Natūrali parvoviruso infekcija laukinėse žvejojamose katėse (Prionailurus Viverrinus) atskleidžia išlikusią viruso lokalizaciją inkstuose

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktus

Mėsėdžių protoparvovirusas-1 (CPPV-1), virusų rūšis, turintis kačių panleukopenijos viruso (FPV) ir šunų parvoviruso (CPV) variantų, yra plačiai paplitęs tarp naminių ir laukinių mėsėdžių, sukeliančių sistemines mirtinas ligas. Buvo rastos negyvos laukinės žvejybos katės (Prionailurus viverrinus), visame pasaulyje pažeidžiama rūšis. Atlikus skerdenų pomirtinį tyrimą, buvo nustatyti žarnyno, blužnies irInkstų. CPPV-1 antigeno identifikavimas šiuose audiniuose, naudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR) ir imunohistochemiją (IHC), patvirtino viruso infekciją. PGR ir IHC teigiamumas inkstų audiniaiatskleidė netipinę viruso lokalizaciją, o in situ hibridizacija (ISH) ir perdavimo elektronų mikroskopija (TEM) su pop-off technika patvirtino pirmąjį viruso lokalizacijos aprašymąinkstus. Visiškas genomo apibūdinimas ir gauto CPPV-1 aminorūgščių analizė iš žvejojančių kačių parodė, kad FPV yra sukėlėjas. Aptiktos FPV sekos kapsidės baltyme parodė aminorūgščių mutacijas ties I566M ir M569R. Filogenetinė ir evoliucinė visų koduojančių genomo sekų analizė atskleidė, kad žvejų katės CPPV-1 genomai yra genetiškai susitelkę į FPV genomus, išskirtus iš naminių kačių Tailande. Nuo 1970-ųjų taip pat buvo įrodyta, kad šie genomai turi bendrą genetinę evoliuciją su Kinijos FPV padermėmis. Šis tyrimas yra pirmasis žvejojamų kačių CPPV{5}} infekcijos įrodymas ir pirmasis, parodantis jo lokalizacijąinkstus. Šie radiniai patvirtina šio parvoviruso daugelio šeimininkų diapazoną ir rodo, kad mirtina CPPV{1}} infekcija gali sukelti kitų pažeidžiamų laukinių mėsėdžių.

Raktažodžiai: inkstų audinys; inkstų ligos, inkstų, inkstų, inkstų kanalėlių

Įvadas

Prionailurus gentis, Felidae šeima, priskiriama dėmėtųjų, mažo dydžio laukinių kačių grupei, kurios gimtoji vieta yra Azija [1]. Prionailurus gentis apima keturias oficialiai pripažintas laukinių kačių rūšis, įskaitant leopardo katę (P. bengalensis), plokščiagalvę katę (P. planiceps), rūdijusią dėmėtąją katę (P. rubiginosus) ir žvejybinę katę (P. viverrinus). [2]. Žvejybos katė daugiausia gyvena pelkių ir mangrovių apylinkėse. Jis gyvena tik Pietų ir Pietryčių Azijoje ir yra labiau paplitęs Tailande [3, 4]. Šiuo metu žvejojančių kačių populiacijoms gresia pavojus, nes per pastarąjį dešimtmetį buvo sunaikintos pelkės, kuriose jos gyvena. Dėl to ši rūšis šiuo metu laikoma pažeidžiama ir įtraukta į Tarptautinės gamtos apsaugos sąjungos (IUNC) raudonąjį sąrašą [3]. Dėl savo buveinių praradimo žvejų kačių kolonijos migruoja ir retkarčiais gyvena vietovėse, kuriose gyvena naminiai gyvūnai ir žmonės [5]. Dėl šio bendros aplinkos reiškinio gali padidėti patogenų plitimas tarp imlių laukinių ir naminių gyvūnų ir atvirkščiai. Per pastaruosius kelis dešimtmečius buvo užfiksuoti pranešimai apie mirtinus protrūkius laukiniams ar naminiams gyvūnams, kurie galėjo atsirasti dėl patogenų išsiliejimo [6–9]. Taigi patogenų perdavimo iš tų gyvūnų dinamika turėtų būti ištirta ir ją reikia toliau tirti.

CISTANCHE PAGERINS INKSTU/INKSTŲ FUNKCIJĄ

Mėsėdžių protoparvovirusas-1 (CPPV-1), virusinė rūšis, įskaitant audinės enterito virusą (MEV), meškėno parvovirusą (RPV), kačių panleukopenijos virusą (FPV) ir šunų parvoviruso (CPV) variantus. pripažintas svarbiu patogenu, susijusiu su mirtinomis ligomis laukinių ir naminių Canidae ir Felidae šeimose [10, 11]. Manoma, kad FPV, dažnas Felidae rūšies patogenas, yra bendras CPV protėvis [12–14]. CPV dažnai užkrečia Canidae šeimos gyvūnus ir daugėja įrodymų, kad užsikrėtė Felidae šeimos gyvūnai [9, 15, 16]. Anksčiau buvo manoma, kad FPV ir CPV yra virusas, kuriam priklauso šeimininkas. Tačiau vėliau keletas išvadų parodė, kad kai kurie Canidae šeimos gyvūnai gali būti FPV rezervuaras arba atvirkščiai [11, 17, 18]. Be to, keliose ataskaitose nurodyta, kad FPV ir CPV variantai (MUP-2a, -2b ir -2c) turi jautrius pagrindinius kompiuterius. Šie šeimininkai yra ne tik naminiai gyvūnai, bet ir įvairios mėsėdžių rūšys [15, 19, 20], o tai rodo, kad CPPV-1 [11] yra daug šeimininkų.

Nuo 1996 iki 1997 m. CPV variantai pirmą kartą buvo aptikti leopardo katėse ir iš pradžių buvo pavadinti leopardo kačių parvovirusu (LCPV), o tai rodo pirmąjį CPPV -1 aprašymą Prionailurus gentyje [21, 22]. Nustatyta, kad kai kurios iš šių LCPV padermių genetiškai skiriasi nuo anksčiau aprašytų CPV-2a ir -2b dėl G300A aminorūgšties mutacijos kapsido (VP) baltyme. Dėl to pasikeitė jo antigeninės savybės, kurios dabar naudojamos kaip unikalus mutacijos taškas, siekiant atskirti CPV{8}}c nuo kitų CPV variantų [22]. Naujo CPV varianto (šiuo metu žinomo kaip CPV-2c) atradimas leopardo katėms patvirtino idėją apie CPPV-1 evoliuciją tarp gyvūnų rūšių. Vėliau buvo pranešta apie FPV ir CPV variantų infekcijas leopardo katėms [9]. Tai rodo, kad kitos tos pačios kaip leopardo katės (Prionailurus genties) rūšys gali būti jautrios CPPV{14}} infekcijai. Iki šiol kitų Prionailurus genties rūšių jautrumas CPPV{15}} infekcijai vis dar iš esmės nežinomas. Iššifravus, kaip vystosi CPPV{16}} variantai ir kaip elgiasi naujai atsirandantys variantai, gali padėti išsiaiškinti, kaip išvengti galimo naujo varianto protrūkio. Net jei naujasis virusas įgauna platesnį šeimininkų diapazoną, naujame, jautriame šeimininke gali būti stebimi mirtini protrūkiai arba netipiniai su infekcija susiję pažeidimai. Šiame tyrime aprašoma laukinių žvejybinių kačių (Prionailurus viverrinus) mirtina CPPV{17}} infekcija. Genetinis gauto CPPV-1 apibūdinimas atskleidžia FPV kaip sukėlėją. Šis atradimas yra pirmasis šios rūšies FPV infekcijos įrodymas ir atskleidžia unikalų šio viruso ląstelių tropizmą. Būtina toliau išaiškinti FPV infekciją ir jos variantus šioje rūšyje, kad būtų galima atsižvelgti į visuotinę daugelio pažeidžiamų rūšių infekciją.

medžiagos ir metodai

Gyvūnai ir įprastinė pomirtinė apžiūra2019 m. birželio mėn. dvi laukinės žvejybos katės (P. viverrinus), nurodytos bylos Nr. 1 ir 2 buvo rasti negyvi Nakhon Ratchasima provincijos priemiestyje, Tailande. Vėliau, 2019 m. rugpjūčio mėn., kita žvejyba katė, nurodyta bylos Nr. 3, buvo gelbėjamas iš vietos, kur buvo rastos pirmosios dvi žvejybinės katės. Dėl dehidratacijos sunkumo bylos Nr. 3 mirė siuntimo į gyvūnų ligoninę metu. Šios trys žvejybinės katės buvo pateiktos pomirtiniam tyrimui kaip įprastas procesas. Deja, toje pačioje vietovėje laikomų laisvai klajojančių naminių gyvūnų ar laukinių rūšių pavyzdžių nebuvo; todėl jie nebuvo įtraukti į šį tyrimą. Visoms žvejojančioms katėms buvo atliktas įprastinis pomirtinis tyrimas. Atrankiniai gyvybiškai svarbūs organai, įskaitant plaučius, kepenis, širdį, blužnį irinkstasbuvo paimti mėginiai iš visų žvejojamų kačių, o žarnynas ir mezenterinis limfmazgis papildomai paimti iš žvejybinės katės Nr.3. Visi atrinkti audiniai buvo pateikti histologiniam tyrimui ir atskirai paimti mėginiai tolesniems molekuliniams tyrimams. Histologijai audiniai buvo panardinami į 10 procentų (t/v) neutralų buferinį formaliną mažiausiai 24 valandoms ir reguliariai apdorojami. Tada jie buvo nudažyti hematoksilinu ir eozinu

(H&E) taikant standartines procedūras prieš ACVP tarybos sertifikuoto veterinarijos patologo (TK) tyrimą. Švieži audinių mėginiai, gauti iš trijų žvejojamų kačių, buvo laikomi –80 ˚C temperatūroje molekuliniams tyrimams. Visos procedūros buvo atliktos pagal gaires ir reglamentus, patvirtintus Chulalongkorn universiteto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetui (Nr. 1931036).

Bendrieji virusologiniai molekuliniai tyrimaiŠvieži audinių mėginiai, įskaitant širdį, plaučius, kepenis, blužnį irinkstasvisų žvejojamų kačių plius papildomi žarnyno ir mezenterinių limfmazgių audiniai žvejojamos katės Nr. 3, buvo ekstrahuotos virusinėmis nukleino rūgštimis, atskirai homogenizuojant 1 procento (t/v) fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Vėliau visa viruso nukleorūgštis buvo ekstrahuota naudojant komercinį virusinių nukleino rūgščių ekstrahavimo II rinkinį (Geneaid, Taipėjus, Taivanas), vadovaujantis gamintojo pasiūlymu. Tada ekstrahuotos nukleorūgštys buvo kvalifikuotos ir kiekybiškai įvertintos pagal jų A260/A280 absorbcijos santykį, naudojant spektrofotometrijos metodą (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, JAV). Visos ekstrahuotos nukleino rūgštys buvo toliau tiriamos viruso molekulinis tyrimas, naudojant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizę su keliomis visos virusinės šeimos PGR tyrimų grupėmis, įskaitant herpesviruso [23], paramiksoviruso [24], pneumoviruso [25], kaliciviruso aptikimą. [26], gripo virusas [27], bokavirusas [26, 28], parvovirusas [29] ir koronavirusas [30, 31]. Reakcijoms naudojami PGR protokolai, reagentai, ciklo sąlygos ir teigiamos/neigiamos kontrolės yra aprašytos S1 faile. PGR aptikimas, būdingas kačių gliceraldehido - 3-fosfatdehidrogenazės (GAPDH) genui, buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė, kaip aprašyta anksčiau [32]. Vėliau teigiami PGR amplikonai buvo vizualizuoti naudojant QIAxcel kapiliarinės elektroforezės platformą (Qiagen, Hilden, Vokietija), kaip aprašyta anksčiau [33]. Kiekvieno PGR tyrimo teigiami amplikonai buvo išgryninti ir jiems buvo atlikta dvikryptė Sanger sekvencija (Macrogen Inc, Seulas, Pietų Korėja). Dėl vidutinio sunkumo audinių autolizės šių žvejojamų kačių bakteriologinio tyrimo atlikti nebuvo įmanoma.

In situ CPPV{0}} aptikimas naudojant imunohistochemiją (IHC), in situ hibridizaciją (ISH) ir perdavimo elektronų mikroskopiją (TEM)

Pradinis virusologinis molekulinis patikrinimas atskleidė teigiamus pan-parvoviruso PGR amplikonus, o sekos nustatymo rezultatai taip pat parodė galimas CPPV-1 DNR sekas. Šie atradimai paskatino mus dar labiau patvirtinti CPPV-1 buvimą ir lokalizuoti CPPV-1 pasiskirstymą žvejojančių kačių audiniuose. Formalinu fiksuoti parafinu įterpti (FFPE) audiniai, įskaitant plaučius, kepenis, širdį, blužnį,inkstasir žarnynas buvo aptiktas CPPV-1 IHC naudojant pelių monokloninį antikūną prieš šunų parvovirusą (ab59832, Abcam, Kembridžas, JK) ir krienų peroksidazės (HRP) aptikimo sistemą (EnVision polimeras, Dako, Glostrup, Danija) . Trumpai tariant, FFPE sekcijos buvo supjaustytos iki 4- μm storio ir toliau deparafinuotos bei rehidratuotos. Tada stikleliai buvo iš anksto apdoroti, endogeninė peroksidazė užblokuota ir apdorota, kaip aprašyta anksčiau [11]. FPV infekuotos katės ir CPV užsikrėtusio šuns žarnyno audinio pjūviai buvo naudojami kaip teigiami kontroliniai mėginiai, o identiški pjūviai buvo inkubuoti su išgrynintais ožkos-pelės ir triušio IgG (IHC universalus neigiamas kontrolinis reagentas, kodas ADI-950-231-0025, Enzo Life). Sciences, Farmingdale, NY, JAV), buvo naudojami kaip neigiama kontrolė. Kalbant apieinkstųkanalėlių nekrozė tose srityse, kuriose buvo pastebėti teigiami CPPV{0}} IHC signalai,inkstasvisų žvejojamų kačių dalys buvo specialiai nudažytos periodine rūgštimi (PAS), siekiant parodyti ląstelių architektūrą.inkstasaudinių.

CISTANCHE PAGERINS INKSTŲ/INKSTŲ LIGĄ

Be to, FFPEinkstasžvejybos kačių skyriai Nr. 1 ir 3 buvo atlikta ISH ir TEM analizė, siekiant patvirtinti teigiamo CPPV-1 IHC dažymo rezultatą ir ultrastruktūriškai parodyti viruso dalelesinkstų audiniai, atitinkamai. Pagal ISH CPPV-1 DNR zondas, apimantis CPPV-1 kapsido geno 393 bp [34], buvo sukurtas naudojant PCR DIG zondo sintezės rinkinį (Roche Diagnostics, Bazelis, Šveicarija). gamintojo pasiūlymus. Šiluminio ciklo reakcija ir būklė buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau [34], išskyrus naudojant digoksigeninu (DIG) pažymėtus oligonukleotidus. Sukonstruotas hibridizacijos zondas buvo vizualizuotas ir patvirtintas dydžio skyra 1,5 % (m/v) agarozės gelio elektroforezės būdu. ISH su chromogenine DNR buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [26] su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, po deparafinizavimo, rehidratacijos ir vėlesnio skalavimo PBS, 4- μm storio FFPE stikleliai buvo suskaidyti proteolitiškai, po fiksacijos ir išankstinė hibridizacija. Tada stikleliai buvo hibridizuoti su 25 ng/μL ISH zondu 42 °C temperatūroje per naktį. Hibridizacijos signalai buvo vizualizuoti sujungiant su 100 μL anti-DIG-AP Fab fragmentų (Roche, Bazelis, Šveicarija) (1:200 1X blokavimo tirpale) kartu su Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Danija) . Tada stikleliai buvo nudažyti hematoksilinu. Manoma, kad raudonos nuosėdos, susijusios su ląstelių morfologija, yra teigiamos ISH. Neigiamoms kontrolėms buvo naudojami tilapijos ežero viruso (TiLV) zondai [35], o ne CPPV-1 zondas. TEM mėginiai buvo paruošti taikant pop-off metodus su modifikacijomis [36–38] ir nudažyti sunkiaisiais metalais, kaip aprašyta anksčiau [39, 40]. Ultrastruktūra buvo ištirta naudojant TEM (HT7800; Hitachi, Tokijas, Japonija), veikiantį 80 kV

Viso ilgio genetinis žvejybos katės CPPV apibūdinimas-1Kadangi virusologinio PGR ir IHC atrankos rezultatai sutapo, o dalinių VP-2 genomo sekų, gautų iš pan-parvovirusinės PGR, rezultatai rodo genetinį panašumą tarp atvejų Nr. 1 ir 2, bet ne 3 atveju, toliau apibūdinome viso ilgio CPPV-1 seką iš šių žvejojančių kačių (atvejai Nr. 1 ir 3) ir klasifikavome CPPV-1 kilmę naudodami degeneruotų pradmenų porų, būdingų FPV ir CPV, rinkinys, gautas iš ankstesnio leidinio [26]. Trumpai tariant, ekstrahuotos nukleino rūgštys, gautos iš blužnies irinkstusdviejų žvejojamų kačių plius papildomas žvejybinės katės žarnos audinys Nr. 3, buvo individualiai sustiprinti naudojant GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, JAV) ir specifinius pradmenis (S1 failas). PGR sąlygos buvo aprašytos anksčiau [26]. Tiksliniai amplikonai buvo vizualizuoti naudojant 2 procentų (m/v) agarozės gelio elektroforezę ir toliau išgryninti naudojant Monarch DNA Gel ekstrahavimo rinkinį (New England Biolab, Frankfurtas, Vokietija) prieš komercinį Sanger sekos nustatymą. Visos CPPV-1 izoliatų, gautų iš dviejų žvejojančių kačių, genomo sekos buvo deponuotos GenBank (prieigos numeriai MW145540-MW145541).

Žvejybos katės CPPV-1 filogenetinė, rekombinacinė ir evoliucinė analizė Žvejybos katės CPPV-1 padermių viso ilgio genomo sekos buvo suderintos su paskelbtomis pilnomis CPPV-1 sekomis, gautomis iš įvairių šeimininkų rūšių. , pasiekiamas GenBank naudojant MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) ir MEGA7 programinę įrangą (http://www.megasoftware.net). Tada sekos derinimui buvo atlikta filogenetinė medžio konstrukcija. Filogenetinis medis buvo sukurtas naudojant didžiausios tikimybės (ML) metodą su Hasegawa – Kishino – Yano su gama pasiskirstymu (HKY plius G) modeliu, kuris buvo parinktas naudojant MEGA7 modelio paieškos algoritmą pagal Bajeso informacijos kriterijų. . Medis buvo įkeltas naudojant 1,{10}} kopijas. Sekos porinis panašumas tarp CPPV-1 genomų buvo apskaičiuotas naudojant didžiausios sudėtinės tikimybės modelį, o jų evoliucinis atstumas buvo analizuojamas MEGA7. Išvesties poros nukleotidų tapatybės buvo sugeneruotos ir vizualizuotos Microsoft Excel formatu (S2 failas). Tada CPPV{14}} išvesties derinimo seka buvo naudojama kaip šablonas genetinės rekombinacijos analizei, naudojant du statistiškai nepriklausomus programinės įrangos paketus. Trumpai tariant, lygiuojant buvo nustatytos galimos rekombinacijos padermės, naudojant integruotą Rekombinacijos aptikimo programos 4 (RDP4) paketą V. Beta 4.94 programinė įranga ir tai buvo kryžmiškai patikrinta naudojant panašumo diagramą ir įkrovos nuskaitymo analizę SimPlot programinės įrangos paketo V versijoje. 3.5.1. Programų nustatymai ir rezultatų interpretavimas buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau [26, 41].

FŽvejybinės katės CPPV{{0}} evoliucinei analizei buvo gautas duomenų rinkinys iš 224 pilnų genomo sekų, kuriose yra 26 FPV-, 6 MEV- ir 192 CPV sekos, kurios visos kilusios iš 18 šalių 1979–2019 m. iš GenBank duomenų bazės. Evoliucinė analizė buvo atlikta naudojant 2 potencialias CPPV-1 sekas, gautas iš žvejojančių kačių, naudojant Bayesian Markovo grandinės Monte Karlo (BMCMC) modelį, įdiegtą BEAST V. 2.4.8 [42]. jModelTest [43] buvo atliktas siekiant nustatyti geriausiai tinkantį nukleotidų pakeitimo modelį kelioms išlyginimo sekoms. Geriausiai tinkantys pakeitimo modeliai pagal lognormalų atsipalaidavimą ir griežtus laikrodžių modelius, esant pastoviems populiacijos dydžiams, kaip ir anksčiau, buvo įdiegti siekiant atsižvelgti į skirtingus evoliucijos tempus tarp giminių. Susiliejantis Bajeso panoraminio medžio ankstesnis ir empirinis bazinis dažnis buvo gautas pagal geriausiai pritaikytą laikrodžio modelį ir veikia 100 milijonų grandinių, imant atranką kas 10-ą 000kartą, o pirmieji 10 procentų atmetami kaip perdegimas. Parametrų konvergencija patvirtinta apskaičiavus efektyvų imties dydį naudojant TRACER programą V. 1.7.0 [44]. Maksimalaus klado patikimumo medžiai buvo anotuoti naudojant TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Filogenetinis medis su apskaičiuotu skirtumu, kintama laiko juosta, užpakaline tikimybe ir 95 procentų didžiausiu užpakaliniu tankiu (HPD) buvo sukurtas ir parodytas naudojant FigTree V. 1.4.3 [45].

Retrospektyvus laukinių gyvūnų mėsėdžių CPPV{0}} antigeno tyrimasSiekiant ištirti CPPV{0}} vaidmenį, susijusį su laukinių mėsėdžių sergamumu ir mirtingumu dėl nežinomų priežasčių tolimoje ir netolimoje praeityje, buvo įtraukti 305 atrankiniai švieži mėginiai, skirti genomo ekstrakcijai ir CPPV identifikavimui{{2} } kapsido geną, kaip aprašyta aukščiau. Šie mėginiai buvo paimti nuo 2013 m. kaip išmatų tamponai arba žarnyno turinys. Jie buvo gauti iš 136 zoologijos sodo gyvūnų iš 27 skirtingų mėsėdžių rūšių (S1 lentelė). Rezultatai Žvejybos katės pomirtiniai radiniai ir audinių lokalizacija CPPV-1 Visos skrodytos žvejybinės katės buvo vidutiniškai išsekusios ir įvairaus laipsnio dehidratacijos, o 2 iš 3 žvejojamų kačių (1 ir 2 atvejai) autolizė buvo vidutinė. Akivaizdu, kad blužnis irinkstusbuvo perpildytos visose žvejojamose katėse. Žvejybos katė Nr.3 turėjo makroskopinius katarinio enterito pažeidimus, kurių liumenuose buvo vandeningas rudai gelsvas turinys ir mezenterinio limfmazgio užsikimšimas. Histologiškai žvejojamos katės plaučiai Nr. 3 atskleidė didelę perkrovą su mononuklearinių ląstelių infiltracija alveolėse. Kepenyse pasireiškė lengvas periportinis hepatitas, kuriam būdinga mononuklearinių ląstelių infiltracija kepenų vartų triadose. Visoms žvejojamoms katėms buvo pastebėtas panašus blužnies perkrovos laipsnis su nedideliu blužnies limfoidinių folikulų skaičiumi. Limfoidiniai folikulai buvo išeikvoti, o likę limfoidiniai folikulai žlugus blužnies architektūrai ir padidėjus iškilių blužnies trabekulių skaičiui (1A pav.). Buvo išsibarsčiusios karioretinės limfocitų nuolaužos su

1 pav. CPPV-1 infekcija žvejojančioms katėms. Demonstracinės H&E (A, C) ir CPPV-1 IHC (B, D) nuotraukos iš žvejojančių kačių. (A) Žvejybos katė Nr. 1. Difuzinė perpildyta blužnis su nedideliu limfoidinių folikulų skaičiumi. Vieno iš likusių limfoidinių folikulų centre buvo eozinofilinė fibrilinė medžiaga (fibrinas), susimaišiusi su išsibarsčiusiomis kariorektinėmis limfocitų nuolaužomis (limfocitolizė) (įdėta). Nedaug šių limfocitų turėjo 5–7 μm bazofilinių intranuklearinių inkliuzinių kūnų, kurie apribojo branduolinį chromatiną (rodyklė). (B) Žvejybos katė Nr. 3. Gaurelių sutrumpėjimas retkarčiais išsiplėtusiomis kriptomis, kuriose buvo eozinofilinių baltyminių medžiagų ir išklotos ryškiai susilpnėjusiomis arba nekrozinėmis kriptų epitelio ląstelėmis (įdėklas). Daugelis kripto epitelio ląstelių buvo piknozinės ir karioretinės, o retos ląstelės turėjo panašių bazofilinių intranuklearinių inkliuzinių kūnų (rodyklės). (C) Žvejybos katė Nr. 1. CPPV-1 imunoreaktyvumas dažnai buvo stebimas mononuklearinių ląstelių citoplazmoje blužnies limfoidinio folikulo srityje. (D) Žvejybos katė Nr. 3. CPPV-1 IHC signalai buvo aptikti difuziškai, o imunoreaktyvumo signalai buvo ryškiai lokalizuoti kriptalinių epitelio ląstelių citoplazmoje (įdėklas). Juostos rodo 25 μm (A) ir 120 μm (B–D).

eozinofilinių fibrilinių medžiagų sankaupos tokio folikulo centre. Nedaug šių limfocitų turi 5–7 μm bazofilinių intranuklearinių inkliuzinių kūnų, kurie riboja branduolio chromatiną. Žvejybos katės Nr. 3 (1B pav.). Kai kurios kriptos buvo išsiplėtusios, jose buvo eozinofilinės baltyminės medžiagos ir buvo išklotos žymiai susilpnėjusiomis arba nekrozinėmis kripto epitelio ląstelėmis. Daugelis kriptalinių epitelio ląstelių buvo piknozinės ir karioretinės, o retos ląstelės turėjo panašių bazofilinių intranuklearinių inkliuzinių kūnų. CPPV-1 IHC buvo naudojamas siekiant parodyti viruso buvimą audiniuose ir apibūdinti patologinį CPPV-1 vaidmenį pažeidimuose, pastebėtuose atliekant įprastinį pomirtinį tyrimą. Blužnyje esančios mononuklearinės ląstelės parodė teigiamą intensyvų CPPV -1 imunoreaktyvumą visoms žvejojamoms katėms (1C pav.). Imunoreaktyvumas taip pat buvo pastebėtas daugumoje kriptalinių epitelio ląstelių citoplazmos ir buvo suderinamas su žvejybos katės Nr. 3 (1D pav.). Pažymėtina, kad įvairūs laipsniaiinkstų kanalėliųvakuolizacija ir daugiažidininisinkstųkraujavimas buvo akivaizdus visoms žvejojamoms katėms (2A pav.). Kai kurieinkstųkanalėlių epitelio ląstelės buvo hipereozinofilinės su branduoline piknoze, o retos vakuolinės kanalėlių epitelio ląstelės atskleidė vezikulinius branduolius su kraštiniu branduolio chromatinu (2B pav.). Kalbant apieinkstaspažeidimus, toliau atlikome PAS dažymą, kad parodytume ląstelių architektūrąinkstų audinysir neįtraukti sisteminės hipoksijos kaip galimos šio pažeidimo priežasties. PAS dažymas parodėinkstų kanalėliųbazinės membranos buvo nepažeistos (2B pav., įdėta). Perinkstasskyriuose, CPPV{0}} imuninis ženklinimas buvo stiprus ir dažnai pastebėtasinkstų kanalėliųepitelio ląstelės (2C pav.) ir urotelio ląstelėsinkstų dubensvisais atvejais. Neigiamuose kontroliniuose mėginiuose imunogeninės reakcijos požymių nepastebėta (S1 pav.). Netipinė CPPV-1 lokalizacijainkstų audiniaiIHC atskleidė, kad turėtume atlikti papildomus tyrimus, kad patvirtintume CPPV-1 buvimą ir lokalizacijąinkstasnaudojant ISH ir TEM su pop-off technika. CPPV-1 ISH imunoreaktyvumas buvo teigiamas visoms žvejojamoms katėms ir difuziškai lokalizuotas jų branduolyje.inkstųkanalėlių epitelio ląstelės, kuriose buvo pastebėti kanalėlių pažeidimai (2D pav.). Neigiamos kontrolės reakcijos nepastebėta (S1 pav.) Remiantis teigiamų imunologinių ISH signalų, lokalizuotų ISH branduolyje, rezultatais.inkstųbuvo pastebėtos epitelio ląstelės, daugybė mažų elektronų tankių virusinių dalelių, kurių skersmuo buvo maždaug 19–22 nm. Jie buvo susitelkę į šių branduoliusinkstų kanalėliųir urotelio ląstelės (3 pav.).

Žvejojančios katės CPPV{0}} aptikimas ir genomo analizėVisų pirma, visos šeimos PGR plokštės, būdingos įvairiems virusams, įskaitant herpesvirusą, paramiksovirusą, pneumovirusą, kalicivirusą, gripo virusą, bokavirusą, koronavirusą ir parvovirusą, buvo tiriami su išskirtais viruso nukleorūgščių mėginiais. Tai atskleidė teigiamus rezultatus tik atliekant pan-parvoviruso PGR žarnyne, limfmazgiuose irinkstastrijų žvejojamų kačių pavyzdžiai. Priešingai, kiti pan-PGR, skirti kitų virusų aptikimui, buvo neigiami visuose tirtuose audinių mėginiuose. Remiantis anksčiau gautais pan-parvoviruso PGR pozityvumo rezultatais visoms žvejojamoms katėms, toliau apibūdinome koduojančias genomo sekas dviejose žvejojamose katėse, naudodami kelias pradmenų poras. ekstrahuoti nukleorūgščių mėginiai, gauti iš žarnyno (atvejis Nr.1) irinkstas(byla Nr.3). Buvo aptiktos 4 462 ir 4 430 bazinių porų pilnų koduojančių dviejų žvejų kačių CPPV-1 padermių genomų ir buvo priskirtos 19ZP004-TH/2019 (bylos Nr. 1, registracijos Nr. MW145540) ir 19ZP{ kamienai. {12}}TH/2019 (bylos Nr.3, st. Nr. MW145541), atitinkamai. Atlikus genetinę analizę, visi koduojantys genomai atskleidė genetiškai panašius rezultatus tarp CPPV-1 padermių, gautų iš žvejojančių kačių, parodydami, kad šios žvejojamos katės CPPV-1 buvo FPV. Išvestinis aminorūgščių palyginimas tarp CPPV-1 variantų ir žvejojančių kačių FPV aprašytas 1 lentelėje. Pažymėtina, kad žvejojantis kačių FPV atskleidė unikalias I566M ir M569R aminorūgščių mutacijas struktūriniame (VP1 ir 2) baltyme. , kurie nebuvo aptikti ankstesniuose CPPV-1 variantuose.

2 pav. CPPV-1 infekcija žvejojamoms katėms. Demonstracinės H&E (A), PAS dažymo (B), CPPV-1 IHC (C) ir in situ hibridizacijos (ISH) (D) mikrofotografijosinkstasnuo žvejojančių kačių. (A, B) Žvejybos katė Nr.3. (A) Daugiažidinisinkstųkraujavimas suinkstų kanalėliųvakuoliacija. Nedaug kanalėlių epitelio ląstelių buvo hipereozinofilinės su piknotiniais branduoliais (įdėklas, rodyklės). (B)Inkstų kanalėliųepitelio ląstelėse buvo citoplazminė vakuolė, o retų epitelio ląstelių branduoliai yra pūslelių pavidalo su kraštiniu branduolio chromatinu. PAS dažymas paryškino nepažeistą bazinę membraną (įdėklas). (C) Žvejybos katė Nr. 2. CPPV-1 IHC imunoreaktyvumas (tamsiai ruda spalva) buvo difuziškai stebimasinkstų kanalėliųir dažnai aptinkamas citoplazmojeinkstų kanalėliųepitelis (įdėklas). (D) Žvejybos katė Nr.1. CPPV-1 ISH imunoreaktyvumas (rausvai rožinė spalva) buvo gausiai pastebėtasinkstų kanalėlių(žvaigždutės), ir jis lokalizuotas branduoliuoseinkstų kanalėliųepiteliai (įdėklas, rodyklės). Juostos nurodo 50 μm (A, C) ir 120 μm (B, D).

Filogenetinė ir evoliucinė analizėNorint palyginti aptiktų žvejų kačių CPPV-1 ir kitų anksčiau paskelbtų CPPV-1 genomų genetinį ryšį, buvo atlikta filogenetinė analizė, pagrįsta visa koduojančia genomo seka. ML filogenetinis medis parodė, kad dauguma FPV, MEV ir CPV tarp grupių sudarė labai skirtingą kladą (4 pav.). Du tiriamų žvejybos kačių CPPV-1 genomai (pažymėti raudonais trikampiais) buvo sugrupuoti kartu su ta pačia anksčiau paskelbtų FPV sekų, gautų iš įvairių šeimininkų, linija, patvirtinanti, kad gautas

3 pav. CPPV-1 viruso dalelės branduolyjeinkstų kanalėliųepitelinės ląstelės. Transmisijos elektronų mikroskopija (TEM), naudojant pop-off techniką. Ultrastruktūrinis elektronų tankių dalelių klasterizacijos demonstravimas (rodyklės). Ikozaedrinių dalelių dydis buvo 19–22 nm skersmens, esančios branduolyjeinkstų kanalėliųepitelio ląstelės (įdėklas). Mastelio juostos, kaip parodyta paveikslėlyje.

žvejybos kačių CPPV{0}}buvo FPV. Aptikti genomai buvo suskirstyti į grupes ir labiausiai susiję su FPV genomu, aptiktu naminių kačių Tailande (prijungimo Nr. MN127780). Siekiant dar labiau išaiškinti aptiktos žvejų katės CPPV-1 evoliucijos procesą, buvo atlikti keli rekombinacijos aptikimai ir evoliucinės analizės 224 CPPV-1 pilnų genomo sekų duomenų rinkinyje. Rekombinacijos analizė atskleidė, kad žvejybos kačių CPPV-1 sekose nerasta jokių rekombinacijos įvykių. Šių duomenų evoliucinis medis parodė du pagrindinius skirtingus atskirtus kladus (5 pav.). Viename klade buvo FPV ir MEV, o kitame – visos CPV sekos. Apskaičiuota, kad bendras evoliucijos greitis yra 1,08 × 10–4 keitimai vietoje per metus (95 proc. HPD: 1,95–2,87 × 10–4). Evoliucinis medis parodė, kad žvejybos kačių FPV sekos buvo sugrupuotos toje pačioje FPV linijoje, kaip ir iš Tailando išskirtos. Jie turi bendrą genetinę evoliuciją su FPV genomais, aptiktais naminėse katėse Kinijoje, ir gali turėti tą pačią kilmę nuo maždaug 1970 m.

Diskusija

CPPV{0}} variantų, apimančių CPV ir FPV, cirkuliacija buvo nustatyta tiek naminiuose, tiek laukiniuose mėsėdžiuose. Nors mirtina CPPV-1 infekcija naminiams šunims ir katėms yra dažna, ši infekcija sporadiškai stebima laukiniams mėsėdžiams [46]. Keletas tyrimų parodė, kad daugelis laukinių mėsėdžių yra jautrūs CPPV-1 infekcijai, įskaitant laukinius kačius, audines, ūdras, skunkus, meškėnus, lapes, vilkus, kojotus, civetas ir kiaunes [11, 19]. Buvo pranešta, kad CPPV-1 variantais buvo užsikrėtusios tik Prionailurus genties leopardo katės [9]. Šiame tyrime aprašome natūralią CPPV -1 nario FPV infekciją laukinėse žvejybos katėse (Prionailurus viverrinus). Tai pirmoji ataskaita, kurioje aprašomas aiškus viruso pasiskirstymas ir tropizmasinkstų audiniaikaip patvirtino antigeninis nustatymas naudojant PGR, IHC, ISH ir ultrastruktūros TEM analizę.

Buvo pastebėtas CPPV-1 variantų perdavimas tarp naminių ir laukinių mėsėdžių, o kai kurie mirtini CPPV-1 protrūkiai buvo susiję su patogenų plitimu tarp buveinių [9, 11]. Dėl dabartinio laukinių gyvūnų buveinių praradimo laukinės kolonijos migruoja ir dalijasi buveinėmis su naminiais gyvūnais, todėl patogenų plitimas tarp imlių gyvūnų padidėjo. Šiame tyrime nustatėme, kad žvejų kačių CPPV-1 genomai turi bendrą evoliucinį modelį su FPV padermėmis, aptiktomis

4 pav. Filogenetinė topologija, atskleidžianti viso ilgio koduojančių sekų genetinį ryšį tarp žvejojančios katės CPPV-1 ir kitų CPPV-1 variantų. Filogenetinis medis parodė, kad žvejų katės CPPV-1 sekos (pažymėtos raudonais trikampiais) buvo sugrupuotos kartu su FPV genomais, kurių genomas labiausiai susijęs su Tailando katės FPV genomu (MN127780). Buvo nurodyti šioje analizėje naudotų anksčiau aprašytų CPPV-1 sekų GenBank prisijungimo numeriai.

naminių kačių Tailande. Šie rezultatai rodo panašų evoliucinį modelį kaip FPV padermės iš bendrų protėvių, išskirtų iš naminių kačių Kinijoje nuo 1970 m. Šis rezultatas gali reikšti galimus naminių kačių ir žvejojamų kačių perdavimo tarp skirtingų rūšių arba CPPV-1 variantų koevoliucijos įrodymus. Tačiau dėl riboto mėginių, paimtų iš laisvai klajojančių gyvūnų tose pačiose buveinėse, ir nedidelio tirtų žvejojamų kačių skaičiaus, šiame tyrime nepavyko nustatyti pirminio CPPV-1 rezervuaro, todėl reikia atlikti tolesnį tyrimą. . Nors keli tyrimai parodė, kad įvairios aminorūgščių liekanos kapsido geno yra susijusios ir su gebėjimu užkrėsti naujus šeimininkus, ir su CPPV -1 antigeniškumu [18, 47], vienos aminorūgšties mutacija 300 padėtyje. Buvo pranešta, kad kapsido baltymas (VP2) yra pagrindinis daugelio šeimininkų diapazonų determinantas [48]. Šiame tyrime CPPV-1 variantas, gautas iš žvejojančių kačių, atskleidė tokias pačias aminorūgščių struktūras, kaip ir FPV sekose, o alaninas (A) yra pagrindinis aminorūgšties determinantas 300 kapsidės padėtyje. CPPV-1 žvejybos katės kapsido baltymas atskleidė asparagino (N) ir alanino (A) aminorūgštis, esančias atitinkamai 564 ir 568 padėtyse (kurios laikomos svarbiomis FPV replikacijai kačių šeimininke). 2 unikalios aminorūgščių mutacijos I566M ir M569R padėtyse. Šios mutacijos gali atskirti šį virusą nuo anksčiau aprašytų CPPV{20}} variantų. Ankstesnė protėvių rekonstrukcijos analizė parodė, kad FPV gali užkrėsti skirtingus mėsėdžius su mažais VP2 geno pokyčiais [49]. Taigi, į FPV panašus parvovirusas preliminariai buvo pavadintas kaip potencialiai naujas virusas, aptiktas žvejojamose katėse, ir tai gali padėti pirmą kartą nustatyti šio viruso šioje rūšyje. Tačiau nedidelis tirtų žvejybos kačių skaičius, palyginti su nedideliu kitų sekų skaičiumi, gali nepateikti galutinio aiškinimo. Norint padaryti tikslesnes išvadas, tai reikia toliau tirti.

Žvejojančių kačių CPPV-1 lokalizacijos buvo pastebėtos įvairiuose audiniuose, įskaitant žarnyno epitelio ląsteles ir limfoidines ląsteles, kur dažniausia CPPV-1 infekcijos lokalizacija yra kitose rūšyse [20, 26, 50, 51 ]. Įdomu tai, kad pradinis viruso genomo aptikimo tyrimas naudojant PGR ir viruso lokalizavimas naudojant IHC atskleidė skirtingą viruso lokalizacijąinkstų audiniai, atlikome PAS dažymą, kad parodytume ląstelių architektūrąinkstų audinysir neįtraukti sisteminės hipoksijos kaip galimos kanalėlių nekrozės priežasties. PAS dažymas atskleidė, kad dauguma vamzdinių bazinių membranų buvo nepažeistos, o tai rodo, kad šis pažeidimas gali atsirasti ne dėl sisteminės hipoksijos [52]. Tačiau šį pažeidimą gali sukelti kitos priežastys, pavyzdžiui, toksinų sukelta kanalėlių nekrozė. Taigi, į FPV panašios parvovirusinės infekcijos vaidmuo, susijęs suinkstaspažeidimus vis dar reikia ištirti. Be to, bandėme toliau išsiaiškinti esamą viruso lokalizacijąinkstų audinysnaudojant ISH ir TEM su pop-off technika [37] srityse, kuriose buvo aptiktas CPPV-1 IHC imunoreaktyvumas. Elektronų tankios dalelės buvo pastebėtos branduolyjeinkstų kanalėliųepitelio ląstelės ir urotelio ląstelės, palaikančios teigiamą CPPV -1 imunoreaktyvumą in situinkstų audinys. FPV užsikrėtusios katės virusą išskiria daugiausia su išmatomis, tačiau buvo aprašytas aktyvaus viruso buvimas šlapime [53, 54]. Naujausi tyrimai parodė, kad parvovirusinė infekcija turi įtakosinkstų nepakankamumas[55]. Tačiau FPV ir CPV atitikmens lokalizacijainkstų audinysanksčiau nebuvo tirtas. Be to, pelėinkstasĮrodyta, kad parvovirusas (MKPV) yra nefrotropinis virusas, rodantis afinitetą užkrėsti ir lokalizuotisinkstų kanalėliųepitelio ląstelės, todėlinkstų ligos [56, 57].

Remiantis mūsų žiniomis, CPPV{0}} lokalizacijainkstusanksčiau nebuvo aprašyta. Tai rodo naują unikalios šios rūšies viruso lokalizacijos aprašymą arba net jei jį galima rasti FPV infekuotose katėse. Ši išvada gali patvirtinti ankstesnius tyrimus, kurių metu buvo nustatyta FPV šlapime. Unikalūs patologiniai radiniai gali būti subjektyvūs ir gali būti stebimi kaip infekcija. Taigi plataus masto žvejybos kačių CPPV-1 tyrimas palengvins galutinį aiškinimą. Be to, mėginiai, kurie buvo pateikti daugiausia iš negyvų gyvūnų ir kuriems jau buvo atlikta pomirtinė autolizė, nėra tinkami tolesniam šių gyvūnų organų paėmimui. Taigi mes negalėjome nustatyti viruso lokalizacijos kituose organuose. Žvejybinės katės CPPV-1 netipinės virusinės lokalizacijos išaiškinimas būtų naudingas tyrimas.

CISTANCHE PAGERINS INKSTŲ/INKSTŲ LIGĄ

CPPV-1 buvo nustatytas įvairiuose laukiniuose mėsėdžiuose ir yra susijęs su mirtinais protrūkiais. Šiame tyrime neigiami retrospektyvaus CPPV-1 aptikimo zoologijos sodo laukiniuose mėginiuose įrodymai gali atsirasti dėl glaudaus jautrių gyvūnų kontakto arba, kita vertus, dėl ilgo mėginių laikymo, kuris turi įtakos genominių medžiagų stabilumui. Šiame tyrime nustatytas naujas CPPV-1, susijęs su mirtina žvejojamų kačių infekcija, kelia susirūpinimą dėl naujos, galimai virulentiškos šio pažeidžiamo gyvūno ligos. Todėl būtina toliau tirti CPPV-1 perdavimą žvejojamoms katėms, kad būtų išvengta kitų imlių gyvūnų rūšių praradimo. Atitinkamai, siekiant valdyti CPPV-1 infekcijas ne tik šios rūšies, bet ir laisvai klajojančių naminių gyvūnų, kurie gali būti potencialūs šio viruso šeimininkai, reikėtų pabrėžti prevencijos strategijas.