1 dalis: Akteozido slopinama mikroglijos M1 poliarizacija per slopintą NF-κB signalizacijos kelią ir AMPK tarpininkaujamų mitochondrijų funkcijos atkūrimą

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Pls spustelėkite čia, kad pamatytumėte 2 dalį

Santrauka:

Fonas:Alzheimerio liga (AD)yra dažniausia demencijos rūšis. Norsakteozidas iš cistanche žolės(ACT), junginys, išskirtas iš Cistanchekanalėlių, turi neuroprotekcinių savybių. Tačiau pagrindinis mechanizmas, reguliuojantis mikroglijų poliarizaciją, lieka blogai apibrėžtas.Metodai:Čia buvo pritaikytas AlCl3-sukeltas AD modelis zebro lervose, siekiant atskleisti terapinį ACT veiksmingumą. BV-2 ląstelės buvo naudojamos norint parodyti ACT vaidmenį mikroglijos poliarizacijoje. RNR seka, HPLC-Q-TOF-MS, Western blot ir molekulinis prijungimas buvo sujungti, kad būtų patvirtintas jos mechanizmas.Rezultatai:ACT reikšmingai pagerino eksperimentinę diskineziją ir nervų sistemos sutrikimus zebruose. Vėliau jis slopino M1 poliarizaciją ir padidino iki M2 fenotipo LPS sukeltose BV-2 ląstelėse. Pirmiausia parodėme, kad ACT padarė didelį transkriptominį poveikį, kuris apėmė pagrindinių signalizacijos takų reguliavimą uždegimo metu, arginino biosintezę, taip pat pantotenato ir CoA biosintezę, koreliuojančią su mitochondrijų funkcija. ACT(akteozidas iš cistanche žolės) gydymas sumažino mikroglijos M1 poliarizaciją slopindamas NF-κB signalizacijos kelią. Ir medžiagų apykaitos kelius toliau patvirtino HPLC-Q-TOF-MS. Be to, ACT pašalino perteklinį ROS, kad atkurtų mitochondrijų funkciją per AMPK tarpininkaujamą PGC-1 ir UCP-2 reguliavimą, atitinkantį medžiagų apykaitos pokyčius. Įdomu tai, kad ACT gali tiesiogiai prisijungti prie NF-κB ir AMPK, kaip rodo molekulinis prijungimas.Išvados:Tyrimas suteikė infuzinį ACT mechanizmą ir iliustravo naują perspektyvą, pagrįstą mitochondrijų disfunkcija, siekiant atskleisti ryšį tarp metabolizmo ir mikroglijos poliarizacijos.

Fonas:

Alzheimerio ligaliga(AD) yra dažna neurodegeneracinė liga, kurią lydi pažinimo sutrikimai ir diskinezija[1]. Jai būdingas stiprus neuronų praradimas, senatvinės plokštelės ir neurobriliariniai raizginiai [2]. AD patogenezė yra daugialypė ir susijusi su neuroin§ammacija. Neuroin§ammaciją skatina glijos ląstelių aktyvacija, glaudžiai susijusi su AD išsivystymu[3, 4]. Progresuojant ir paūmėjus neuroin§ammacijai, mikroglija laikoma pagrindiniu veiksniu. Mikroglijos yra pagrindinės imuninės ląstelės centrinėje nervų sistemoje. Jis glaudžiai susijęs su procesų kaskada, stabdanti smegenų vystymąsi, palaikant neutralią aplinką, taip pat reaguojant į sužalojimą ir taisymą[1]. Be to, mikroglija gali būti stimuliuojama iki M1 fenotipo, o uždegimą skatinančių citokinų ekspresija padidėja, kai atsiranda su neuroinemimu susijusių ligų, tokių kaip AD [5]. Tyrimai taip pat rodo, kad poliarizaciją iki M1 fenotipo dažnai lydi medžiagų apykaitos sutrikimai[6], sukeliantys energijos apykaitos disbalansą ir mitochondrijų disfunkciją[7]. Šie neigiami pokyčiai atsiranda dėl neurodegeneracijos, netgi AD.

akteozidas iš cistanche žolės(ACT), feniletanoido glikozidas, pirmiausia gaunamas iš Cistanchekanalėlių. Vis daugiau įrodymų rodo, kad ACT turėjo daug farmakologinių veiksmų, įskaitant neuroprotekcinį[8], priešuždegiminį[9] ir antioksidacinį[10] poveikį. Visų pirma pranešta, kad ACT pagerina streptozotocino sukeltų žiurkių mokymąsi ir atminties sutrikimus, taip pat padidina energijos apykaitą[11]. Taip pat buvo pasiūlyta slopinti neuronų apoptozinių ląstelių mirtį ir mitochondrijų pažeidimus eksperimentinėse autoimuninio encefalomielito pelėse [12]. Tačiau mažiau tyrimų buvo sutelkta į ACT poveikį mikroglijos M1 / ​​M2 poliarizacijai. Ypač nebuvo atlikti įvairūs mechanizmai, tokie kaip mitochondrijų funkcijos atstatymas ir ląstelių metabolizmo reguliavimas. Be to, ACT mechanizmas, prisidėjęs prie mikroglijos M1 / ​​M2 poliarizacijos, liko neištirtas.

Šia ataskaita buvo siekiama ištirti terapinį ACT veiksmingumą ir pagrindinį ACT molekulinį mechanizmą sergant AD. Čia ACT parodė reikšmingą neuroprotekcijos poveikį AlCl{0}}sukeltoms AD zebro lervoms. Be to, ACT veiksmingai slopino M1 poliarizaciją ir skatino M2 fenotipą LPS sukeltose BV-2 ląstelėse. RNR sekos nustatymas (RNA-Seq), integruotas su metabolomikos metodu, siekiant geriau suprasti pagrindinį ACT mechanizmą reguliuojant mikroglijos poliarizaciją. Buvo ištirtas metabolizmo ir mikroglijos poliarizacijos ryšys, atsižvelgiant į mitochondrijų funkciją. Šis tyrimas suteiks naują pagarbą tolesniam ACT, kaip galimo terapinio agento AD gydymui, tyrimui.

Metodai:

Gyvūnų ir modelių grupavimas:

Šiam tyrimui buvo pasirinkti laukinio tipo zebrai (AB padermė, 4 mėnesių amžiaus) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Jie buvo palaikomi 14/10 h šviesos ir tamsos ciklu 28 laipsnių temperatūroje, taikant ankstesnį metodą[13]. Natūralios trąšos ir normaliai išsivystę embrionai buvo sukurti ir auginami 3 dienas po apvaisinimo (dpf) apšvietimo inkubatoriuje. Visi zebriniai eksperimentai buvo atlikti prižiūrint Kinijos farmacijos universiteto Gyvūnų etikos komitetui.

Zebra lervos buvo suskirstytos į šešias grupes ir gydomos nuo 3 dpf iki 7 dpf: kontrolinė grupė, modelio grupė, modelis ir donepezilo hidrochlorido (DPZ) grupė, modelis ir ACT grupės. Kontrolinė grupė buvo palaikoma terpėje su 0,2 proc. DMSO, o modelio grupė buvo apdorota 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Modelis ir DPZ grupė buvo kartu apdoroti AlCl3 ir 8 μM DPZ. Modelio ir ACT grupės buvo kartu apdorotos AlCl3 ir skirtingomis ACT koncentracijomis (200, 100, 50 μM). ACT(akteozidas iš cistanche žolės)(HPLC grynumas didesnis arba lygus 98 proc.) buvo gautas iš Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kinija). AlCl3·6H2O ir DPZ buvo įsigyti iš Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Šanchajus, Kinija).

Elgesio analizė

Zebra lervų judesiai buvo užfiksuoti naudojant ViewPoint elgsenos analizatorių (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) 28 laipsnių kampu. Brie§y, elgesio parametrai ir rezultatų apdorojimas atitiko anksčiau nustatytą metodą[13]. Čia buvo pasirinktas vidutinis greitis (AS), greičio pokytis (ΔS), diskinezijos atsigavimo greitis (DRR) ir atsako efektyvumas (RE, proc.), siekiant įvertinti diskinezijos atsigavimą zebruose.

Apdorojus nuo 3 dpf iki 7 dpf, buvo surinktos zebro lervos, kad būtų galima išmatuoti AChE ir ChAT aktyvumą. Remiantis gamintojo protokolu, aktyvumas buvo aptiktas su fermentais susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkiniais (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Šanchajus, Kinija). O skirtingų mėginių baltymų koncentracijos buvo nustatytos BCA metodu.

BV-2 ląstelės buvo pasėtos į 6-šulinėlių lėkštelę atskirai (n=6/grupė). Po apdorojimo terpė buvo pašalinta, o ląstelės tris kartus plaunamos šaltu PBS. Tada nedelsiant veikiamas skysto azoto, kad slopintų ląstelių metabolizmą. Ląstelės buvo surinktos šaltu 80% metanoliu (1 ml / duobutę), o suspensija buvo perkelta į 2 ml Eppendorf mėgintuvėlį. Siekiant palengvinti baltymų nusodinimą, energingai maišoma 1 min. ir centrifuguojama 13, 000 aps./min. greičiu 15 min 4 laipsnių temperatūroje. Ląstelių suspensija buvo perkelta į naują 2 ml Eppendorf mėgintuvėlį, išdžiovinta azoto srove ir iki analizės laikoma -80 laipsnių temperatūroje. Išdžiovinta liekana ištirpinama 150 μl iš anksto atvėsinto 25 procentų acetonitrilo. Siekiant užtikrinti sekos analizės stabilumą ir tikslumą, vienodi kiekiai (10 μL) kiekvieno ląstelės mėginio buvo sujungti kaip kokybės kontrolės (QC) mėginiai. Metabolitų aptikimo metu šie mėginiai buvo švirkščiami kas šešis ląstelių mėginius, kad būtų patvirtintas jų stabilumas. 1 μL alikvotinė dalis buvo sušvirkšta HPLC-Q-TOF-MS.

HPLC-Q-TOF-MS analizė buvo atlikta naudojant Agilent 1290 HPLC sistemą, sujungtą su Agilent 6530 Quadrupol Time-of-Flight (Q-TOF) masės spektrometru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV). Atskyrimas buvo atliktas naudojant ACQUITY UPLC BEH C18 kolonėlę (2,1 × 100 mm, 1,7 μm). Judanti fazė sudaryta iš 0,1 % skruzdžių rūgšties ir vandens (v/v; A) ir acetonitrilo (B).

Nustatytas {{0}},4 mL/min., esant šioms optimalioms gradiento eliuavimo sąlygoms: nuo 0 iki 2 min., 5 proc. B; nuo 2 iki 20 min., nuo 5 procentų iki 95 procentų B (teigiamų jonų režimas); nuo 0 iki 2 min., 5 procentai B; 2–20 min., 5–95 procentai B (neigiamų jonų režimas). Masių spektrometro veikimo parametrai buvo nustatyti taip: dujų temperatūra, 320 laipsnių; džiovinimo dujos, 10 L/min; purkštuvas, 35 psi; VCap, 4000 V; fragmentas, 120 V.

Neapdoroti duomenys buvo naudojami naudojant MassHunter Workstation Software versiją B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV). Neapdorotus duomenis iš anksto apdorojo XCMS platforma. Normalizuotų duomenų pagrindinių komponentų analizė (PCA) ir dalinė mažiausiųjų kvadratų diskriminacinė analizė (PLS-DA) buvo atlikta su MetaboAnalyst (//www.metaboanalyst.ca). Kartu su literatūra, skirtingi metabolitai (VIP > 1, T testas P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">