleukiną -17 (IL- 17) gaminančių T pagalbinių -17 (Th17) ląstelių kiekis ir sumažėjęs arba neveiksmingas slopinančių reguliuojančių T (Treg) ląstelių kiekis. (Dendrou ir kt., 2015). Nukreipimas į specifines šių T ląstelių pogrupių metabolines programas siūlo alternatyvų požiūrį į imunoterapiją.

Ląstelių metabolizmu pagrįsta terapija prasidėjo 1948 m., kai buvo įrodyta, kad chemoterapiniai vaistai nuo folio rūgšties yra veiksmingi vaikams, sergantiems ūmine limfoblastine leukemija (Farber ir kt., 1948). Folio rūgštis prisideda prie vienos anglies (1C) metabolizmo purinų biosintezei, metilo donorų susidarymui ir ląstelių redokso pusiausvyros palaikymui (Ducker ir Rabinowitz, 2017; Yang ir Vousden, 2016). Daugelis vaistų, įskaitant metotreksatą (MTX), fluorouracilą (5-FU) ir merkaptopuriną (6-MP), buvo sukurti šiam būdui nukreipti. Sparčiai besidauginančios ląstelės, įskaitant vėžio ląsteles ir aktyvuotas T ląsteles, dalijasi priklausomybe nuo šių DNR ir RNR sintezės būdų. MTX tebėra dažniausiai naudojamas autoimuninėms ligoms, tokioms kaip reumatoidinis artritas (RA) gydyti (Brown ir kt., 2016). Tačiau dėl plačios tikslinių fermentų ekspresijos šios terapinės medžiagos yra susijusios su įprastu ir galimai sunkiu nepageidaujamu poveikiu. Nustačius metabolinių fermentų taikinius, kurie yra selektyviai svarbūs dominančiose ląstelių populiacijose, gali būti sukurtos saugesnės ir veiksmingesnės imunoterapijos.

1C metabolizmas apima folio ir metionino ciklus su pavienių anglies vienetų perkėlimu. Serinas yra 1C donoras, aktyvuojantis tetrahidrofolatą (THF) iki 5,10-metileno THF, kartu gaminant gliciną. 5, 10-metileno THF gali būti oksiduojamas naudojant NAD(P), kad susidarytų purino pirmtakas 10- formilTHF. Arba 10-formilTHF gali būti susintetintas iš formato ir THF priklausomai nuo ATP. Citozoliniame kelyje 10-fomilTHF gamybą skatina metilenTHF dehidrogenazė 1 (MTHFD1). Praradus MTHFD1 ląstelėms trūksta citozolinio 10-formilTHF, sumažėja purino biosintezės pajėgumas, o MTHFD1 mutacijos sukelia sunkų kombinuotą imunodeficitą (SCID) (Field ir kt., 2015). Mitochondrijų kelias priklauso nuo mitochondrijų MTHFD2 ir panašių į MTHFD{17}}(MTHFD1L).

1 pav. 1C metabolizmas ir MTHFD2 yra sureguliuoti aktyvuotame CD4^pliusasT ląstelėse ir EAE kontekste

(A) Nukleotidų metabolizmo rūšių pokytis in vitro diferencijuotoje CD4^pliusasT ląstelių pogrupiai, palyginti su naiviomis ląstelėmis, išmatuota masės spektrometrijos metodu (n=3 biologinių pakartojimų).

(B) Tikslinės CRISPR patikros darbo eiga in vivo plaučių uždegimo modelyje.

(C) gRNR gausos pokytis nuo 1C metabolizmo nukreipto in vivo CRISPR atrankos pirminiame CD4^pliusasT ląstelės (statistinė analizė atlikta MAGECK, n=3 biologinių pakartojimų).

(D) (C) identifikuotų genų mRNR ekspresija T ląstelių vystymosi ir aktyvinimo metu (duomenys iš ImmGen RNA-seq duomenų naršyklės).

(E) (C) identifikuotų genų baltymų ekspresija naiviame ir aktyvuotame CD4^pliusasT ląstelės (duomenys iš imunologinių proteomų išteklių [ImmPRes]).

(F) genų, nustatytų (C), mRNR ekspresija asmenų, turinčių nurodytų uždegiminių sutrikimų, visame kraujyje, palyginti su sveikais kontroliniais asmenimis (Aune ir kt., 2017). RA-MTX, RA gydant MTX; SRV, sisteminė raudonoji vilkligė; MS-Tx negydoma, anksčiau negydyta MS diagnozės nustatymo metu; IS nustatyta, IS gydoma ir ligos remisija; n=3–8 donorai.

(G) IHC, rodantis CD3 ir MTHFD2 dažymą pelių nugaros smegenų cauda equina segmente su simptominiu EAE 2003 (viršuje; skalės juosta, 100 mm) ir 4003 (apačioje; skalės juosta, 50 mm) padidinimu (duomenys yra tipiniai) dviejų nepriklausomų eksperimentų).

(H ir I) Santykinis (H) vidutinis fluorescencijos intensyvumas (MFI) ir (I) MTHFD2 mRNR ekspresija CD4^pliusasT ląstelės iš pelių, turinčių simptominį EAE, blužnies ir nugaros smegenų ir kontrolinių pelių blužnies (vidurkis ± SD, vienpusė ANOVA, duomenys reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus su 6 iš viso 6 biologiniais pakartojimais).

(J) MTHFD2 mRNR ekspresija nediferencijuotame CD4^pliusasT ląstelės 0, 5 ir 24 val. po aktyvavimo anti-CD3 ir anti-CD28 antikūnais (vidurkis ± SD, vienpusis ANOVA, n=3 biologinių pakartojimų).

(K) Santykinis MTHFD2 MFI per 5 dienas po aktyvacijos CD4 ir T ląstelių pogrupiuose, normalizuotas į ramybės ląsteles (vidurkis ± SD, n=3 biologinių pakartojimų). Taip pat žr. S1 pav. Statistiškai reikšmingi rezultatai pažymėti (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procentas="">

MTHFD2 yra vienas iš labiausiai indukuotų ir per daug ekspresuojamų genų visuose navikuose (Nilsson ir kt., 2014). Nors MTHFD2 yra plačiai reguliuojamas embriogenezės metu, daugumoje suaugusiųjų audinių MTHFD2 beveik nepasireiškia (Nilsson ir kt., 2014). Gydant priešvėžį (Zhu ir Leung, 2020), MTHFD2 slopinimas gali sukelti padidėjusį oksidacinį stresą (Ju ir kt., 2019; Wan ir kt., 2020), priklausomybę nuo glicino (Koufaris ir kt., 2016) ir nepakankamą. purinų sintezė (Ben-Sahra ir kt., 2016; Pikman ir kt., 2016). MTHFD2 trūkumas taip pat gali slopinti mTORC1 aktyvumą dėl kelių mechanizmų, įskaitant guanino išeikvojimą ir vėlesnį mTORC{15}}aktyvuojančios GTPazės Rheb slopinimą (Emmanuel ir kt., 2017). Dėl MTHFD2 trūkumo taip pat kaupiasi tarpiniai purino sintezės kelio produktai, įskaitant adenozino monofosfato (AMP) analogą 5-aminoimidazolo karboksamido ribonukleotidą (AICAR) (Ducker ir kt., 2016), kuris gali aktyvuoti AMP aktyvuotą baltymų kinazę (AMPK) slopinti mTORC1 (Su ir kt., 2019).

Kadangi 1C metabolizmas integruoja daugybę maistinių medžiagų ir yra terapiškai kontroliuojamas, mes ištyrėme 1C metabolizmo vaidmenį CD4.^pliusasT efektoriaus (Teff) ir Treg ląstelių pogrupiai. Atlikdami nešališką in vivo CRISPR-Cas{1}}pagrįstą tikslinę pirminių pelių T ląstelių patikrą, nustatėme, kad MTHFD2 yra sėkmingas rezultatas, kuris taip pat buvo nuolat reguliuojamas asmenims, turintiems uždegiminių sutrikimų. Pažymėtina, kad MTHFD2 trūkumas sutrikdė Teff ląstelių dauginimąsi ir funkciją. MTHFD2 trūkumas taip pat skatino nenormalią FoxP3 ekspresiją ir slopinamąjį aktyvumą Th17 ląstelėse, tuo pačiu skatindamas Treg ląstelių diferenciaciją. Šis poveikis buvo susijęs su AICAR kaupimu, sumažėjusia purino koncentracija, sumažėjusiu mTORC1 signalizacijos reguliavimu, padidėjusiu mitochondrijų metabolizmu ir pakitusiu DNR bei histono metilinimu. In vivo, nukreiptas į MTHFD2, apsaugotas nuo kelių uždegiminių ligų modelių. Šie duomenys rodo, kad MTHFD2 yra Th17 ir Treg ląstelių metabolinis kontrolinis taškas ir pabrėžia šio fermento, kaip priešuždegiminės imunoterapijos taikinio, potencialą.

REZULTATAI

1C metabolizmas ir purinų sintezė yra skirtingai aktyvūs CD4^pliusasT ląstelių pogrupiai

Iškėlėme hipotezę, kad nukleotidų sintezė CD4 gali skirtis^pliusasT ląstelių pogrupiai. CD4^pliusasT ląstelės buvo diferencijuotos in vitro į Th1, Th17 ir Treg ląsteles ir po 72 valandų surinktos masės spektrometrijai. Nukleotidų rūšių kiekiai paprastai buvo didesni visuose pogrupiuose, palyginti su naiviomis ląstelėmis (1A pav.). Pažymėtina, kad purino sintezės tarpiniai produktai buvo skirtingai gausūs, o didžiausias glicinamido ribonukleotido (GAR), 1- (fosforibozilo) imidazolo karboksamido (SAICAR) ir AICAR kaupimasis Th17 ląstelėse (S1A pav.).

Norėdami patikrinti priklausomybę nuo CD4^pliusasT ląsteles ant fermentų 1C metabolizme, atlikome in vivo CRISPR-Cas{2}}pagrįstą atranką pirminiame CD4^pliusasT ląstelės (1B pav.). Sukurta pasirinktinė orientacinė RNR (gRNR) biblioteka, skirta nukreipti į 1C metabolizmą vykstančius fermentus, kartu su gumbinės sklerozės kompleksu 2 (TSC2) kaip teigiama kontrole ir netiksliniais neigiamais kontroliniais preparatais (NTC). CD4^pliusasT ląstelės, išskirtos iš ovalbuminui (OVA) specifinių T ląstelių receptorių (TCR) transgeninių OT-II Cas9 dvigubai transgeninių pelių, buvo transdukuotos šia biblioteka ir į veną perkeltos į Rag1^{__ /__}šeimininkai. Tada pelės buvo imunizuotos intranazaline OVA, kad sukeltų plaučių uždegimą. T ląstelės, gautos iš šių pelių plaučių, buvo sekvenuotos ir nustatytas gRNR praturtėjimas arba išeikvojimas, palyginti su įvesties dažniais. TSC2 gRNR buvo praturtinta, palaikydama šio baltymo slopinamąjį vaidmenį T ląstelėse. Priešingai, PPAT, AHCY, MAT2A ir MTHFD1 gRNR buvo žymiai išeikvotos, o GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 ir MTHFD2 gRNR sumažėjo mažiau, o tai rodo, kad šie genai prisideda prie T ląstelių proliferacijos ir uždegiminės funkcijos. in vivo (1C ir S1B paveikslai).

Toliau ištyrėme ekrane nustatytų genų ekspresijos profilį. Nors besivystančiose timocituose visi buvo koordinuotai reguliuojami, MTHFD2 mRNR ir baltymai buvo stipriausiai indukuoti stimuliuojamose periferinėse T ląstelėse (1D ir 1E paveikslai). Be to, atskirai paskelbtame RNR sekos nustatymo (RNA-seq) duomenų rinkinyje, gautame iš viso kraujo asmenų, sergančių įvairiomis uždegiminėmis ir autoimuninėmis ligomis (Aune ir kt., 2017), MTHFD2 buvo nuosekliai per daug ekspresuojamas įvairiomis sąlygomis, įskaitant opinį kolitą, Krono ligą. , celiakija, RA, sisteminė raudonoji vilkligė (SRV), psoriazė, psoriazinis artritas, Sjo¨gren sindromas ir IS (1F pav.). Pažymėtina, kad asmenims, kuriems neseniai diagnozuota IS, MTHFD2 ekspresija buvo žymiai padidėjusi, palyginti su sveikais donorais arba asmenimis, sergantiems IS, kuriems buvo taikomas gydymas su ligos remisija (S1C pav.). Taigi, CD4^pliusasT ląstelių proliferacija ir išgyvenimas priklauso nuo tam tikrų 1C metabolizmo genų, o šių genų ekspresija skiriasi T ląstelių vystymosi, aktyvacijos ir diferenciacijos etapais bei patologinio uždegimo sąlygomis.

2 pav. MTHFD2 trūkumas pažeidžia CD4^pliusasT ląstelių dauginimasis ir funkcija

(A–D) Proliferacija, išmatuota pagal (A) CellTrace Violet (CTV) praskiedimą, (B) gyvybingumą, (C) CD25 ekspresiją ir (D) TF ekspresiją CD4^pliusasT ląstelių pogrupiai, apdoroti MTHFD2i 72 valandas po aktyvacijos (vidurkis ± SD, vienpusė ANOVA, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais).

MTHFD2 yra labai reguliuojamas CNS infiltruojančiame CD4^pliusasT ląstelės eksperimentiniame autoimuniniame encefalomielite (EAE) ir aktyvuotame CD4^pliusasT ląstelės in vitro

MTHFD2 reguliavimas CD4 plius T ląstelėse nebuvo gerai aprašytas. Išmatuoti MTHFD2 ekspresiją uždegiminiuose pažeidimuose in vivo, CD4^pliusasT ląstelės iš mielinui specifinių TCR transgeninių 2D2 pelių buvo aktyvuotos ir perkeltos į Rag1^{__ /__}pelėms sukelti EAE. Po to, kai pelėms prasidėjo užpakalinių kojų paralyžius, nugaros smegenų cauda equina segmentas buvo ištirtas imunohistochemijos (IHC) metodu. Pelės, gavusios 2D2 T ląsteles, parodė MTHFD2 ir CD3 praturtėjimą^pliusasląstelės, kurių kontrolėje nebuvo (1G pav.). Norėdami tiesiogiai nustatyti, ar CD4^pliusasT ląstelės padidino MTHFD2 reguliavimą uždegiminiuose pažeidimuose, T ląstelės iš pelių, kurioms buvo atliktas mielino oligodendrocitų glikoproteino (MOG) ir kokliušo toksino (PTX) sukeltas EAE modelis, blužnies ir nugaros smegenų buvo surinktos analizei. Į CNS infiltruojantis CD4^pliusasT ląstelės per daug ekspresavo MTHFD2, palyginti su suderintu blužnies CD4^pliusasT ląstelės iš kontrolinių ir EAE pelių, išmatuotos srauto citometrija (1H pav.) ir qRT-PGR (1I pav.). MTHFD2 ekspresijos kinetika CD4^pliusasToliau buvo išmatuotos T ląstelės in vitro. Tvirtas MTHFD2 mRNR reguliavimas buvo aptiktas po 5 valandų stimuliacijos ir pradėjo mažėti 24 valandas (1J pav.), o diferencijuotas CD4^pliusasT ląstelių pogrupiai pasiekė aukščiausią MTHFD2 baltymo ekspresiją praėjus 48 valandoms po aktyvavimo (1K pav.). Šie duomenys rodo, kad MTHFD2 yra padidintas CD4^pliusasT ląstelės, suaktyvintos in vitro ir uždegimo vietoje in vivo.

CD4^pliusasT ląstelių pogrupiams skirtingai reikalingas MTHFD2 aktyvacijai, proliferacijai, išgyvenimui ir citokinų gamybai

Toliau išbandėme MTHFD2 vaidmenį CD4 ir T ląstelių pogrupio aktyvavime, diferenciacijoje, proliferacijoje ir funkcijoje. CD4^pliusasT ląstelės buvo aktyvuotos in vitro esant citokinams optimaliam Th1, Th17 ir Treg ląstelių diferenciacijai ir nešikliui arba MTHFD2 inhibitoriui (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai ir kt., 2019). Po 72 valandų visuose pogrupiuose sumažėjo proliferacija (2A pav.) ir gyvų ciklo ląstelių skaičius (S2A ir S2B paveikslai). Gyvybingumas sumažėjo Th1 ir Th17 ląstelėse (2B pav.), o aktyvacija, išmatuota pagal CD25 ekspresiją, sumažėjo visuose pogrupiuose (2C pav.). Liniją apibūdinančio transkripcijos faktoriaus (TF) ekspresija buvo sumažinta Th1 ląstelėse (T-bet^pliusas), bet nepakitęs Th17 ląstelėse (ROR t^pliusas) ir minimaliai pasikeitė Treg ląstelėse (FoxP3^pliusas) (1D pav.). Norint išmatuoti Teff ląstelių funkciją, ląstelės buvo iš naujo stimuliuojamos 12-miristato 13-acetatu (PMA) ir jonomicinu. Žymiai mažiau Th1 ląstelių išreiškė interferoną-g (IFNg) ir mažiau Th17 ląstelių išreiškė IL-17, kai jos buvo diferencijuotos esant MTHFD2i (2E pav.). Tai įvyko ne dėl sutrikusio pradinio aktyvavimo, nes šie fenotipai išliko, kai vaisto poveikis buvo atidėtas iki 24 valandų po aktyvavimo, nors pagal amžių apibūdinanti TF ekspresija šioje aplinkoje nepakito (S2C – S2F paveikslai). Taigi MTHFD2 reikalingas maksimaliam CD4^pliusasT ląstelių aktyvacija, proliferacija, išgyvenimas ir citokinų gamyba.

Norėdami genetiškai patvirtinti šį farmakologinį poveikį, sukūrėme Mthfd2^fl/flpelės štamą ir sukryžmino ją su Cd4- cre transgeninėmis pelėmis, kad būtų pasiekta sąlyginė genetinė delecija. Kaip ir tikėtasi, suaktyvintas CD4^pliusasT ląstelės iš Mthfd2^fl/flCd4-cre plus (CD4^ΔMthfd2) pelėms buvo mažesnė MTHFD2 ekspresija, palyginti su ląstelėmis iš Mthfd2^fl/flCd4-cre^pliusas(laukinio tipo [WT]) vados draugai (2F pav.). Iš pradžių CD4DMthfd2 pelės turėjo šiek tiek mažiau CD4^pliusasT ląstelės blužnyje, palyginti su WT (2G pav.). Po in vitro aktyvacijos ir diferenciacijos, ląstelių skaičius ir CD4 gyvybingumas^ΔMthfd2Th17 ląstelės ir, mažesniu mastu, Treg ląstelės buvo žymiai mažesnės (2H pav.). Be to, CD25 ekspresija sumažėjo Th17 ir Treg ląstelėse, o Th1 ląstelėse sumažėjo (2I pav.). Galiausiai CD4^ΔMthfd2Th1 ir Th17 ląstelės turėjo mažesnę T-bet ir ROR t ekspresiją. Tačiau FoxP3 Treg ląstelėse nepakito (2J pav.). Nepaisant TF ekspresijos pokyčių, Teff ląstelės, kurios išsiskyrė, gamino normalų citokinų kiekį (2K pav.). Farmakologinio ir genetinio metodo rezultatų skirtumai gali būti siejami su fermentų funkcijos praradimo vystymosi metu laiku ir baigtumu bei galimais kompensaciniais mechanizmais.

MTHFD2i sukelia FoxP3 ekspresiją Th17 ląstelėse ir padidina Treg ląstelių diferenciaciją

Atsižvelgiant į Teff ląstelių priklausomybę nuo MTHFD2, išbandėme FoxP3 ir Treg ląstelių MTHFD2i reguliavimą. Pažymėtina, kad gydymo MTHFD2i sukeltas nenormalus FoxP3 reguliavimas Th1 ir dar labiau Th17 ląstelėse priklausomai nuo dozės (3A pav.). Tai taip pat atsitiko, kai gydymas buvo atidėtas iki 24 valandų po aktyvavimo (3B pav.). Panaši tendencija buvo pastebėta CD4DMthfd2 Th17 ląstelėse (3C pav.). Šis FoxP3 reguliavimas buvo funkcionalus, nes MTHFD2i apdorotos Th17 ląstelės įgijo slopinimo gebėjimą, kai buvo auginamos kartu su CD8^pliusasT ląstelės (3D pav.). Taigi MTHFD2i gali skatinti FoxP3 ir Treg ląsteles panašius fenotipus Th17 ląstelėse. MTHFD2i taip pat sustiprino sukeltų Treg ląstelių diferenciaciją. Treg ląstelės buvo diferencijuojamos naudojant įvairias transformuojančio augimo faktoriaus b (TGF-b) koncentraciją, dalyvaujant MTHFD2i. Kiekvienoje tirtoje koncentracijoje, išskyrus didžiausią, FoxP3 ekspresija padidėjo gydant MTHFD2i (3E ir 3F paveikslai). Šis fenotipas taip pat buvo išlaikytas atidėtu gydymu MTHFD2i (3G pav.).

3 pav. MTHFD2 trūkumas sukelia FoxP3 ekspresiją ir skatina perėjimą link oksidacinio fosforilinimo

(A) FoxP3 ekspresija MTHFD2i apdorotose Th1 ir Th17 ląstelėse praėjus 72 valandoms po aktyvavimo (vidurkis ± SD, vienpusė ANOVA, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais).

(B) FoxP3 ekspresija Th1 ir Th17 ląstelėse aktyvuota 24 valandas, o po to apdorota nešikliu arba 500 nM MTHFD2i 48 valandas (vidurkis ± SD, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais).

(C) FoxP3 ekspresija Th1 ir Th17 ląstelėse iš WT ir CD4DMthfd2 vadų, praėjus 72 valandoms po aktyvavimo (vidurkis ± SD, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 9 bendrais biologiniais pakartojimais).

(D) Slopinimo tyrimas, matuojantis nenormalų MTHFD2i apdorotų Th17 ląstelių slopinamąjį gebėjimą. Iš anksto apdorotos Th17 ląstelės buvo kultivuojamos kartu su CTV nudažytomis CD8 plius T ląstelėmis, kad būtų galima išmatuoti proliferaciją aktyvavus anti-CD3 ir anti-CD28 antikūnus (vidurkis ± SD, vienpusis ANOVA, n=3 biologinių pakartojimų) .

(E) FoxP3 ekspresija Treg ląstelėse, diferencijuotose su įvairiomis TGF-b koncentracijomis ir apdorotomis MTHFD2i (vidurkis ± SD, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais).

(F) Srauto citometrijos diagramos duomenims, pateiktiems (E) lentelėje.

(G) FoxP3 ekspresija Treg ląstelėse, suaktyvinta ir diferencijuota naudojant mažą TGF-b koncentraciją 24 valandas, o po to apdorota MTHFD2i 48 valandas (vidurkis ± SD, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais). ).

(H) Seahorse XF Cell Mito testas nepalankiausiomis sąlygomis, atliktas su MTHFD2i apdorotomis Th17 ir Treg ląstelėmis (vidurkis ± SD, n=3 biologinių pakartojimų).(I) Bazinis ECAR, bazinis OCR, maksimalus OCR ir bazinis OCR / ECAR santykis išmatuotas (H) (vidurkis ± SD, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus su 6 iš viso biologiniais pakartojimais). Statistiškai reikšmingi rezultatai pažymėti (* p < 0.05, ** p < 0.{11}}1, *** p < 0,001, **** p proc. 0,001).

Trego ląstelės turi didesnį mitochondrijų metabolizmą nei Th17 ląstelės (Michalek ir kt., 2011). Norint nustatyti gydymo MTHFD2i metabolines pasekmes, Th17 ir Treg ląstelės buvo įvertintos ekstraląstelinio srauto analizėmis. MTHFD2i padidino Th17 ląstelių bazinį ir maksimalų deguonies suvartojimo greitį (OCR), kad parodytų poslinkį į mitochondrijų kvėpavimą (3H pav.). Ir atvirkščiai, gydant MTHFD2i Th17 ir Treg ląstelių bazinis ekstraląstelinis rūgštėjimo greitis (ECAR) sumažėjo, o tai rodo sumažėjusią glikolizę (3I pav.). Bazinis OCR ir ECAR santykis buvo žymiai padidintas Th17 ir Treg ląstelėse, nes MTHFD2i perkėlė metabolinę programą nuo glikolizės link oksidacinio fosforilinimo. Šie duomenys rodo, kad MTHFD2i sustiprina FoxP3 ekspresiją Th17 ląstelėse ir Treg ląstelėse, diferencijuotose žemomis TGF-b sąlygomis, ir perkelia Th17 ląsteles į labiau Treg ląstelių metabolizmą.

MTHFD2 trūkumas žmogaus CD4 ir T ląstelėse sumažina Th17 ląstelių proliferaciją ir gyvybingumą, tuo pačiu padidindamas FOXP3 ekspresiją ir slopindamas mTORC1 aktyvumą

Norint patikrinti aukščiau pateiktų radinių pritaikymą žmogaus ląstelėms, CD4^pliusasT ląstelės, išskirtos iš sveikų donorų periferinio kraujo, in vitro buvo diferencijuotos į Th1, Th17 ir Treg ląsteles ir nuo aktyvavimo momento apdorotos nešikliu arba MTHFD2i. Proliferacija žymiai sumažėjo MTHFD2i apdorotose Th17 ir Treg ląstelėse (4A pav.), o Th17 ląstelėse taip pat buvo padidėjusi apoptozė (4B pav.). Sumažėjęs proliferacija Th17 ląstelėse buvo apibendrintas naudojant genetinį metodą, naudojant mažą trukdančią RNR (siRNR) (4C ir S2G paveikslai). Panašiai kaip pelių ląstelėse, FOXP3 ekspresija buvo didesnė MTHFD2i apdorotose žmogaus Th17 ląstelėse ir buvo didesnė MTHFD2i apdorotose žmogaus Treg ląstelėse (4D ir S2H paveikslai). Atsižvelgiant į tai, kad mTORC1-AMPK ašis yra labai svarbi Th17 ir Treg ląstelių diferenciacijai, taip pat buvo išmatuotas mTORC1 tikslinio ribosomų baltymo S6 (fosfo-S6) fosforilinimas. Tai parodė sumažėjusį mTORC1 aktyvumą Th17 ląstelėse su MTHFD2i arba siMTHFD2 (4E pav.). Taigi, proliferacinio pajėgumo praradimas ir FOXP3 ekspresijos indukcija Th17 ir Treg ląstelėse gali būti apibendrinta pirminiame žmogaus CD4^pliusasT ląstelės.

4 pav. MTHFD2 trūkumas pablogina proliferaciją ir sukelia FOXP3 ekspresiją žmogaus Th17 ląstelėse

(A) Proliferacija, išmatuota CTV praskiedimu žmogaus CD4 ir T ląstelių pogrupiuose, apdorotuose nešikliu arba 2 mM MTHFD2i 72 valandas po aktyvacijos anti-CD3 ir anti-CD28 antikūnais (suporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 5 – 6 sveiki donorai).

(B) Apoptozė, išmatuota aneksinu V žmogaus CD4 ir T ląstelėse, apdorotose MTHFD2i 72 valandas (suporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 5–6 sveikais donorais).

(C) Ki-67 ekspresija žmogaus CD4 ir T ląstelėse, transdukuotose NTC arba siMTHFD2 (suporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 4 sveikais donorais).

(D) FOXP3 ekspresija žmogaus CD4 ir T ląstelėse, apdorotose MTHFD2i 72 valandas (suporuotas t testas, duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus su 6–10 sveikų donorų).

(E) Fosfo-S6 ekspresijos pokytis žmogaus CD4 ir T ląstelėse, apdorotose MTHFD2i 72 valandas arba transdukuotose siMTHFD2 (vidurkis ± SD, vieno mėginio t testas, trijų nepriklausomų eksperimentų su 4–6 sveikais donorais duomenys). Statistiškai reikšmingi rezultatai pažymėti (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procentas="">

T ląstelės priklauso nuo MTHFD2 fermentinės funkcijos, o fenotipus gali išgelbėti produktas

MTHFD2 reikalingas mitochondrijų formiatų telkiniui palaikyti purinų sintezei (Ma ir kt., 2017), tačiau gali atlikti ir nefermentinius vaidmenis. Palaikydamas esminį fermentinį aktyvumą, gydymas MTHFD2i paskatino kompensacinį formato pasisavinimą iš terpės CD4 ir T ląstelių pogrupiuose (5A pav.). Formiato sintezei naudojamas 1C vienetas gaunamas seriną paverčiant glicinu ir kaupiasi viduląstelinis serinas, o glicinas buvo išeikvotas gydant MTHFD2i visuose pogrupiuose (5B pav.). Metionino koncentracija taip pat šiek tiek padidėjo, o tai rodo, kad metionino ciklas slopinamas. Kaip ir tikėtasi, atsižvelgiant į tai, kad serino-glicino konversijos etapas yra prieš MTHFD2, šie pokyčiai nebuvo išgelbėti terpėje pateikiant formiatą.

5 pav. MTHFD2i poveikį T ląstelių pogrupiams gelbsti egzogeninis formiatas

(A) Formatų įsisavinimas, išmatuotas 1 H magnetinio rezonanso spektroskopija (MRS) CD4 ir T ląstelių pogrupiuose, apdorotuose nešikliu arba 500 nM MTHFD2i 72 valandas po aktyvavimo (vidurkis ± SD, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus su 6 iš viso biologiniais pakartojimais).

(B) Serino, glicino ir metionino koncentracijų pokytis CD4 ir T ląstelėse, apdorotose 500 nM MTHFD2i arba 500 nM MTHFD2i plius 1 mM formiatu 4–6 valandas, palyginti su nešikliu, matuojamas masės spektrometrijos metodu (vidurkis ± SD, n { {8}} biologinių pakartojimų).

(C) Gyvų ląstelių skaičius, gyvybingumas ir CD25 ekspresija MTHFD2i apdorotose CD4 plius T ląstelėse, išgelbėtose 1 mM formato arba 60 mM adenino ir guanino purino tirpalu 72 valandas po aktyvacijos (vidurkis ± SD, vienpusė ANOVA, duomenys yra trijų nepriklausomų eksperimentų su 9 iš viso biologiniais pakartojimais atstovas).

(D) gyvų ląstelių skaičius, gyvybingumas ir CD25 ekspresija CD4 plius T ląstelėse iš WT arba CD4DMthfd2 vados, išgelbėtų su formiatu arba purinais 72 valandas po aktyvacijos (vidurkis ± SD, vienpusis ANOVA, n=3 biologinių pakartojimų ).

Toliau išbandėme, ar formiato arba adenino ir guanino purino tirpalo pridėjimas gali išgelbėti nepakankamą fermentinę funkciją ir pakeisti MTHFD2 trūkumo pasekmes. Iš tiesų, 1 mM formiatas atkūrė MTHFD2i apdorotų ląstelių proliferaciją, gyvybingumą ir aktyvaciją (5C pav.). Purino papildymas išgelbėjo proliferaciją visuose pogrupiuose ir aktyvaciją Th1 ir Th17 ląstelėse, bet ne gyvybingumą visuose pogrupiuose ir aktyvaciją Treg ląstelėse. Formatas taip pat išgelbėjo CD4 dauginimąsi, gyvybingumą ir aktyvavimą^ΔMthfd2T ląstelės (5D pav.). Sutrikusi citokinų gamyba MTHFD2i apdorotose Th1 ir Th17 ląstelėse buvo pakeista į nešiklio kiekį pridedant formato arba purino (5E pav.). Pažymėtina, kad nenormalus FoxP3 reguliavimas Th17 ląstelėse buvo išgelbėtas pridedant purino, bet ne į formiatą, tuo tarpu formiatas ir purinas sumažino FoxP3 ekspresiją iki pradinės Treg ląstelėse, diferencijuotose su maža TGF-b koncentracija (5F pav.). Atrodo, kad MTHFD2i fenotipai priklauso nuo MTHFD2 palaikymo mitochondrijų formiatuose arba purino telkiniuose.

MTHFD2 reguliuoja mTORC1 aktyvumą ir DNR bei histono metilinimą CD4^pliusasT ląstelės

Įamžintose vėžio ląstelėse dėl MTHFD2 trūkumo gali kauptis tarpiniai purino sintezės produktai GAR, SAICAR ir AICAR, kurie yra prieš 10- formilTHF sukeltą formilinimo etapus (Ducker ir kt., 2016). CD4^pliusasT ląstelių pogrupiai buvo kultivuojami 72 valandas prieš 4–6 valandas veikiant MTHFD2i. Šis trumpas laiko tarpas buvo pasirinktas siekiant išvengti antrinio poveikio, įskaitant kompensacinius pokyčius. Dėl laikino gydymo MTHFD2i visuose pogrupiuose susikaupė GAR, SAICAR ir AICAR (6A pav.). Šis poveikis buvo visiškai išgelbėtas pridedant 1 mM formiato, palaikančio fermentinį MTHFD2 vaidmenį. Nukleotidai ir nukleobazės, įskaitant guaniną, taip pat buvo išeikvoti dėl MTHFD2i ir išgelbėti formato Th17 ir Treg ląstelėse (6B pav.).

6 pav. Dėl MTHFD2i kaupiasi purino sintezės tarpiniai produktai, slopina mTORC1 aktyvumą ir pakitusi DNR ir histono metilinimas

(A) GAR, SAICAR ir AICAR koncentracijų pokytis CD4 ir T ląstelėse, apdorotose 500 nM MTHFD2i arba 500 nM MTHFD2i plius 1 mM formiatu 4–6 valandas, palyginti su nešikliu, matuojant masės spektrometrija (vidurkis ± SD, vienas būdas ANOVA, n=3 biologinių pakartojimų).

(B) Nukleotidų metabolizmo rūšių pokytis Th17 ir Treg ląstelėse, apdorotose MTHFD2i su formiatu arba be jo 4–6 valandas, palyginti su nešikliu, matuojamas masės spektrometrija (n=3 biologinių pakartojimų).

(C) Fosfo-S6, S6, Rheb, fosfo-ACC, ACC, HIF-1a ir b-aktino imunoblotas CD4 ir T ląstelėse, apdorotose MTHFD2i su formiatu arba be jo 72 valandas po aktyvavimo (duomenys trijų nepriklausomų eksperimentų su n=3 biologinių pakartojimų atstovas).

(D) TCA ciklo metabolitų pokytis Th17 ląstelėse, apdorotose MTHFD2i su formiatu arba be jo 6 valandas, palyginti su nešikliu, matuojamas masės spektrometrijos metodu (vidurkis ± SD, vienpusis ANOVA, n=3 biologinių pakartojimų).

(E) H3K27me3 ir IgG kontrolės santykio šilumos žemėlapiai ±10- kb regionuose aplink UCSC žinomų genų promotorius Th17 ir Treg ląstelėse, apdorotose MTHFD2i, išmatuota CUT&RUN (duomenys surinkti iš 3 biologinių pakartojimų).

(F) Foxp3 lokuso vidutinio DNR metilinimo dažnio šilumos žemėlapis pagal CpG vietą Th1 ir Th17 ląstelėse, apdorotose nešikliu arba 500 nM MTHFD2i, ir nTreg ląstelėse iš WT arba CD4DMthfd2 vados draugų (Mūdo testas, n=3 biologinių pakartojimų).

(G) (F) lentelės sudarymas pagal proksimalinį promotorių, distalinį promotorių ir TSDR (suporuotas t testas). Taip pat žr. S3 ir S4 paveikslus. Statistiškai reikšmingi rezultatai pažymėti (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procentas="">

AICAR ir nukleotidai yra nustatyti mTORC{0}}AMPK ašies reguliatoriai (Emmanuel ir kt., 2017; Kim ir kt., 2016). Iš tiesų, fosfo-S6 ekspresija buvo sumažinta gydant MTHFD2i visuose pogrupiuose ir visiškai atkurta pridedant formato (6C ir S3A paveikslai). GTP surišantis baltymas Rheb, privalomas mTORC1 aktyvatorius, gali būti jautrus intraceluliniam guanino prieinamumui (Emmanuel ir kt., 2017), o Rheb ekspresija buvo prislopinta gydant MTHFD2i (6C ir S3B paveikslai). AICAR yra adenozino analogas ir AMPK aktyvatorius (Rae ir Mairs, 2019; Su ir kt., 2019). Tačiau praėjus 72 valandoms po aktyvacijos, AMPK ar jo taikinių, acetil-kofermento A(CoA) karboksilazės (fosfo-ACC) ir Unc-51-pavyzdžiui, autofagiją aktyvinančios kinazės (fosfo-ULK1) fosforilinimas, gydant MTHFD2i, nepasikeitė. (6C, S3C ir S3D pav.). mTORC1 aktyvumas skatina Th17 ir iš dalies susilpnina Treg ląstelių diferenciaciją indukuodamas nuo HIF-1a priklausomą glikolitinį metabolizmą (Shi ir kt., 2011). Atsižvelgiant į tai, HIF-1a ekspresija sumažėjo MTHFD2i apdorotose ir CD4DMthfd2 Th17 ląstelėse (6C, S3E ir S3F pav.). Šie mTORC1 aktyvumo pokyčiai nebuvo susiję su jokiu TCR signalizacijos trūkumu, matuojant Nur77 ekspresija su pakartotine stimuliacija ir be jos (S3G pav.). Signalo keitiklis ir transkripcijos 3 (STAT3) aktyvatorius, kuris yra labai svarbus Th17 ląstelių vystymuisi, nepakito arba šiek tiek padidėjo gydant MTHFD2i (S3H pav.). Sumažėjęs mTORC1 aktyvumas ir perėjimas nuo glikolizės link oksidacinio fosforilinimo gydant MTHFD2i parodė santykinio trikarboksirūgšties (TCA) ciklo metabolitų gausos pokyčius. Sukcinato ir fumarato koncentracijas žymiai sumažino MTHFD2i, tačiau ją išgelbėjo formiatas (6D pav.).

TCA metabolitai yra žinomi DNR ir histono demetilazių inhibitoriai (Su ir kt., 2016), o sukcinato ir fumarato telkinių išeikvojimas gali palaikyti hipometilintą būseną. H3K27 trimetilinimas (H3K27me3) visame genome buvo išmatuotas CUT&RUN (skilimas po taikiniais ir atpalaidavimas naudojant nukleazę) seka (Skene ir Henikoff, 2017). Iš tiesų, MTHFD2i apdorotos Th17 ląstelės sumažino H3K27me3, palyginti su nešikliu (6E ir S4A paveikslai). DNR metilinimas Foxp3 lokuse taip pat buvo matuojamas bisulfato sekos nustatymu, siekiant nustatyti, ar diferencinis metilinimas prisidėjo prie MTHFD2i sukelto FoxP3 reguliavimo. Nors keli CpG lokusai skyrėsi metilinimo dažniu tarp nešiklio ir MTHFD2i sąlygų, Treg ląstelių specifiniame demetiluotame regione (TSDR) nebuvo pastebimo modelio. Taip pat nebuvo skirtumų tarp nTreg ląstelių (CD4 ir CD25 plius), išskirtų iš WT ir CD4DMthfd2 pelių (6F pav.), nors kiekvienos praturtintos populiacijos grynumas buvo mažas (S4B pav.). Tačiau MTHFD2i apdorotose Th17 ląstelėse žymiai sumažėjo DNR metilinimo dažnis per Foxp3 proksimalinį promotoriaus regioną, palyginti su nešikliu (6G pav.), o tai rodo galimą transkripcijos su MTHFD2i padidėjimą.

Be to, kad palaiko tarpląstelinį formato telkinį, MTHFD2 aktyvumas prisideda prie ląstelių redokso pusiausvyros, konvertuodamas NAD.^pliusasNADH ir NADP^pliusasį NADPH (Shin ir kt., 2017) ir palaiko transsulfuracijos kelią bei vėlesnę glutationo sintezę. MTHFD2i apdorotose Th17 ląstelėse sumažėjo NAD koncentracija^pliusas, NADH, NADP^pliusasir NADPH, kuris buvo išgelbėtas su formatu (S4C pav.). Tačiau NAD^pliusas/NADH ir NADP^pliusas/NADPH santykiai nepakito visomis sąlygomis. Tai, kartu su ląstelių reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ir mitochondrijų superoksido pokyčių stoka (S4D pav.), rodo, kad redokso būsenos pokyčiai greičiausiai nebus pagrindinis MTHFD2i fenotipo veiksnys.

MTHFD2 trūkumas in vivo sumažina daugelio uždegiminių ligų sunkumą

MTHFD2, kaip terapinio taikinio, veiksmingumas vėliau buvo išbandytas naudojant in vivo nuo T ląstelių priklausomą uždelsto tipo padidėjusio jautrumo (DTH) modelį. Pelės buvo imunizuotos ir užkrėstos ant ausies rakto skylutės hemocianinu (KLH), kad sukeltų vietinį uždegimą, ir gydomos geriamuoju nešikliu arba MTHFD2i. Gydymas neparodė akivaizdaus toksiškumo, nes gyvūnai išlaikė savo svorį (S5A pav.). Svarbu tai, kad ausų storis ir svoris padidėjo kontrolinėse DTH pelėse, bet ne inhibitoriais gydytiems gyvūnams, o tai rodo apsaugą nuo uždegimo gydant MTHFD2i (7A, 7B ir S5B paveikslai). KLH specifinis imunoglobulinas G (IgG) taip pat sumažėjo vartojant didžiausią inhibitorių dozę, o tai rodo galimą poveikį, apimantį B ląstelių funkciją (7C pav.).

7 pav. Taikymas į MTHFD2 in vivo sumažina ligos sunkumą DTH, EAE ir IBD modeliuose

(A ir B) Santykinis ausies storis (A) ir (B) biopsijos svoris praėjus 1 0 d. po KLH su CFA imunizacijos ir 3 dienos po KLH užkrėtimo, siekiant sukelti DTH (vienpusė ANOVA). Pelės buvo gydomos du kartus per dieną geriamuoju 0, 100 arba 300 mg/kg MTHFD2i (vidurkis ± SEM, n=8 biologinių pakartojimų).

(C) KLH specifinės IgG koncentracijos 10 KLH sukelto DTH dieną (vidurkis ± SEM, Kruskal-Wallis testas, n=8 biologinių pakartojimų).

(D) Vidutinis klinikinis balas laikui bėgant WT ir CD4DMthfd2 vados, imunizuotos MOG su CFA ir PTX, siekiant sukelti EAE (vidurkis ± SEM, keli Mann-Whitney testai, duomenys reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus, kurių kiekvienas turi 5 biologinius pakartojimus).

(E) Ląstelių skaičius ir CD4 plius T ląstelių dažnis EAE pelių nugaros smegenyse esant didžiausiam ligos sunkumui (vidurkis ± SEM, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais).

(F) CD25 ir CD44 ekspresija CD4 ir T ląstelėse iš EAE pelių nugaros smegenų (vidurkis ± SEM, nesuporuotas t testas, n=4 biologinių pakartojimų).

(G ir H) ląstelių skaičius (G) T-bet plius , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plius santykis, FoxP3 plius /RORgt plius santykis ir (H) IL-17 plus , IFNg plius ir IL-17 plius IFNg plius CD4 plius T ląstelės iš EAE pelių nugaros smegenų (vidurkis ± SEM, nesuporuotas t testas, duomenys reprezentuoja du nepriklausomus eksperimentus su 9 iš viso biologiniais pakartojimais).

(I) H&E, anti-CD3 IHC ir Luxol Fast Blue (LFB) dažymas mielinui WT pelės nugaros smegenyse be imunizacijos ir WT bei CD4DMthfd2 vados, sergančios EAE ligos piko metu (2003 m. padidinimas, reprezentuojantis 5 biologinius pakartojimus ).

(J) Kūno svorio pokytis per Rag1 laiką^__/__pelėms buvo sušvirkšta ip su WT arba CD4DMthfd2 naiviomis CD4 plius T ląstelėmis, kad sukeltų IBD kolitą (vidurkis ± SEM, keli t testai, n=8 biologinių pakartojimų).

(K ir L) (K) bendro CD4 plius T ląstelių ir (L) T-bet plus , RORgt plus ir FoxP3 plius CD4 plius T ląstelių skaičius iš IBD pelių MLN (vidurkis ± SEM, nesuporuotas t testas n { {4}} biologinių pakartojimų). Taip pat žr. S5 ir S6 paveikslus. Statistiškai reikšmingi rezultatai pažymėti (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procentas="">

Panašiai, dvigubas MTHFD1/2 inhibitorius LY345899 (Gustafsson ir kt., 2017) buvo veiksmingas gydant ligą EAE modelyje. EAE buvo sukeltas MOG ir PTX, o pelės kasdien buvo gydomos intraperitonine (ip) DMSO arba LY345899 injekcija. Gydymas inhibitoriais žymiai sumažino ligos sunkumą ir bendrą klinikinį balą, palyginti su nešikliu (S5C ir S5D paveikslai). Pelės buvo nužudytos 26 dieną, o stuburo smegenis infiltruojančios ląstelės buvo surinktos imuniniam profiliavimui. Pažymėtina, kad žymiai mažiau CD45^pliusas, CD4^pliusasir CD8^pliusasląstelės įsiskverbė į LY345899-gydytų pelių nugaros smegenis (S5E–S5G pav.). ROR t dažnio pokyčių nebuvo^pliusasarba FoxP3^pliusasląstelės tarp infiltruojančio CD4^pliusasT ląstelės (S5H pav.). Tačiau sumažėjo IFNg ir IL-17 plius ląstelių dažnis ir padidėjo IL-17 plius ląstelių skaičius (S5I pav.), o tai rodo galimą perėjimą prie mažiau patogeniško fenotipo.

Norint tiesiogiai patikrinti T ląstelių vidinę priklausomybę nuo MTHFD2 in vivo, WT ir CD4DMthfd2 vados draugams buvo taikomi trys skirtingi modeliai: EAE, uždegiminė žarnyno liga (IBD) ir alerginė kvėpavimo takų liga. EAE vėl buvo sukeltas MOG ir PTX, ir, panašiai kaip ir inhibitorių eksperimente, CD4DMthfd2 pelėms per 26 dienas buvo žymiai sumažintas ligos sunkumas (7D pav.). Atskira kohorta buvo eutanizuota esant didžiausiai ligos stadijai 15 dieną po T ląstelių fenotipų nustatymo (S6A ir S6B paveikslai). Nors CD4^pliusasarba CD8^pliusasT ląstelių skaičius blužnyje nepakito (S6C pav.), CD4 ir T ląstelių infiltracija į nugaros smegenis buvo žymiai sumažinta (7E pav.). Nugaros smegenis infiltruojančios CD4 plius T ląstelės CD4DMthfd2 pelėse turėjo panašią CD25 ekspresiją kaip WT, bet sumažino CD44 ekspresiją, o tai rodo iš dalies sutrikusią aktyvaciją (7F pav.). T-statymo skaičiai^pliusas, ROR t plus ir FoxP3 plus ląstelės (7G pav.), taip pat IL -17 plus ir IFNg plus ląstelės (7H pav.), taip pat sumažėjo CD4DMthfd2 pelių nugaros smegenyse, palyginti su WT. Pažymėtina, kad FoxP3 plus ir T-bet plus ir RORgt plus ląstelių santykis buvo padidėjęs CD4DMthfd2 pelėms, palyginti su WT ligos piko metu, atspindėdamas in vitro padidėjusios FoxP3 ekspresijos ir MTHFD2 trūkumo rezultatus (7G pav.). Nors TF ekspresuojančių ląstelių dažnis tarp infiltruojančių ląstelių apskritai buvo didesnis, citokinų ekspresijos dažnis nepakito (S6D ir S6E paveikslai). Kontrolinių pelių, neturinčių EAE ir WT bei CD4, nugaros smegenų histologija^ΔMthfd2pelėms, turinčioms EAE, WT pelių nugaros smegenyse padidėjo ląstelė ir CD3 pozityvumas, kuris buvo susijęs su demielinizacija, kaip rodo Luxol Fast Blue dažymas (7I pav.). Šių pokyčių nebuvo EAE kontrolėje ir CD4^ΔMthfd2pelėms.

Toliau MTHFD2 vaidmuo buvo išbandytas IBD ir alerginių kvėpavimo takų ligų modeliuose. WT ir CD4DMthfd2 naivios CD4 plius T ląstelės buvo perkeltos į Rag1 / recipientus, kad būtų pradėtas IBD. Nors pelės, gavusios WT ląsteles, pradėjo mesti svorį progresuojant IBD, CD4DMthfd2 T ląstelių gavėjai ir toliau augo (7J pav.). Žymiai mažiau CD4DMthfd2 T ląstelių skaičiaus ir dažnio buvo rasta blužnyje (S6F pav.) ir mezenteriniuose limfmazgiuose (MLN), išsausinančiuose gaubtinę žarną (7K ir S6G paveikslai). T-bet plus , ROR t plus ir FoxP3 plus CD4DMthfd2 T ląstelių skaičius taip pat sumažėjo MLN, tačiau FoxP3 plus ląstelių dažnis padidėjo (7L ir S6H paveikslai). Tačiau šiuo vėlyvojo etapo laiko momentu FoxP3 / T-bet ir FoxP3 / RORgt ląstelių skaičiaus santykis MLN nesiskyrė (S6I pav.). Panašiai kaip buvo nustatyta, kad MTHFD2 buvo nedidelis in vivo kvėpavimo takų uždegimo CRISPR ekrano smūgis (1C pav.), CD4DMthfd2 pelėms, kurioms buvo nustatyta Alternaria sukelta alerginė kvėpavimo takų liga, sumažėjo neutrofilų gausa bronchų alveolių plovimo skystyje (BALF), nors ir nebuvo. buvo pastebėti BALF limfocitų, eozinofilų ir makrofagų skaičiaus pokyčiai (S7A pav.).

Galiausiai buvo patikrintas MTHFD2i poveikis bendram imuniniam aktyvumui. OVA specifinis OT-II CD45.2^pliusasCD4^pliusasT ląstelės buvo perkeltos į CD45.1^pliusaspelėms, kurios vėliau buvo imunizuotos po oda OVA emulsija su pilnu Freundo adjuvantu (CFA) ir kasdien gydomos geriamuoju nešikliu arba MTHFD2i. Kūno svoris nepakito visomis sąlygomis (S7B pav.). Perduoto OT-II CD išplėtimas45.2^pliusasląstelės buvo šiek tiek atidėtos imunizuotoms MTHFD2i gydomoms pelėms, tačiau iki 7 dienos pasiekė transporto priemonių skaičių (S7C – S7E paveikslai). Tačiau IFNg plius ląstelių dažnis buvo sumažintas drenuojant LN (S7F pav.). Šie duomenys rodo, kad in vivo gydymas MTHFD2i leidžia antigenui specifinį T ląstelių išsiplėtimą po ūminės stimuliacijos, nors ir slopinama uždegiminių citokinų gamyba.

DISKUSIJA

T ląstelių aktyvacijai, diferenciacijai ir funkcijai reikalingas tinkamas medžiagų apykaitos perprogramavimas, kad būtų patenkintas padidėjęs ląstelių energijos, biosintetinių statybinių blokų ir signalinių molekulių poreikis. Šiame tyrime mes ištyrėme 1C metabolizmo funkciją pirminėse CD4 ir T ląstelėse. Naudojant in vivo pirminių T ląstelių CRISPR pagrįstų atrankos ir genų ekspresijos duomenų derinį, MTHFD2 buvo nustatytas kaip galimas priešuždegiminės terapijos taikinys. MTHFD2 slopinimas arba trūkumas paprastai sumažino CD4 ir T ląstelių proliferaciją. Pažymėtina, kad tai buvo susiję su FoxP3 ekspresijos indukcija ir slopinančia funkcija Th17 ląstelėse, taip pat su sustiprinta Treg ląstelių diferenciacija. Šie duomenys rodo, kad MTHFD2 gali veikti kaip medžiagų apykaitos kontrolinis taškas Th17-Treg ląstelių ašyje, o gydymas MTHFD2i sukuria pusiausvyrą nuo patogeninio prie labiau priešuždegiminio fenotipo. Iš tiesų, MTHFD2 slopinimas arba genetinis trūkumas sumažino ligos sunkumą keliuose in vivo autoimuninio ir padidėjusio jautrumo modeliuose.

1C metabolizmas susideda iš serino-glicino metabolizmo, folatų ciklo ir metionino ciklo ir yra pagrindinis keliuose procesuose, įskaitant de novo purino sintezę, metilo donorų generavimą ir redokso reguliavimą (Yang ir Vousden, 2016). 1C metabolizmas yra stipriai susijęs su TCR stimuliacija (Tan ir kt., 2017) ir reikalingas T ląstelių plėtrai palaikyti (Ma ir kt., 2017). Folio ciklas yra padalintas į citozolinius ir mitochondrinius komponentus. Citozolyje MTHFD1 paverčia 5, 10-metileno THF, 10-formilTHF ir formatu. Mitochondrijose tas pačias reakcijas atlieka MTHFD2 ir MTHFD1L. Šie gauti tarpiniai produktai naudojami formilinimo etapams palaikyti de novo purino sintezėje. MTHFD1 ir MTHFD2 taip pat gali moduliuoti redokso būseną per NAD(H) ir NADP(H) generavimą (Ducker ir Rabinowitz, 2017). Nors kai kurie ląstelių tipai pasižymi lankstumu pereinant prie citozolinio šaltinio esant mitochondrijų kelio disfunkcijai (Ducker ir kt., 2016), anksčiau buvo pasiūlyta, kad T ląstelės daugiausia priklausys nuo mitochondrijų kelio, kad gautų 1C vienetus ir redukcines rūšis (Ron- Harel ir kt., 2016). Taip pat buvo įrodyta, kad T ląstelės priklauso nuo serino įsisavinimo, o in vivo imuninį atsaką galima modifikuoti serino kiekiu su maistu. Serino bado poveikis yra susijęs su purino biosintezės ribojimu net esant nepažeistiems gelbėjimo keliams ir gali būti apeinamas tiekiant gliciną ir formatą (Ma ir kt., 2017). Mūsų duomenys papildo šias išvadas ir nurodo MTHFD2 kaip kritinį reguliatorių, turintį įtakos CD4^pliusasT ląstelių proliferacija ir diferenciacija.

Echanikozidas

Nors 1C metabolizmas vaidina didelį vaidmenį ląstelių metabolizme, mes nustatėme, kad kai kurios funkcijos buvo skirtingos, kad pasirinktų T ląstelių pogrupius. Visos žmogaus ir pelės T ląstelės proliferavo mažesniu mastu dėl MTHFD2 trūkumo, o tai rodo bendrą MTHFD2 funkciją palaikyti T ląstelių augimą ir dalijimąsi. Tačiau MTHFD2 trūkumo poveikis T ląstelių diferenciacijai ir efektoriaus funkcijai skyrėsi kiekviename išbandytame pogrupyje. Th1 ląstelėse buvo sutrikusi diferenciacija, sumažėjusi T-bet indukcija ir sumažėjusi citokinų gamyba. Th17 ląstelės taip pat turėjo pakitusią diferenciaciją ir sumažėjusią citokinų gamybą. Nors ROR t nepasikeitė, MTHFD2-trūkumo Th17 ląstelės padidino Treg ląstelių TF FoxP3 reguliavimą ir įgijo gebėjimą slopinti aktyvuotų CD8 ir T ląstelių proliferaciją. Trego ląstelės pasižymėjo didesne diferenciacija žemomis TGF-b sąlygomis. Dabar gerai žinoma, kad kiekvienas iš šių pogrupių gali turėti skirtingus medžiagų apykaitos poreikius (Bantug ir kt., 2018; Buck ir kt., 2015). Mūsų duomenys rodo, kad MTHFD2 taip pat selektyviai reikalingas Teff ląstelėms, skatinant Treg ląstelių likimą ir funkciją. Pastebėtina, kad šie rezultatai skiriasi nuo GLUT1, GLS ar ASCT2 trūkumų, kurie pablogina arba keičia Teff ląstelių diferenciaciją, o turi nedidelį poveikį tiesiogiai skatinant Treg ląstelių diferenciaciją arba Th17 transdiferenciaciją į Treg ląsteles (Johnson ir kt., 2018; Macintyre ir kt. ., 2014; Nakaya ir kt., 2014).

Atrodo, kad šie skirtingi T ląstelių likimai priklauso nuo MTHFD2 fermentinio aktyvumo, nes MTHFD2 trūkumo poveikis buvo išgelbėtas naudojant formato arba purino nukleobazes. Nors mes neradome jokio reikšmingo pakitusio redokso balanso poveikio su MTHFD2 trūkumu, pakitusi de novo purino sintezė atrodo labai svarbi. Gydymas MTHFD2i sumažino purino, ypač guanino, koncentraciją, tuo pačiu skatindamas tarpinių purino sintezės produktų GAR, SAICAR ir AICAR kaupimąsi. Šiems tarpiniams produktams reikalingas formilinimas tolesnei biosintezei, o poveikis buvo išgelbėtas, kai į terpę buvo pridėtas MTHFD 2- gautas metabolitas formiatas, palaikant tikslinį MTHFD2i biocheminį mechanizmą. De novo nukleotidų sintezė, palaikanti DNR ir RNR sintezę, yra būtina T ląstelių proliferacijai (Que´me´ neur ir kt., 2003, 2004). Taigi, atrodo, kad mechanizmo, kuriuo MTHFD2i pažeidžia T ląstelių išsiplėtimą, komponentas yra nepakankamas nukleotidų generavimas.

Flavonoidas

Nesugebėjimas susintetinti tinkamų nukleotidų gali slopinti efektorines T ląsteles įvairiais mechanizmais. AMPK ir mTORC1 yra pagrindiniai metabolinio perprogramavimo varikliai, kurių vaidmenys Teff ir Treg ląstelėse paprastai yra priešingi (Bantug ir kt., 2018; Buck ir kt., 2015). Mes parodome, kad gydymas MTHFD2i T ląstelėse paskatino ūmų AICAR, metabolito, žinomo kaip adenozino analogas ir AMPK aktyvatorius, kaupimąsi (Rae ir Mairs, 2019; Su ir kt., 2019). Tačiau pasirinktais laiko momentais nebuvo padidėjusio AMPK aktyvumo įrodymų. Tai gali atspindėti papildomą AMPK reguliavimą, tačiau AICAR taip pat gali turėti nuo AMPK nepriklausomą poveikį (Dembitz ir kt., 2019). mTORC1 taip pat jautrus purinų koncentracijai, nes sumažėjęs guanino prieinamumas slopina mTORC1 aktyvatoriaus Rheb aktyvumą (Emmanuel ir kt., 2017; Hoxhaj ir kt., 2017). Taigi AICAR kaupimasis ir mTORC1 aktyvumo sumažėjimas gali prisidėti prie sutrikusio MTHFD2i apdorotų Th1 ir Th17 ląstelių susidarymo ir sustiprinto Treg ląstelių susidarymo. MTORC1 signalizacijos slopinimas taip pat gali prisidėti prie metabolinės programos perėjimo nuo glikolizės prie mitochondrijų kvėpavimo ir pakitusio TCA metabolitų gausos MTHFD2i apdorotose Th17 ląstelėse. mTORC1 kelias atlieka pagrindinį vaidmenį skatinant anabolinį metabolizmą ir gali paskatinti TF ATF4 kaupimąsi, o tai savo ruožtu gali sukelti MTHFD2 ekspresiją (Ben-Sahra ir kt., 2016).

Metabolinis srautas yra susijęs su epigenetiniu reguliavimu, nes metabolitai prisideda prie daugelio epigenetinių modifikacijų (Sharma ir Rando, 2017), įskaitant 1C metabolizmą, kad būtų sukurtas universalus metilo donoras S-adenozilmetioninas (SAM) baltymų ir DNR metilinimui. Tačiau anglies sekimo eksperimentai su aktyvuotomis T ląstelėse rodo, kad 1C vienetai, gauti iš gliukozės ir egzogeninio serino, reikšmingai neprisideda prie metionino ciklo ir metilinimo (Ma ir kt., 2017). Metabolinis srautas taip pat gali turėti įtakos metilinimo modeliams, nes pasikeičia TCA metabolitų, įskaitant alfa-ketoglutaratą, fumaratą ir sukcinatą, gausa. Tiksliau, fumaratas ir sukcinatas slopina DNR ir histono demetilazes (Su ir kt., 2016). Atsižvelgiant į šių metabolitų išeikvojimą MTHFD2i apdorotose Th17 ląstelėse, H3K27me3 buvo labai sumažintas visame genome, o DNR metilinimas buvo sumažintas konkrečiai Foxp3 proksimaliniame promotoriuje, o tai gali prisidėti prie transdiferenciacijos fenotipo. Th17 ląstelių transdiferenciacijos fenotipas nebuvo išgelbėtas papildant formatu, o tai rodo, kad papildomi keliai gali prisidėti prie FoxP3 reguliavimo, pavyzdžiui, dėl kitų nukleotidų koncentracijos jutimo mechanizmų aktyvumo.

Akteozidas (Verbascoside)

Taip pat pranešta, kad MTHFD2 atlieka nefermentinius vaidmenis, kurie gali prisidėti prie šio fermento priešuždegiminio poveikio. Vėžio ląstelėse MTHFD2 gali atlikti branduolines funkcijas, kartu su DNR replikacijos vietomis, kad paskatintų ląstelių ciklo progresavimą (Gustafsson Sheppard ir kt., 2015). Įrodyta, kad pelių kamieninėse ląstelėse MTHFD2 moduliuoja DNR taisymą, kad išlaikytų genomo stabilumą (Yue ir kt., 2020). Nustatyta, kad inkstų ląstelių karcinomos atveju MTHFD2 yra labai svarbus metaboliniam perprogramavimui per mRNR metilinimą (Green ir kt., 2019). Nors šie MTHFD2 vaidmenys nėra tarpusavyje susiję su mūsų išvadomis, formiato gebėjimas išgelbėti daugelį MTHFD2 trūkumo fenotipų T ląstelėse rodo, kad MTHFD2 fermentinis aktyvumas yra pagrindinis T ląstelių proliferacijos ir likimo veiksnys.

MTHFD2 iš esmės buvo laikomas vaistų taikiniu kovos su vėžiu nustatymuose. Tai taip pat gali būti daug žadantis priešuždegiminis tikslas ir turėti mažiau neigiamo poveikio, palyginti su šiuo metu turimais anti-folatais, nes daugumoje suaugusiųjų audinių jų ekspresija yra maža. Pavyzdžiui, vienas MTX taikinys, DHFR, yra plačiai išreikštas suaugusiųjų audiniuose (Nilsson ir kt., 2014). Todėl MTX gali būti susijęs su įvairiais nepageidaujamais poveikiais, įskaitant toksinį poveikį virškinimo traktui. Be to, nepaisant plačios istorijos, MTX veikimo mechanizmas tebėra menkai suprantamas (Cronstein ir Aune, 2020). Labai reguliuojama MTHFD2 ekspresija ir potencialus perteklius naudojant citozolinį MTHFD1 kelią gali sukelti selektyvią specifinių ląstelių populiacijų priklausomybę nuo MTHFD2. Mūsų išvadose nustatyta, kad MTHFD2 yra svarbus CD4 metabolinis kontrolinis taškas^pliusasT ląstelės. Nors vėžinių ląstelių biologija ir greitai proliferuojančių T ląstelių biologija plačiai sutampa, mes nustatėme, kad CD4 ir T ląstelių pogrupiai turi papildomą jautrumą moduliuodami ląstelių diferenciaciją ir funkciją. Tikėtina, kad MTHFD2 taikymas vėžio terapijoje gali apriboti priešnavikinį imunitetą. Tačiau tokie parametrai kaip gaubtinės ir tiesiosios žarnos karcinoma, kai Th17 ląstelių sukeltas uždegimas prisideda prie ligos, gali būti tinkami MTHFD2is. T ląstelių jautrumas MTHFD2 gali būti veiksminga imunoterapijos forma CD4 nustatymuose^pliusasT ląstelių sukeltas uždegimas, neapsiribojantis vėžiu, ir sukelia mažiau nepageidaujamų poveikių nei šiuo metu turimi gydomieji preparatai.

Studijų apribojimai

Šiame tyrime naudoto MTHFD2i IC50 vertė yra 0,0063 mM MTHFD2 ir 0,57 mM MTHFD1; todėl negalima atmesti nedidelio MTHFD2 ir MTHFD1 dvigubo slopinimo netikslinio poveikio. Atsižvelgiant į tai, kad nenormalus FoxP3 reguliavimas Th17 ląstelėse nebuvo išgelbėtas suteikiant formiatą, bet mTORC1 aktyvumas buvo, šio fenotipo mechanizmas reikalauja tolesnio tyrimo. Be to, visi in vivo modeliai buvo atlikti naudojant MTHFD2i gydymą arba genetinę abliaciją nuo ligos sukėlimo, o T ląstelių fenotipų nustatymas buvo atliktas vienu laiko momentu. Siekiant geriau apibūdinti MTHFD2 trūkumo poveikį ligos patogenezei, tolesni tyrimai turėtų apimti laiko trukmės eksperimentus su serijiniu T ląstelių populiacijų apibūdinimu, kad būtų galima tiksliau nustatyti, ar CD4 ir T ląstelių pogrupiai yra skirtingai paveikti in vivo. Galiausiai, siekiant pagerinti šio tyrimo svarbą klinikinėms reikmėms, reikia patikrinti MTHFD2i gydymo, pradėto po ligos pradžios, veiksmingumą.

STAR★ METODAI

Išsamūs metodai pateikiami internetinėje šio dokumento versijoje ir apima šiuos dalykus:

• PAGRINDINIŲ IŠTEKLIŲ LENTELĖ

• IŠTEKLIŲ GALIMYBĖ

• B Pagrindinis kontaktas

• B Medžiagų prieinamumas

• B Duomenų ir kodų prieinamumas

  
  

• EKSPERIMENTINIS MODELIS IR DALYKO INFORMACIJA

• B Pelės B Žmogaus T ląstelės

• B ląstelių linijos

  
  

• IŠSAMI METODO INFORMACIJA

• B In vitro pelės CD4^pliusasT ląstelių aktyvacija ir diferenciacija

• B Th17 ląstelių slopinimo tyrimas

• B In vitro žmogaus CD4^pliusasT ląstelių auginimo sąlygos

• B CRISPR atranka B Masės spektrometrijos metabolomika

• B protonų branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija (1H-MRS)

• B Imunoblotingas

• B CUT&RUN B EpigenDx tikslinė NextGen bisulfitų sekvencija

• B In vivo EAE modeliai IHC ir srauto citometrijai

• B In vivo gydymas LY345899 EAE modelyje

• B In vivo DS18561882 gydymas DTH modelyje B In vivo IBD modelis su WT ir CD4^ΔMthfd2vados draugai

• B In vivo alerginės kvėpavimo takų ligos modelis su WT ir CD4^ΔMthfd2vados draugai

• B In vivo DS18561882 gydymas OVA imunizacijos modelyje

  
  

• KIEKYBINĖ IR STATISTINĖ ANALIZĖ

PAPILDOMA INFORMACIJA

Papildomą informaciją galite rasti internete adresu https://doi.org/10.1016/j. imunitetas.2021.10.011.

PADĖKA

Dėkojame Rathmell laboratorijos nariams už indėlį į šį projektą. Dėkojame Thomas Aune už RNA-seq duomenų pateikimą ir J. Cools (VIB) už pMx-U6-gRNA-GFP konstrukciją. Dėkojame Max R. Van Belkum už MTHFD2 qPCR pradmenų sukūrimą. Dėkojame Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman ir Mark Manfredi iš Raze Therapeutics, Inc. (Bostonas, MA) už Raze 1459 junginį, kuris buvo naudojamas išvadoms patvirtinti (duomenys nerodomi). Diagramos buvo sukurtos naudojant BioRender. Pripažįstame bendrus vertimo patologijos išteklius, kuriuos palaiko NCI / NIH Cancer Center paramos dotacija 5P30 CA68485-19 ir bendra instrumentų dotacija S10 OD023475-01A1, skirta Leica Bond RX. Šis darbas buvo paremtas William E. Paul Distinguished Innovator Award už Lupus Research Alliance (JCR), R01s DK105550 (JCR), HL136664 (JCR ir DCN), CA217987 (JCR), AI153167 (JCR), AI137075 (į AKM), T32 DK101003 (KV) ir T32 GM007347 (į AS).

AUTORIŲ INSTRUKCIJA

AS, GA ir JCR sukūrė tyrimą. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB ir JCG-C. atliko tyrimą. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR ir JCR analizavo duomenis. AS ir JCR parašė darbą su kitų autorių indėliu.

INTERESŲ DEKLARACIJA

JCR yra „Sitryx Therapeutics“ įkūrėjas, mokslinės patariamosios tarybos narys ir akcininkas; Caribou Biosciences mokslinės patariamosios tarybos narys ir akcininkas; NirogyTherapeutics mokslinės patariamosios tarybos narys; per pastaruosius 3 metus konsultavosi dėl Merck, Pfizer ir Mitobridge; ir gavo mokslinių tyrimų paramą iš Incyte Corp., CalitheraBiosciences ir Tempest Therapeutics. JDR yra vienas iš „Raze Therapeutics“, „Toran“, „Serien Therapeutics“ ir „Farber Partners“ įkūrėjų bei akcininkų, taip pat „Agios Pharmaceuticals“, „Kadmon Pharmaceuticals“, „Bantam Pharmaceuticals“, „Colorado Research Partners“, „RafaelHoldings“, „The Barer Institute“ ir „LEDE Pharmaceuts“ patarėjas bei akcininkas; jis gavo konsultavimo mokesčius ir mokslinių tyrimų finansavimą iš Pfizer ir Rafael ir yra Prinstono universiteto patentų išradėjas. AMC, PF ir TB yra „Sitryx Therapeutics“ darbuotojai.

ĮRAŠYMAS IR ĮVAIROVĖ

Mes stengėmės užtikrinti lyčių pusiausvyrą renkantis ne žmones. Vienas ar keli šio straipsnio autoriai save identifikuoja kaip nepakankamai moksle atstovaujamą etninę mažumą. Cituodami nuorodas, moksliškai svarbias šiam darbui, mes taip pat aktyviai stengėmės skatinti lyčių pusiausvyrą savo nuorodų sąraše. Į šio straipsnio autorių sąrašą įtraukiami bendradarbiai iš vietos, kurioje buvo atliktas tyrimas, kurie dalyvavo renkant duomenis, kuriant, analizuojant ir (arba) interpretuojant darbą.

NUORODOS

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R. ir kt. (2017). Terapinio bendradarbiavimo su KRAS mutantiniais vėžiais kraštovaizdis atskleidžia naviko evoliucijos valdymo principus. Cell Rep. 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3, Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ ir Spurlock, CF, 3 (2017). Ilgų nekoduojančių RNR ekspresija autoimunitete ir ryšys su stipriklio funkcija bei autoimuninių ligų rizikos genetiniais variantais. J. Autoimuninė. 81, 99–109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. ir Hess, C. (2018). T ląstelių metabolizmo spektras sveikatai ir ligoms. Nat. Rev. Immunol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM ir Manning, BD (2016). mTORC1 skatina purino sintezę, kontroliuodamas mitochondrijų tetrahidrofolato ciklą. Mokslas 351, 728–733.

Brown, PM, Pratt, AG, ir Isaacs, JD (2016). Metotreksato veikimo mechanizmas sergant reumatoidiniu artritu ir biomarkerių paieška. Nat. Kunigas Reumatol. 12, 731–742.

Buck, MD, O'Sullivan, D. ir Pearce, EL (2015). T ląstelių metabolizmas skatina imunitetą. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA ir Sabatini, DM (2017). Fiziologinė terpė suaktyvina ląstelių metabolizmą ir atskleidžia šlapimo rūgštį kaip endogeninį UMP sintazės inhibitorių. Ląstelė 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN ir Aune, TM (2020). Metotreksatas ir jo veikimo mechanizmai sergant uždegiminiu artritu. Nat. Kunigas Reumatol. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A. ir Visnjic, D. (2019). Ribonukleozidas AICAr sukelia mieloidinės leukemijos diferenciaciją, aktyvuodamas ATR / Chk1 per pirimidino išeikvojimą. J. Biol. Chem. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L. ir Friese, MA (2015). Išsėtinės sklerozės imunopatologija. Nat. Rev. Immunol. 15, 545–558.

Ducker, GS ir Rabinowitz, JD (2017). Vienos anglies metabolizmas sveikatai ir ligoms. Ląstelės metab. 25, 27–42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y. ir Rabinowitz, JD (2016). Vieno citozolinio anglies srauto apvertimas kompensuoja mitochondrijų folio kelio praradimą. Ląstelės metab. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT ir Unsal-Kacmaz, K. (2017). Purino nukleotidų prieinamumas reguliuoja mTORC1 aktyvumą per Rheb GTPazę. Cell Rep. 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF ir Wolff, JA (1948). Laikinos vaikų ūminės leukemijos remisijos, kurias sukelia folio rūgšties antagonistas 4-aminopteroilglutamo rūgštis. N. Engl. J. Med. 238, 787–793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS ir Stover, PJ (2015). Naujos įžvalgos apie sunkaus kombinuoto imunodeficito metabolinius ir mitybos veiksnius. Retas Dis. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr. ir Newcomb, DC (2018). Testosteronas mažina namų dulkių erkių sukeltą 2 tipo ir IL-17A sukeltą kvėpavimo takų uždegimą. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K. ir Maudsley, AA (2000). Protonų BMR cheminiai poslinkiai ir smegenų metabolitų sujungimo konstantos. NMR Biomed. 13, 129–153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. ir Danesh, FR (2019). MTHFD2 susieja RNR metilinimą su metaboliniu perprogramavimu sergant inkstų ląstelių karcinoma. Onkogenas 38, 6211–6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M. ir kt. (2017). Naujo vėžio taikinio MTHFD2 kristalinė struktūra komplekse su substrato pagrindu veikiančiu inhibitoriumi. Cancer Res. 77, 937–948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M . ir Nilsson, R. (2015). Su folatu susietas fermentas MTHFD2 yra branduolinis baltymas ir skatina ląstelių dauginimąsi. Sci. Rep. 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. ir Manning, BD (2017). mTORC1 signalizacijos tinklas jaučia ląstelių purino nukleotidų lygio pokyčius. Cell Rep. 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ ir kt. (2018). Išskirtinis Th17 ir Th1 ląstelių diferenciacijos reguliavimas pagal nuo gliutaminazės priklausomą metabolizmą. 175 langelis, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y. ir kt. (2019). Redokso homeostazės moduliavimas slopinant MTHFD2 sergant gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu: mechanizmai ir terapinės pasekmės. J. Natl. Cancer Inst. 111, 584–596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., ir kt. (2019). Atrastas stiprus, selektyvus ir geriamas MTHFD2 inhibitorius (DS18561882), turintis in vivo priešnavikinį aktyvumą. J. Med. Chem. 62, 10204–10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J. ir Ha, J. (2016). AMPK aktyvatoriai: veikimo mechanizmai ir fiziologinė veikla. Exp. Mol. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN ir Keun, HC (2016). MTHFD2 slopinimas MCF-7 krūties vėžio ląstelėse padidina glikolizę, priklausomybę nuo egzogeninio glicino ir jautrumą folio rūgšties išeikvojimui. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. ir Liu, XS (2014). MAGECK leidžia patikimai identifikuoti esminius genus iš genomo masto CRISPR / Cas9 išjungimo ekranų. Genome Biol. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML ir kt. (2017). Serinas yra esminis metabolitas efektorinių T ląstelių plėtrai. Ląstelės metab. 25, 345–357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP ir kt. (2014). Gliukozės transporteris Glut1 yra selektyviai būtinas CD4 T ląstelių aktyvinimui ir efektoriaus funkcijai. Ląstelės metab. 20, 61–72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG ir Rathmell, JC (2011). Pažangiausias pranašumas: skirtingos glikolitinės ir lipidų oksidacinės medžiagų apykaitos programos yra būtinos efektoriaus ir reguliavimo CD4 ir T ląstelių pogrupiams. J. Immunol. 186, 3299–3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X. ir Sun, S.-C . (2014). Uždegiminiai T ląstelių atsakai priklauso nuo aminorūgščių pernešėjo ASCT2, palengvinančio glutamino įsisavinimą ir mTORC1 kinazės aktyvavimą. Imunitetas 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A. ir Mootha, VK (2014). Metabolizmo fermentų ekspresija pabrėžia pagrindinį MTHFD2 ir mitochondrijų folatų kelio vaidmenį vėžyje. Nat. Komun. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC ir Skaar, EP (2019). Įgimtas imuninis baltymas S100A9 apsaugo nuo T pagalbinių ląstelių tipo 2-sukeliamo alerginio kvėpavimo takų uždegimo. Esu. J. Respir. Cell Mol. Biol. 61, 459–468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA ir kt. (2016). Nukreipimas į MTHFD2 sergant ūmine mieloidine leukemija. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que´ me´ neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P. ir Genestier, L. (2003). Diferencinė pirminių T limfocitų ląstelių ciklo, proliferacijos ir išgyvenimo kontrolė purino ir pirimidino nukleotidais. J. Immunol. 170, 4986–4995.

Que´ me´ neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P. ir Marvel, J. (2004). De novo nukleotidų biosintezės apribojimas trukdo klonų plėtrai ir diferenciacijai į efektorines ir atminties CD8 T ląsteles. J. Immunol. 173, 4945–4952.

Rae, C. ir Mairs, RJ (2019). AMPK aktyvinimas AICAR padidina prostatos vėžio ląstelių jautrumą radioterapijai. Oncotarget 10, 749–759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB ir kt. (2016). Mitochondrijų biogenezė ir proteomų remodeliavimas skatina vienos anglies metabolizmą T ląstelių aktyvinimui. Ląstelės metab. 24, 104–117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA ir Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, žmogaus žarnynas, yra toks pat stiprus kaip COPAXONE išsėtinės sklerozės gyvūnų modelyje. Priekyje. Immunol. 10 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG ir Zhang, F. (2014). Genomo masto CRISPR-Cas9 išmušimo atranka žmogaus ląstelėse. Mokslas 343, 84–87.

Sharma, U. ir Rando, OL (2017). Metaboliniai įėjimai į epigenomą. Ląstelės metab. 25, 544–558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR ir Chi, H. (2011). Nuo HIF1alfa priklausomas glikolitinis kelias organizuoja T H17 ir Treg ląstelių diferenciacijos metabolinį kontrolinį tašką. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J. ir Appling, DR (2017). Žmogaus mitochondrijų MTHFD2 yra dvigubo redokso kofaktoriui būdinga metilentetrahidrofolato dehidrogenazė / metiltetrahidrofolato ciklohidrolazė. Vėžys Metab. 5, 11.

Skene, PJ ir Henikoff, S. (2017). Veiksminga tikslinė nukleazės strategija, skirta didelės skiriamosios gebos DNR surišimo vietų kartografavimui. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L. ir kt. (2019). AICAR sukelia apoptozę ir slopina migraciją bei invaziją į prostatos vėžio ląsteles per AMPK/mTOR priklausomą kelią. Tarpt. J. Mol. Sci. 1647 m. 20 d.

Su, X., Wellen, KE ir Rabinowitz, JD (2016). Metilinimo ir acetilinimo metabolinė kontrolė. Curr. Nuomonė. Chem. Biol. 30, 52–60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. ir kt. (2017). Integracinė proteomikos ir fosfoproteomikos profiliavimas atskleidžia dinaminius signalizacijos tinklus ir bioenergetikos kelius, kuriais grindžiamas T ląstelių aktyvinimas. Imunitetas 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J. ir Demoulin, J.-B. (2009). Sulieti baltymai TEL-PDGFR ir FIP1L1-PDGFR išvengia ubikvitinacijos ir degradacijos. Haematologica 94, 1085–1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P. ir Yu, W. (2020). Cisplatina slopina SIRT3-deacetilinimą MTHFD2, kad sutrikdytų ląstelių redokso pusiausvyrą gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelėse. Ląstelių mirtis Dis. 11 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W. ir Rabinowitz, JD (2019). Netikslinės LC-MS metabolizmo smailės anotacijų ir tikrinimo variklis. Anal. Chem. 91, 1838–1846.

Yang, M. ir Vousden, KH (2016). Serino ir vienos anglies metabolizmas sergant vėžiu. Nat. Rev. Cancer 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., ir kt. (2020). Mthfd2 moduliuoja mitochondrijų funkciją ir DNR taisymą, kad išlaikytų pelių kamieninių ląstelių pluripotenciją. Kamieninių ląstelių ataskaitos 15, 529–545.

Zhu, Z. ir Leung, GKK (2020). Daugiau nei metabolinis fermentas: MTHFD2 kaip naujas priešvėžinės terapijos tikslas? Priekyje. Oncol. 10 658.

STAR★ METODAI

PAGRINDINIŲ IŠTEKLIŲ LENTELĖ

IŠTEKLIŲ GALIMYBĖ

Vadovaujantis kontaktas

Daugiau informacijos ir užklausas dėl išteklių ir reagentų turėtų adresuoti pagrindinis kontaktinis asmuo dr. Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org), o baigus atitinkamą MTA.

Medžiagų prieinamumas

Šiame tyrime sukurtos plazmidės ir pelių linijos bus prieinamos atlikus atitinkamą MTA, paprašius.

Duomenų ir kodų prieinamumas

CUT&RUN sekos duomenys buvo deponuoti GEO ir yra viešai prieinami nuo paskelbimo datos (GSE180356). Mikroskopijos duomenimis ir originaliais Western blot vaizdais, pateiktais šiame dokumente, pagrindinis kontaktas, paprašius, pasidalins. Bet kokią papildomą informaciją, reikalingą šiame dokumente pateiktiems duomenims iš naujo išanalizuoti, paprašius galite gauti iš pagrindinio kontaktinio asmens.

Norėdami gauti imunitetą, spustelėkite „Cistanches“.