Neuroprotekcinis izotiocianatų potencialas neurouždegimo in vitro modelyje

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Gauta: 2020 m. liepos 10 d. / Priimta: 2020 m. spalio 25 d. / Paskelbta internete: 2020 m. lapkričio 16 d.

© Autorius (-ai) 2020 m

Cistanche žolelių miltelių funkcija: turi labai gerąneuroprotekcinis poveikis

Abstraktus

Izotiocianatai (ITC), esantys kaip gliukozinolato pirmtakai kryžmažiedžių daržovėse, parodėpriešuždegiminis, antioksidacinė ir antikancerogeninė veikla. Čia palyginome trijų skirtingų ITC poveikį ROS gamybai ir matricos metaloproteinazės (MMP) -2 ir -9, kurios yra svarbūs įvairių neurologinių ligų patogenetiniai veiksniai, ekspresijai. Pirminės žiurkių astrocitų kultūros buvo aktyvuotos LPS ir vienu metu apdorotos skirtingomis alilizotiocianato (AITC), 2-fenetilizotiocianato (PEITC) ir 2-sulforafano (SFN) dozėmis. Rezultatai parodė, kad SFN ir PEITC sugebėjo neutralizuoti H2O2 sukeltą ROS gamybą. Ląstelių kultūrų supernatantų zimografinė analizė parodė, kad PEITC ir SFN buvo veiksmingiausi MMP-9 inhibitoriai, o tik SFN reikšmingai slopino MMP{7}} aktyvumą. PGR analizė parodė, kad visi naudojami ITC reikšmingai slopino ir MMP{8}}, ir MMP-9 ekspresiją. Mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės (MAPK) signalizacijos kelio tyrimas parodė, kad ITC moduliuoja MMP transkripciją, slopindami ekstraląstelinės reguliuojamos baltymų kinazės (ERK) aktyvumą. Šio tyrimo rezultatai rodo, kad ITC gali būti perspektyvios maistinės medžiagos, skirtos neurologinių ligų, susijusių su MMP dalyvavimu, prevencijai ir papildomam gydymui.

RaktažodžiaiAntioksidantas · Priešuždegiminis · Izotiocianatas · Matricinės metaloproteinazės · Neurodegeneracinės ligos

Įvadas

Neurouždegimas yra sudėtingas atsakas į smegenų pažeidimą, apimantis biocheminių įvykių pakopą, dėl kurio suaktyvėja centrinės nervų sistemos (CNS) ląstelės. Nenormalus astrocitų aktyvinimas pažeidžia jų neuroprotekcinį vaidmenį, todėl išsiskiria uždegiminiai mediatoriai, tokie kaip reaktyviosios deguonies rūšys (ROS), azoto oksidas (NO), citokinai, chemokinai ir matricos metaloproteinazės.

(MMP).

MMP yra didelė neutralių, nuo Zn2 plius priklausomų endopeptidazių šeima, kurios pagrindiniai taikiniai yra tarpląstelinės matricos (ECM) komponentai, tokie kaip fibronektinas, kolagenas, elastinas ir lamininas (Latronico ir Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Bario universiteto Biomokslų, biotechnologijų ir biofarmacijos katedra „Aldo Moro“,

Baris, Italija

Bazilikatos universiteto mokslų skyrius, Potenza,

Italija

CNS MMP dalyvauja įvairiose fiziologinėse reakcijose, tokiose kaip morfogenezė, apyvarta ir ECM remodeliavimas, embriogenezė ir žaizdų taisymas; tačiau kai MMP išvengia reguliavimo mechanizmų, jie tampa žalingi (Rosenberg 2009; Agrawal ir kt. 2008).

Šiuo atžvilgiu žinoma, kad MMP raiškos ir aktyvumo pokyčiai yra pagrindiniai kelių neurologinių sutrikimų patogenetiniai įvykiai (Latronico ir Liuzzi 2017; Mastroianni ir Liuzzi 2007; Brkic ir kt., 2015). Eksperimentiniai įrodymai rodo, kad tarp MMP želatinazės A (MMP-2) ir B (MMP-9) yra ypač susijusios su neurouždegimu, nes jų reguliavimas gali pakenkti kraujo ir smegenų barjero (BBB) ​​vientisumui. Dėl to padidėja imuninių periferinių kraujo kūnelių pritraukimas ir įsiskverbimas į smegenų parenchimą, kuris tęsia uždegiminį procesą, kuris yra progresuojančio neuronų nykimo ir neuronų funkcijos sutrikimo priežastis (Rivest 2009). Keli tyrimai in vitro ir in vivo parodė, kad ROS gamyba yra vienas iš veiksnių, susijusių su MMP-9 ekspresijos reguliavimu smegenų ląstelėse, naudojant nuo mitogeno aktyvuotos proteinkinazės (MAPK) signalizacijos kelio priklausomus mechanizmus (Hsieh ir Yang 2013).

Remiantis šiais įrodymais, aišku, kad sumažėjęs neurotoksinių veiksnių reguliavimas, dėl kurio sumažėja neurouždegiminis atsakas, gali būti veiksminga terapinė strategija siekiant užkirsti kelią smegenų ligų atsiradimui arba palengvinti jų progresavimą.

Pastaraisiais metais biomedicinos susidomėjimas neurologine sritimi vis labiau sutelkiamas į natūralių junginių, galinčių moduliuoti procesus, susijusius su neurouždegiminėmis reakcijomis, tyrimus. Šiuo atžvilgiu keli tyrimai parodė, kad fitocheminiai junginiai, tokie kaip polifenoliai, izotiocianatai (ITC) ir kiti, turi neuroprotekcinį potencialą, kuris taip pat atsiranda dėl jų gebėjimo slopinti MMP ekspresiją ir neutralizuoti ROS gamybą (Dinkova-Kostova ir Kostov). 2012; Liuzzi ir kt., 2007, 2011).

Izotiocianatai yra metabolitai, kuriuos gamina keli augalai, priklausantys Brassicaceae šeimoms, kaip apsaugos nuo patogenų atakos sistemą (Bones ir Rossiter 2006). Jie atsiranda dėl fermentinio gliukozinolatų (GSL) skaidymo, veikiant fermentui mirozinazei. ITC yra dažnai vartojamose kryžmažiedžių daržovėse, tokiose kaip brokoliai, Briuselio kopūstai, kopūstai, ropės, krienai, kaliaropės, garstyčios, ridikai, rėžiukai ir kopūstai. Jų kiekis maiste yra labai įvairus ir priklauso nuo maisto perdirbimo ir paruošimo.

Pastaruoju metu buvo įrodyta, kad ITC turi įvairų gydomąjį poveikį, įskaitant antioksidacinį, antibakterinį, priešuždegiminį ir chemoprevencinį poveikį (Dufour ir kt., 2015; Marzocco ir kt., 2015).

Apsauginis ITC aktyvumas vykdomas moduliuojant skirtingus signalizacijos kelius, susijusius su detoksikacija, uždegimu, apoptoze ir ląstelių ciklo reguliavimu. Keletas įrodymų rodo, kad antikancerogeninės ir priešuždegiminės ITC savybės daugiausia gali būti siejamos su jų gebėjimu aktyvuoti su branduoliniu faktoriumi susijusį eritroidinį 2-2 faktorių (Nrf2) kelią. Nrf2 yra redoksui jautrus transkripcijos faktorius, kuris, esant elektrofiliniams agentams ir oksidacinio streso sąlygoms, persikelia į branduolį, kur sujungia antioksidacinio atsako elementus (ARE), sukeldamas citoprotekcinių genų, dalyvaujančių detoksikacijoje ir oksidacinių sąlygų moduliavime, ekspresiją. uždegiminiai procesai (Heiss ir kt., 2001). Šiuo atžvilgiu buvo pranešta, kad ITC gali padidinti žmogaus ląstelių antioksidacinį pajėgumą, skatindamos II fazės detoksikuojančių fermentų ekspresiją ir reguliuodami GSH gamybą (Wagner ir kt., 2010). Be to, buvo pranešta, kad egzistuoja kryžminis pokalbis tarp Nrf2 ir branduolinio faktoriaus (NF)-κB kelio, dėl kurio moduliuojamas uždegimas (Sturm ir Wagner 2017; Lee ir Johnson 2004). Šiuo atžvilgiu įvairūs eksperimentiniai neurouždegimo modeliai in vitro ir in vivo parodė, kad ITC gali žymiai sumažinti NF-κB translokaciją ir dėl to slopinti priešuždegiminius citokinus ir MMP (Lee ir kt., 2015; Subedi ir kt., 2017).

Šiame darbe ištyrėme trijų ITC, ty alilo izotiocianato (AITC), 2-fenetilizotiocianato (PEITC) ir 2-sulfafano (SFN) poveikį MMP išsiskyrimui-2 ir -9, taip pat LPS aktyvuotų astrocitų ROS gamybą. Mūsų rezultatai parodė, kad PEITC, SFN ir AITC gali in vitro slopinti MMP-9 ir MMP-2 ekspresiją LPS aktyvuotuose astrocituose ir neutralizuoti H2O2 sukeltą ROS gamybą. Be to, mes parodėme, kad ITC moduliuoja per didelę MMP ekspresiją mechanizmais, susijusiais su ekstraląstelinio reguliuojamo baltymo kinazės (ERK) aktyvumo slopinimu. Šie rezultatai rodo, kad dieta, kurioje gausu kryžmažiedžių daržovių, gali būti naudinga neurologinių ligų profilaktikai ir papildomam gydymui.

medžiagos ir metodai

Cheminės medžiagos ir reagentai

Dulbecco modifikuotą Eagle terpę (DMEM), vaisiaus galvijų serumą (FBS), peniciliną ir streptomiciną pateikė GIBCO (Paislis, Škotija). Želatina, DNazė 1, poli-L-lizinas

(PLL), tripsinas, lipopolisacharidas (LPS), tripano mėlynasis ir 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2.5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) ), Alilo izotiocianatas (AITC) [menkė. 377 430, grynumas 95 procentai (HPLC)], 2-Fenetilizotiocianatas (PEITC) [menkės. 253 731, grynumas 99 procentai )], 2-Sulforafanas (SFN) [menkė. S6317, grynumas didesnis nei arba lygus 95 procentams (HPLC)] buvo pateikta iš Sigma (St. Louis, MO, JAV). 2′,7′-dichlorfluoresceino diacetatas (DCFH-DA) buvo įsigytas iš Calbiochem. Standartiniai baltymai ir R-250 Coomassie Brilliant Blue buvo iš Bio-Rad (Hercules, CA, JAV). Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antikūnai (RRID: AB_2294571) buvo įsigyti iš Serotec (Oksfordas, JK). Antikūnai prieš ekstraląstelines reguliuojamas baltymų kinazes (ERK) 1/2 ir fosforilintą ERK 1/2 (p-ERK 1/2) buvo iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hybond-P PVDF membranos, sustiprintos chemiliuminescencijos (ECL) Western Blotting analizės sistema ir anti-pelės-HRP antrinis antikūnas buvo iš GE

Sveikatos priežiūros ir gyvybės mokslai (Little Chalfont, Bakingemšyras,

Jungtinė Karalystė). Pradmenų poros, būdingos MMP{0}}, MMP-9 ir 18S rRNR, buvo iš Sigma Genosys (Cambs, JK). RNeasy mini rinkinys ir QuantiTect Reverse Transcription rinkinys buvo įsigyti iš Qiagen (Valensija, CA, JAV). Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix reagentai PGR buvo įsigyti iš Lucigen Corporation (Middleton, WI, JAV).

Etikos pareiškimas

Eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti pagal NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo rekomendacijas ir pritarus Bario universiteto (Italija) instituciniam gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetui (leidimo numeris: 23-98- A).

Astrocitų kultūrų paruošimas

Astrocitai buvo paruošti iš {{0}}dienų Wistar žiurkių (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Italija) neokortikinių audinių. Astrocitams paruošti buvo panaudotos 6 vados po 12 abiejų lyčių jauniklių. Gyvūnai buvo nužudyti veikiant anglies dioksidu (CO2) ir nužudyti greitai nukirsdami galvą. Neokortikiniai audiniai buvo išpjaustyti ir naudojami pirminių glijos ląstelių kultūrų valymui pagal metodą, aprašytą Latronico ir kt. (2018). Trumpai tariant, po skrodimo žiurkių smegenys buvo išeikvotos nuo smegenų dangalų ir kraujagyslių, mechaniškai susmulkintos ir suvirškintos 0,25 proc. tripsinu dalyvaujant 0.01 proc. DNazei. Po centrifugavimo ir ląstelių gyvybingumo įvertinimo ląstelės buvo dedamos į PLL dengtas kolbas (75 cm2), kurių tankis buvo 1,5 × 107 ląstelės/kolboje DMEM, 10 procentų FBS, 100 TV mL -1 penicilino, 100 µg ml -1 streptomicino. ir palaikoma 37 laipsnių 5 procentų CO2. Po 7 dienų kolbos buvo sukratytos, kad būtų pašalinti oligodendrocitai ir mikroglijos. Astrocitų grynumas, gautas atliekant tripsinizaciją (0,25 proc. tripsino / 0,02 proc. EDTA), buvo įvertintas imuniniu dažymu GFAP.

LPS aktyvuotų astrocitų gydymas alilizotiocianatu, fenetilizotiocianatu arba 2-sulfafanu

Susilieję astrocitai, pasėti į 96 šulinėlių plokšteles, buvo stimuliuojami 10 µg ml–1 LPS ir tuo pačiu metu apdoroti skirtingomis koncentracijomis alilizotiocianatu (AITC), 2-fenetilizotiocianatu (PEITC) arba 2-sulfafanu. (SFN) DMEM be serumo. Astrocitai be serumo DMEM ir LPS aktyvuotuose astrocituose buvo atitinkamai neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai. Be to, kadangi pradiniai AITC (100 µM), PEITC (67 µM) ir SFN (56,4 µM) tirpalai buvo pagaminti DMSO, dozės ir atsako kreivė į DMSO, praskiestą auginimo terpėje, esant tokiai pačiai tirpiklio koncentracijai. analizuoti mėginiai, buvo paleisti siekiant įvertinti junginio toksiškumą. Po 20 valandų inkubacijos 37 laipsnių temperatūroje, 5 procentai CO2, supernatantai buvo surinkti ir laikomi -20 laipsnių temperatūroje iki naudojimo, o ląstelės buvo tiriamos MTT, siekiant įvertinti ląstelių gyvybingumą.

MTT ląstelių gyvybingumo tyrimas

AITC, PEITC ir SFN citotoksiškumas astrocitams buvo aptiktas naudojant MTT [{{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,{{5 }}difeniltetrazolio bromido] tyrimas. Šis tyrimas pagrįstas MTT redukavimu gyvybingose ​​ląstelėse veikiant mitochondrijų sukcinato dehidrogenazei iki netirpaus mėlynojo formazano produkto, kurį galima išmatuoti spektrofotometriškai. Trumpai tariant, po 20 valandų apdorojimo AITC, PEITC arba SFN, auginimo terpė buvo pašalinta ir ląstelės buvo pakrautos 0, 5 mg ml-1 MTT. Po 2 valandų inkubacijos 37 laipsnių temperatūroje 5 procentai CO2 terpė buvo pašalinta, o formazano kristalai ląstelėse buvo ištirpinti 90 procentų etanolyje. Po 15 min. plakimo plokštelių, kad kristalai visiškai ištirptų, formazano produkto kiekis buvo nustatytas pagal optinę absorbciją esant 560 nm, kai pamatinis bangos ilgis yra 690 nm. Ląstelių gyvybingumas buvo išreikštas procentais nuo kontrolės (CTRL), atstovaujamos neapdorotomis ląstelėmis, kuri buvo nustatyta 100 procentų. Kiekvienam junginiui buvo gauta ląstelių gyvybingumo dozės ir atsako kreivė.

Reaktyviųjų deguonies rūšių aptikimas

Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) aptikimas buvo atliktas įkeliant astrocitus 10 μM 2′,7′-dichlorfluoresceino diacetato (DCFH-DA) DMEM be fenolio raudonumo 37 laipsnių temperatūroje 30 min. Tada DCFH-DA buvo pašalintas iš šulinių ir ląstelės 1 valandą buvo apdorotos AITC (400 μM), PEITC (10 μM) arba SFN (25 μM) fenolio raudonumo neturinčiame DMEM, esant H2O2, kai galutinė koncentracija 100 μM. . Ląstelės, apdorotos tik DCFH-DA arba H2O2, buvo atitinkamai neigiamos (CTRL) ir teigiamos kontrolės (H2O2). Po inkubacijos ląstelės buvo plaunamos PBS ir lizuojamos

Tris-HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Tritonas X-100 0,5 proc., pH 7,5,

tada centrifuguojama 10,000×g, 4 laipsnių 10 min. Supernatantai buvo surinkti ir jų spektrofluorimetrinė analizė atlikta esant 525 nm, sužadinant 485 nm. Rezultatai buvo normalizuoti pagal bendrą baltymų kiekį, o ROS gamyba buvo išreikšta santykine fotoliuminescencijos (PL) intensyvumo procentine dalimi, palyginti su teigiama kontrole.

Želatinazių aptikimas

Želatinazės aktyvumas ląstelių supernatantuose (SN) buvo aptiktas zimografine analize, kaip pranešė Latronico ir kt. (2013). Trumpai tariant, SN kiekis, atitinkantis apie 10 µg visų baltymų, buvo ištirpintas 30 µl Laemmli mėginio buferio be -merkaptoetanolio. Mėginiai buvo paleisti 7,5 procento poliakrilamido gelyje, kopolimerizuotame su 0,1 procento (masės/tūrio) želatina. Po elektroforezės geliai buvo du kartus skalauti 2,5 proc. Triton X-100/10 mM CaCl2 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, ir inkubuoti 24 valandas 37 laipsnių temperatūroje 1 proc. Triton X{19}} /50 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Geliai buvo nudažyti Coomassie briliantiškai mėlyna R-250 ir nudažyti metanolyje/acto rūgštyje/vandenyje (4:1:5 t./t.). Želatinazės aktyvumas buvo vizualizuotas kaip aiški virškinimo juosta mėlyname gelio fone ir buvo kiekybiškai įvertinta atliekant kompiuterinę densitometrinę vaizdo analizę, naudojant Image LabTM programinę įrangą (Bio-Rad Laboratories). Želatinazė

aktyvumas buvo išreikštas kaip optinis tankis (OD) × mm2, rodantis skenavimo plotą po kreivėmis, atsižvelgiant į substrato lizės zonos ryškumą ir plotį. Duomenys buvo išreikšti naudojant šią lygtį: procentinis slopinimas=[100 − (OD mėginys / OD teigiama kontrolė) × 100].

Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (RT-PGR)

Astrocitai, pasėti į 6 šulinėlių plokšteles, buvo aktyvuoti LPS (10 µg ml-1) ir tuo pačiu metu apdoroti ITC, esant didžiausiai netoksinei koncentracijai. Po 20 valandų inkubacijos visa RNR buvo išskirta iš astrocitų naudojant Qiagen RNeasy mini rinkinį pagal gamintojo instrukcijas. Komplementari DNR (cDNR) buvo susintetinta iš 500 ng RNR, naudojant QuantiTect Reverse Transcription rinkinį pagal gamintojo instrukcijas. Iš viso buvo panaudota 25 ng atvirkštinės transkripcijos produktų 591 bp fragmentui amplifikuoti naudojant specifinius pradmenis (sense 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisense 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) žiurkės MMP-2 sekai ir 541 bp fragmentui, naudojant specifinius pradmenis (sensinis 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; antisensinis 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) žiurkės MMP-9 sekai. Lygiagrečiai buvo atliktas žiurkės 18S rRNR (sensinis 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisensinis 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), santykinai nekintamas vidinis etaloninis genas, 308 bp fragmento amplifikacija. . Pradmenų rinkiniai, jau patvirtinti kituose tyrimuose (Latronico ir kt., 2013; Liuzzi ir kt., 2004; Gramegna ir kt., 2011), konkrečiai atpažįsta tik dominančius genus, kaip rodo vienos laukiamo dydžio PGR juostos amplifikacija. Produktai. PGR amplifikacija buvo atlikta 25 ciklais, kurių kiekvienas susideda iš denatūravimo 94 laipsniais, atkaitinimo 59 laipsniais ir pratęsimo 72 laipsnių kampu. Po amplifikacijos produktai buvo analizuojami 1,5 procento agarozės gelyje. Atlikus densitometrinę gelių analizę, tikslinių genų amplifikacija buvo normalizuota iki 18S rRNR ekspresijos, o rezultatai buvo išreikšti kaip slopinimo procentas, palyginti su teigiama kontrole, kaip nurodyta želatinazės kiekybiniam įvertinimui.

ERK 1/2 fosforilinimo aptikimas Western blot analize

ERK 1/2 buvo aptikti imunobloto analize, kaip aprašyta Latronico ir kt. (2018). Trumpai, susiliejanti pirminė

astrocitai, pasodinti į {{0}}šulinėlių plokšteles, 24 valandas ramiai leisti terpėje be serumo, 1 valandą buvo iš anksto apdoroti AITC (400 μM), PEITC (10 μM), arba SFN (25 μM) DMEM be fenolio raudonumo. Po 2 valandų stimuliacijos 10 ug mL-1 LPS, ląstelės buvo lizuojamos naudojant 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM Na-pirofosfato, 1 mM -glicerofosfato 1 proc. Triton X{19}}, 1 mM. fenilmetilsulfonilfuoridas, 20 ug/mL aprotinino, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuorido, 1 mM Na3VO4, pH 7,5. Šešiasdešimt µg visų kiekvieno mėginio baltymų buvo atskirti 10 procentų SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze, o baltymai buvo imunoblotuojami ant polivinilideno difluorido membranų. Užblokavus per naktį 4 laipsnių temperatūroje 0,05 procento Tween 20, 1 procento pieno, 1 procento galvijų serumo albumino 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), membranos buvo tiriamos per naktį 4 laipsnių temperatūroje monokloniniu anti-p- ERK 1/2 antikūnas (1:500). Tada membranos tris kartus plaunamos 0,05 proc. Tween 20 Tris buferiniame fiziologiniame tirpale, zonduojamos antriniu antikūnu prieš pelės krienų peroksidazę (1:20,{56}}) 2-h 24 laipsnių temperatūroje ir aptiktos. su padidinta chemiliuminescencija. Norint įvertinti bendrą ERK kiekį, membranos buvo nuplėštos ir inkubuojamos su antikūnu, specifiniu nefosforilintam ERK 1/2 (1:500). Juostos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas densitometriniu dėmių skenavimu, o ERK 1/2 fosforilinimo lygiai buvo normalizuoti iki nefosforilinto ERK 1/2 ir išreikšti procentais, palyginti su teigiama kontrole (astrocitai, apdoroti LPS), pagal sekanti lygtis:

procentas pERK 1/2=(OD mėginys / ODteigiamas kontrolė) × 100.

Statistinė analizė

Duomenų analizė atlikta naudojant GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diegas, CA, JAV). Duomenys buvo išreikšti vidutinėmis reikšmėmis ± SD. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), po kurios buvo atliktas Dunnett's Multiple Comparison post hoc testas.

Rezultatai

Izotiocianato junginių poveikis astrocitų gyvybingumui

Buvo atlikti preliminarūs eksperimentai, siekiant įvertinti AITC, PEITC arba SFN citotoksiškumą. Šiuo tikslu išgryninti astrocitai 20 valandų buvo apdoroti ITC junginiais, kurių koncentracija svyravo nuo 5 iki 400 µM, arba DMSO, praskiestu auginimo terpėje, kaip aprašyta metodo skyriuje. Kaip parodyta 1 pav., DMSO nebuvo toksiškas visomis naudotomis koncentracijomis, atitinkančiomis tirtų ITC tirpalų koncentracijas. Tarp tirtų ITC AITC

1 pav. Astrocitų, apdorotų izotiocianato junginiais, ląstelių gyvybingumas. Susilieję pirminiai astrocitai buvo 20 valandų apdoroti alilo izotiocianatu (AITC), 2-fenetilizotiocianatu (PEITC) arba 2-sulfafanu (SFN) nurodytomis koncentracijomis, tada buvo atliktas MTT tyrimas. Be to, kadangi jis pradiniuose tirpaluose buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO), kiekviename eksperimente buvo atlikta DMSO dozės ir atsako kreivė, praskiesta auginimo terpėje ta pačia tirpiklio koncentracija (procentais), esančia ITC mėginiuose. patikimas ITC toksiškumo įvertinimas. Kontrolė (CTRL) buvo pakartota

kvepiantis iš neapdorotų astrocitų DMEM be serumo. Grafikai rodo ląstelių gyvybingumo dozės ir atsako kreives, išreikštas ląstelių išgyvenimo procentais, palyginti su kontroline medžiaga. Didžiausia netoksiška koncentracija buvo pasirinktos junginių dozės, kurios nulėmė ląstelių gyvybingumą virš 60 procentų. Vertės yra vidutinės ± SD iš n=3 eksperimentų, atliktų su skirtingomis ląstelių populiacijomis. Mikrografijos rodo reprezentatyvius ląstelių morfologijos rezultatus, stebimus fazinio kontrasto mikroskopu (50 kartų padidinimas) po apdorojimo skirtingais junginiais.

buvo mažiau toksiškas astrocitams. Visų pirma, AITC nebuvo toksiškas ląstelėms iki 400 µM, o PEITC ir SFN buvo toksiški, kai koncentracija buvo atitinkamai didesnė nei 10 ir 25 µM. Mikroskopinis stebėjimas patvirtino MTT tyrimo rezultatus, rodančius, kad esant toksinėms PEITC ir SFN koncentracijoms, sumažėjo astrocitų skaičius, o likusieji rodė citotoksinius citoplazmos pokyčius.

Apsauginis ITC junginių poveikis ROS gamybai vandenilio peroksidu apdorotuose astrocituose

Siekiant įvertinti apsauginį ITC poveikį oksidaciniam stresui, astrocitai buvo iš anksto apdoroti PEITC, AITC ir SFN maksimalia netoksiška koncentracija, tada stimuliuojami H2O2. H2O2 sukelta intracelulinė ROS gamyba buvo ištirta DCFH-DA. Kaip parodyta 2 pav., H2O2 poveikis sustiprino fluorescencinį signalą

2 pav. Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba astrocituose, apdorotuose ITC. ROS buvimas buvo ištirtas matuojant 2′,7′-dichlorfluoresceino (DCFA) fluorescencinio signalo pokyčius, kaip nurodyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Astrocitai, pasėti į 6 šulinėlių plokšteles, buvo iš anksto apdoroti DCFA 3 0 min., po to 1 val. apdorojami 10 μM PEITC, 400 μM AITC arba 25 μM SFN, dalyvaujant H2O2, kai galutinė koncentracija 100 μM . Astrocitai, apdoroti vien DCFA (CTRL) arba 100 μM H2O2, buvo atitinkamai neigiama ir teigiama kontrolė. Ląstelių lizatuose aptiktas fluorescencinis signalas buvo matuojamas fluorometru esant 525 nm, sužadinant 485 nm. ROS gamyba buvo išreikšta fotoliuminescencijos (PL) intensyvumo procentais (procentais), palyginti su teigiama kontrole. Vertės yra vidutinės ± SD iš n=3 eksperimentų, atliktų su skirtingomis ląstelių populiacijomis. Statistiškai reikšmingas sumažėjimas, palyginti su H2O2, žymimas žvaigždutėmis (vienpusė ANOVA, po kurios seka Dunnet post hoc testas; *p <>

astrocitų, palyginti su kontrole (CTRL). Kaip rodo DCF fluorescencijos intensyvumo sumažėjimas, išankstinis astrocitų apdorojimas ITC junginiais neutralizavo H2O2 sukeltą ROS susidarymą. Iš išbandytų ITC tik PEITC ir SFN sugebėjo žymiai sumažinti ROS gamybą atitinkamai maždaug 20 ir 24 procentais, palyginti su teigiama kontrole (H2O2).

Izotiocianato junginiai slopina MMP-2 ir MMP-9 lygį LPS aktyvuotuose astrocituose

ITC junginių poveikis MMP{0}} ir MMP-9 lygiams buvo įvertintas astrocituose, aktyvuotuose su LPS, kuri, kaip žinoma, sukelia želatinazių ekspresiją (Gottschall ir Deb, 1996), ir tuo pat metu apdorotų AITC. PEITC arba SFN koncentracijų diapazone, kurie nebuvo toksiški ląstelėms. Kaip parodyta 3a pav., ant gelio buvo dvi aiškios 72 ir 92 kDa virškinimo juostos, atitinkančios atitinkamai MMP-2 ir MMP-9. Astrocitų aktyvinimas naudojant LPS padidino MMP{8}} lygį ir paskatino MMP-9 sintezę. Gydymas AITC (3b pav.), PEITC (3c pav.) arba SFN (3d pav.) nustatė nuo dozės priklausomą.

MMP{0}} lygio sumažėjimas, kuris skyrėsi priklausomai nuo naudojamo junginio. Visų pirma, tarp naudojamų ITC, SFN buvo veiksmingiausias slopinant MMP-9, nes jis nustatė 70 procentų slopinimą vartojant 10 μM ir 100 procentų slopinimą, kai dozė buvo 25 μM. Be to, tik didžiausios netoksiškos koncentracijos SFN galėjo reikšmingai slopinti MMP-2 (2d pav.).

Izotiocianato junginiai slopina MMP-2 ir MMP-9 genų ekspresiją LPS aktyvuotuose astrocituose

Siekiant nustatyti, ar tirti ITC junginiai galėjo slopinti MMP-2 ir MMP-9 ekspresiją, buvo atlikta RT-PGR LPS aktyvuotiems astrocitams, apdorotiems maksimalia netoksiška ITC koncentracija. Kaip parodyta 4a pav. reprezentaciniuose gelyje, LPS aktyvuotų astrocitų gydymas atskirais ITC galėjo neutralizuoti padidėjusią MMP-2 ir MMP-9 mRNR ekspresiją. Kaip parodyta 4b pav., kiekybinė rezultatų analizė parodė, kad esant didžiausiai netoksinei koncentracijai, ITC junginiai nustatė statistiškai reikšmingą MMP{11}} ir MMP{12}} ekspresijos slopinimą, palyginti. į teigiamą kontrolę (LPS). Visų pirma, PEITC ir SFN daro tą patį procentą MMP{13}} (85 proc.) ir MMP{15}} (100 proc.) slopinimo, o AITC buvo mažiau veiksmingas nei PEITC ir SFN slopinant MMP{17} } (65 proc. ) ir MMP-9 (90 proc. ) išraišką.

ERK 1/2 dalyvauja slopinant MMP ekspresiją ITC

Kadangi ERK 1/2 yra pagrindinis signalų perdavimo kelias, dalyvaujantis reguliuojant MMP-2 ir MMP-9 ekspresiją LPS aktyvuotuose astrocituose (Lee ir kt., 2003), ITC junginių poveikis buvo išbandytas ekstraląsteliniu būdu reguliuojamų proteinkinazių (ERK) aktyvavimas 1/2.

Kaip parodyta 5 pav., LPS sukėlė statistiškai reikšmingą fosforilinto ERK 1/2 (p-ERK) kiekio padidėjimą, kuris buvo neutralizuotas iš anksto apdorojus ITC junginiais.

Diskusija

Plačiai manoma, kad pagrindinės apsaugos nuo daugelio ligų strategijos daugiausia yra rizikos veiksnių vengimas ir teisingas gyvenimo būdas. Yra daug mokslinių įrodymų, patvirtinančių hipotezę, kad kai kurie natūralūs metabolitai, kuriuos paprastai gamina įvairių rūšių vaisiai ir daržovės, gali pakeisti patologinius reiškinius, tokius kaip vėžys, neurologinės ligos ir kitos daugiafaktorinės ligos. Pagal šį scenarijų izotiocianatai (ITC) sukėlė didelį susidomėjimą dėl jų priešgrybelinių, antibakterinių,

3 pav. Izotiocianato junginių poveikis MMP-2 ir MMP-9 lygiams LPS aktyvuotuose astrocituose. Pateiktas reprezentatyvus zimografinis gelis, kuriame analizuojami kultūros supernatantai iš astrocitų, aktyvuotų LPS (10 ug ml -1) ir tuo pačiu metu 20 val. apdorotų AITC, PEITC arba SFN nurodytomis koncentracijomis (μM). Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai buvo gauti iš nestimuliuotų ir neapdorotų astrocitų terpėje be serumo (CTRL) ir LPS-

aktyvuotos ląstelės (LPS). Histogramos b–d rodo n {{0}} eksperimentų, atliktų su skirtingomis ląstelių populiacijomis, rezultatus (vidurkis ± SD), išreikštus MMP slopinimo procentais, palyginti su LPS, apskaičiuotus atlikus nuskaitymo densitometriją ir kompiuterinę gelių analizę. . Statistiškai reikšmingas sumažėjimas, palyginti su LPS, žymimas žvaigždutėmis (vienpusė ANOVA, po kurios atliktas Dunnet post hoc testas; *p < 0,05,="" **p=""><>

antikancerogeninės, antimutageninės, antioksidacinės ir priešuždegiminės biologinės savybės (Dufour ir kt., 2015; Marzocco ir kt., 2015; Vig ir kt., 2009; Talalay ir Fahey, 2001). Izotiocianatai atsiranda dėl fermentinio gliukozinolatų (GSL) skilimo, kurie yra antriniai metabolitai, esantys 15-oje Capparales eilės botaninių šeimų ir yra labai gausūs Brassicaceae šeimoje (Fahey ir kt., 2001). GSL hidrolizuoja mirozinazė (-tiogliukozido gliukohidrolazė e; EC 3.2.3.147) įvairiuose komponentuose, tokiuose kaip ITC, nitritai, tiocianatai, epitionitrilai, SFGate, gliukozė ir oksazolidinai (Li ir Kushad2005). Nors ITC buvo plačiai ištirta chemoterapijos srityje (Grundemann ir Huber 2018), buvo atlikta nedaug tyrimų apie jų terapinį potencialą sergant neurologinėmis ligomis, nepaisant to, kad buvo įrodyta, kad SFN ir AITC geba kirsti BBB ir kauptis smegenų parenchimoje. (Clarke ir kt. 2011; Jazwa ir kt. 2011; Zhang 2010). Šiame dokumente palyginome trijų ITC poveikį,

yra keliose dažniausiai vartojamose kryžmažiedėse daržovėse, dėl reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamybos ir matricos metaloproteinazės (MMP) ekspresijos neurouždegimo in vitro modelyje, kurį vaizduoja astrocitai, aktyvuoti lipopolisacharidu (LPS) arba apdoroti H2O2. Astrocitai, gausiausias CNS glijos ląstelių tipas, vaidina lemiamą vaidmenį palaikant smegenų homeostazę ir yra įvairių neurologinių ligų požymiai (Cekanavičiūtė ir Buckwalter 2016; Colombo ir Farina 2016). Jie laikomi esminiais įgimto imuninio atsako reguliatoriais ir jų atsakas į žalingus įžeidimus, tokius kaip oksidacinis stresas, gali sustiprinti uždegimines reakcijas ir audinių pažeidimus arba skatinti audinių atstatymą. Gerai žinoma, kad aktyvuoti astrocitai gamina neurotoksinius veiksnius, tokius kaip MMP, kurie atlieka pagrindinį vaidmenį skatinant neurouždegimą ir progresuojantį neuronų praradimą sergant neurologinėmis ligomis (Hsieh ir Yang 2013). Todėl moduliavimas

4 pav. ITC junginių poveikis MMP-2 ir MMP-9 ekspresijai LPS aktyvuotuose astrocituose. Astrocitai, pasėti į 6 šulinėlių plokšteles, buvo aktyvuoti LPS (10 µg ml-1) ir tuo pačiu metu 20 valandų apdoroti AITC (400 µM), PEITC (10 µM) arba SFN (25 µM), tada buvo paveikti RT-PGR. Tipiški MMP-2 ir MMP-9 ekspresijos agarozės geliai aprašyti (a). Histogramos (b) rodo n=3 eksperimentų, atliktų skirtingose ​​ląstelėse, rezultatus (vidurkis ± SD).

įvykiai, atsirandantys po astrocitų aktyvavimo, gali sušvelninti uždegiminį atsaką ir neuronų pažeidimus.

Šio tyrimo rezultatai parodė, kad tarp tirtų ITC AITC buvo mažiau toksiškas, nes jokiu būdu nesumažino ląstelių gyvybingumo visomis naudojamomis koncentracijomis. Priešingai, kaip ir kiti autoriai pastebėjo įvairiose glijos ląstelių linijose, PEITC ir SFN parodė toksiškumą ląstelėms, kai koncentracija buvo didesnė nei 10 ir 25 µM (Lee ir kt., 2015; Eren ir kt., 2018; Su ir kt. . 2015).

Dabartinėje mokslinėje literatūroje yra daug prieštaringų duomenų apie molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas ITC poveikis ląstelių gyvybingumui. Šiuo atžvilgiu dauguma tyrimų parodė, kad ITC slopina ląstelių augimą skatinančią apoptozę, ląstelių ciklo sustabdymą, ROS susidarymą vėžinėse ląstelėse, bet ne normaliose ląstelėse (Fofaria ir kt. 2015; Qin ir kt. al., 2018; Sestili ir Fimognari, 2015). Mes nustatėme, kad SFN ir PEITC, bet ne AITC, turi apsauginį vaidmenį nuo oksidacinio streso astrocituose, iš tikrųjų esant maksimalioms netoksiškoms koncentracijoms, jie galėjo neutralizuoti ROS gamybą, kurią sukelia H2O2 poveikis. CNS yra ypač pažeidžiama oksidacinio streso dėl didelio deguonies suvartojimo, silpnų antioksidacinių sistemų ir didelio oksidacijai jautrių biomakromolekulių kiekio. Manoma, kad ROS susidarymas ir oksidaciniai pažeidimai yra susiję su neurologinių sutrikimų, tokių kaip Alzheimerio liga (AD), Parkinsono liga (PD), amiotrofinė šoninė sklerozė (ALS) ir išsėtinė sklerozė (MS) patogenezėje (Lee ir kt. 2015). Todėl, nors mūsų in vitro eksperimentuose SFN ir PEITC šiek tiek neutralizavo ROS gamybą, galime manyti, kad in vivo ilgalaikis ITC vartojimas gali žymiai sumažinti ROS, o tai laikui bėgant gali sukelti reikšmingą poveikį. populiacijoms, išreikštoms MMP slopinimo procentais, lyginant su teigiama kontrole (LPS), apskaičiuotas atlikus skenavimo densitometriją ir kompiuterinę gelių analizę. Statistiškai reikšmingas MMP-2 ir MMP-9 išraiškos sumažėjimas, palyginti su LPS, pažymėtas žvaigždutėmis (vienpusė ANOVA, po kurios atliekamas Dunnet post hoc testas; *p <>

smegenų ligų prevencija ir moduliavimas. ROS veikia kaip kritinė signalinė molekulė, sukelianti uždegiminio atsako kaskadą į CNS. Šiuo atžvilgiu yra gerai žinoma, kad ROS reguliuoja daugelio genų, susijusių su neurouždegiminiu procesu, ekspresiją aktyvindamos priešuždegiminius transkripcijos faktorius, tokius kaip branduolinis faktorius-κB (NF-κB) (Lee ir kt., 2015; Chiurchiù ir kt.). 2016; Martorana ir kt., 2019). Šiame scenarijuje svarbų vaidmenį atlieka MMP, kurių ekspresiją padidina ROS, aktyvindami NF-κB (Yan ir Boyd 2007).

Kadangi MMP disreguliacija prisideda prie daugelio neurouždegiminių ir neurodegeneracinių ligų patogenezės, jų slopinimas yra svarbi gydymo strategija. Dėl šios priežasties pastarąjį dešimtmetį vis labiau domimasi vaistų ir natūralių junginių galimybe slopinti MMP. Daugybė tyrimų in vitro parodė, kad kelių vaistų ir biologiškai aktyvių junginių, esančių daržovėse ir jūros organizmuose, priešuždegiminis ir antioksidacinis poveikis yra susijęs su jų gebėjimu slopinti MMP ekspresiją (Latronico ir kt., 2016, 2018; Di Bari ir kt. . 2015). Šiame tyrime parodėme, kad iš išbandytų ITC SFN ir PEITC efektyviausiai slopino MMP-2 ir MMP-9 lygius ir ekspresiją LPS aktyvuotuose astrocituose. Kituose in vivo ir in vitro tyrimuose pranešta, kad ITC slopina MMP. Visų pirma Li ir kt. (2013) parodė, kad SFN gali sušvelninti BBB pažeidimą slopindamas MMP-9 ekspresiją eksperimentinio autoimuninio encefalomielito in vivo modelyje. Kiti autoriai pranešė, kad SFN sugebėjo susilpninti MMP-9 ekspresiją po pelių nugaros smegenų pažeidimo (Mao ir kt., 2010a). Be to, in vitro tyrimai parodė, kad ITC slopina ląstelių migraciją ir

5 pav. Ekstraląstelinio signalo reguliuojama kinazė 1/2 (ERK 1/2) dalyvauja slopinant MMP ekspresiją ITC junginiais. Reprezentatyvios autoradiografinės plėvelės iš astrocitų lizatų, iš anksto apdorotų 1 valandą AITC (400 μM), PEITC (10 μM) arba SFN (25 μM), o po to 2 valandoms su LPS (10 ug mL{{) 13}}). Neapdorotos ir nestimuliuotos ląstelės yra neigiama kontrolė (CTRL). Histograma (b) rodo pERK1/2 lygio invaziją į C6 gliomos ląsteles, susijusias su NF-κB tarpininkaujamos MMP-9 ekspresijos slopinimu (Lee ir kt., 2015).

Molekuliniai mechanizmai, kuriais ITC slopina MMP, yra neaiškūs, ir nėra tyrimų, tiriančių antioksidacines ir priešuždegimines ITC savybes pirminėse astrocitų kultūrose. Keletas tyrimų patvirtina hipotezę, kad ITC slopinamasis poveikis yra jų gebėjimo blokuoti NF-κB Nrf2 signalizacijos keliu pasekmė. Šiuo atžvilgiu in vivo atliktas tyrimas rodo, kad pelės Nrf2 buvo jautresnės NF-κB sukeltam nugaros smegenų uždegiminiam atsakui ir padidėjusiai nuo NFkB priklausomų genų, įskaitant MMP, ekspresija-9 (Mao ir kt., 2010b). ). Nors NF-κB ir Nrf2 keliai gali sąveikauti, parodėme, kad NF-κB reguliavimas taip pat vyksta moduliuojant molekulinius mechanizmus, kurie nepriklauso nuo Nrf2. Iš tiesų, mes nustatėme, kad AITC, PEITC ir SFN slopino ERK1 / 2 aktyvavimą, kuris atlieka pagrindinį vaidmenį signalo perdavimo įvykių, kurie galiausiai reguliuoja MMP geno transkripciją, kaskadoje.

Tačiau eksperimentiniai įrodymai, kad SFN, esant didžiausiai netoksinei koncentracijai, visiškai slopino ir MMP{1}} raišką, ir lygius, tuo tarpu AITC ir PEITC maksimaliai slopino MMP-9 raišką, bet tik sumažino MMP{{3} } lygį iki maždaug 50 proc., gali reikšti, kad šie junginiai skirtingai veikia MMP-9 transkripciją. Šiuo atžvilgiu buvo pranešta, kad SFN, be LPS sukeltos NF-κB aktyvacijos slopinimo, trukdo LPS prisijungimui prie TLR4 receptoriaus (Koo ir kt., 2013). Slopinamasis SFN poveikis TLR4 gali neleisti astrocitams aktyvuoti LPS ir dėl to gali būti slopinama MMP-9 ekspresija ir dėl to gali trūkti MMP-9 gamybos.

gautas po densitometrinio autoradiografinių plėvelių nuskaitymo ir normalizavimo iki nefosforilinto ERK 1/2. Duomenys reiškia n=3 eksperimentų, atliktų su skirtingomis ląstelių populiacijomis, vidurkius ± SD. Žvaigždutės žymi vertes, kurios statistiškai skiriasi nuo teigiamos kontrolės (LPS aktyvuotų astrocitų), kuri buvo nustatyta 100 proc. (vienpusė ANOVA, po kurios atliktas Dunnett's Multiple Comparison post hoc testas; *p <>

Išvados

Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų duomenys rodo, kad astrocitų gydymas ITC sumažina ROS susidarymą ir slopina MMP-2 ir MMP-9 išsiskyrimą, o tai suteikia naujų įžvalgų apie antioksidacines ir priešuždegimines ITC savybes, susijusias su gliuze. ląstelės. Šie rezultatai rodo, kad ITC gali būti perspektyvios maistinės medžiagos kuriant neuro-mitybos intervencijas, pagrįstas sveiko maisto vartojimu, siekiant užkirsti kelią ir papildomai gydyti neurologines ligas.

Finansavimas Atviros prieigos finansavimą teikia Università Degli Studi di Bari Aldo Moro pagal CRUI-CARE susitarimą.

Etikos standartų laikymasis

Interesų konfliktas Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.

Atviroji prieiga Šis straipsnis yra licencijuotas pagal Creative Commons Attribution 4.0 Tarptautinė licencija, leidžianti naudoti, dalytis, pritaikyti, platinti ir atkurti bet kokia laikmena ar formatu, jei tik nurodote originalų autorių. (s) ir šaltinį, pateikite nuorodą į Creative Commons licenciją ir nurodykite, ar buvo atlikti pakeitimai. Šiame straipsnyje esantys vaizdai ar kita trečiųjų šalių medžiaga yra įtraukti į straipsnio Creative Commons licenciją, nebent medžiagos kredito limite nurodyta kitaip. Jei medžiaga neįtraukta į straipsnio Creative Commons licenciją ir jūsų numatytas naudojimas neleidžiamas įstatymų nustatyta tvarka arba viršija leistiną naudojimą, turėsite gauti leidimą tiesiogiai iš autorių teisių turėtojo. Jei norite peržiūrėti šios licencijos kopiją, apsilankykite http://creativecommons.org/licenses/by/4.{4}}/.