1 DALIS Antioksidacinis ir antikoaguliantinis fenilpropanoidinių glikozidų, išskirtų iš šluostelių (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria ir P. Ramosa) poveikis

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal g, Beata Olas a,*

Lodzo universitetas, Bendrosios biochemijos katedra, Biologijos ir aplinkos apsaugos fakultetas, 90-236 Ł´od´z, Lenkija

b Biochemijos ir pasėlių kokybės katedra, Dirvotyros ir augalų auginimo institutas, Valstybinis tyrimų institutas, 24-100 Puławy, Lenkija

Biologinės įvairovės tyrimų ir išsaugojimo centras, Jano Kochanovskio universiteto Biologijos instituto Aplinkos biologijos katedra, 25-406 Kielce, Lenkija

Abstraktus

Holoparazitiniai Orobanchaceae augalai, įskaitantCistanche, Orobanche ir Phelipanche spp. yra žinomi dėl savo fenilpropanoidinių glikozidų (PPG) gausos. Nustatyta, kad daugelis PPG junginių turi platų spektrą veiklų, tokių kaip antimikrobinis, priešuždegiminis, antioksidacinis ir atmintį gerinantis. Siekdami geriau ištirti europinių šluotelių (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) ir dešimties atskirų fenilpropanoidinių sudedamųjų dalių bioaktyvumo potencialą, ištyrėme jų antiradikalinį poveikį, apsauginį poveikį nuo oksidacijos plazmoje in vitro sistemoje. ir įtaką krešėjimo parametrams. Išbandyti ekstraktai parodė 50–70 procentų Trolox galios šalinimo aktyvumą. OC ekstraktas, kuriame gausuakteozido, turėjo daugiau nei 20 procentų geresnį antiradikalinį potencialą nei PR ekstraktas, kuris buvo vienintelis PPG, kurio acilo vienete trūko B žiedo katecholio dalies. Be to, buvo nustatyta, kad tik aštuoni išbandyti PPG parodė antioksidacinį potencialą žmogaus plazmoje, apdorotoje H2O2/Fe; tačiau trys išbandyti PPG, be antioksidacinių savybių, turėjo ir antikoaguliacinį potencialą. Atrodo, kad PPG struktūra, ypač acilo ir katecholio dalių buvimas, daugiausia yra susijusi su jų antioksidacinėmis savybėmis. Šių junginių antikoaguliantinis potencialas taip pat susijęs su jų chemine struktūra. Atrinkti PPG gali gydyti širdies ir kraujagyslių ligas, susijusias su oksidaciniu stresu.

Norėdami gauti daugiau informacijos, kreipkitės:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosa turi daug poveikių

1. Įvadas

Oksidacinis stresas yra plačiai žinomas dėl neigiamo poveikio gyvų organizmų sveikatai, įskaitant pagreitintą senėjimą ir kai kurias vėžio formas. Oksidacinio streso atsiradimas yra susijęs su sutrikusia pusiausvyra tarp oksidacinių ir antioksidacinių mechanizmų (įskaitant fermentinę (katalazės, glutationo peroksidazės) ir nefermentinę (glutationo) apsaugą) organizmo ląstelėse [1]. Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS), įskaitant oksiduojančius radikalus ir uždaro apvalkalo rūšis, perprodukcija yra vienas iš pagrindinių oksidacinio streso susidarymo mechanizmų. Tačiau ROS sukeliamas biologinis poveikis labai priklauso nuo koncentracijos, poveikio laiko ir vietos. Normaliomis sąlygomis (maža koncentracija) deguonies/azoto radikalai gali atlikti antrinių pasiuntinių vaidmenį, tačiau aukštesniame lygyje jie gali pradėti reaguoti su biologinėmis struktūromis, pavyzdžiui, ląstelių membranomis [2]. Tarp visų ROS rūšių hidroksilo radikalas (HO.) daro vieną didžiausių žalos biomakromolekulėms: baltymams, lipidams ir DNR. Yra žinoma, kad oksidacinis stresas vaidina svarbų vaidmenį sergant įvairiomis ligomis, įskaitant širdies ir kraujagyslių ligas. Kraujo sistemos sutrikimai buvo koreliuojami ir (arba) prieš tai pasikeitę įvairūs hemostazės ir plazmos biomarkerių parametrai [1,3].

Kita vertus, daugelis natūralių medžiagų, tokių kaip polifenoliai ir polinesočiosios riebalų rūgštys, buvo identifikuotos kaip stiprūs antioksidantai, galintys užkirsti kelią reaktyviųjų deguonies rūšių susidarymui ir (arba) mažinti jų kiekį. Tokių savybių turinčių junginių yra daugelyje augalinės kilmės maisto produktų ir farmacijos preparatų. Todėl plačiai rekomenduojama dieta, praturtinta šviežiomis daržovėmis ir vaisiais bei antioksidacinė terapija, pagrįsta natūraliais antioksidantais, nes gali sumažinti oksidacinio streso lygį ir užkirsti kelią įvairiems patofiziologiniams procesams [4,5]. Augaliniai polifenoliai yra įvairi antrinių metabolitų grupė, tarp kurių svarbią vietą užima fenolio rūgštys, nes jie yra plačiai paplitę ir pasižymi įvairiu biologiniu poveikiu, pavyzdžiui, antimikrobiniu, antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu. Fenilpropanoidiniai glikozidai (PPG) yra hidroksicinamono rūgšties esterių giminaičiai ir yra pagrindinė / vienintelė antrinių metabolitų klasė, esanti holoparazitiniuose Orobanchaceae augaluose, įskaitantCistanche, Orobanche ir Phelipanche spp. Keletas šios šeimos rūšių yra rimti pasėlių kenkėjai, kurių ūkininkai nori atsikratyti laukuose (Phelipanche ramosa pavyzdys), nedaug naudojamos farmakologijoje, o dauguma jų yra mažai svarbios žmonėms. HerbaCistancheyra plačiai naudojamas tradicinėje Azijos medicinoje gydant inkstų nepakankamumą ir kaip imunitetą bei atmintį stiprinanti, senėjimą stabdanti ir nuovargio priemonė [6]. Įvairių tyrimų grupių fitocheminės analizės parodė, kad fenilpropanoidiniai glikozidai, tokie kaip acetonidas, echinakozidas ir podiumo pusė, yra viena iš pagrindinių Herba Cistanche veikliųjų medžiagų [7]. Neseniai atliktas kelių Lenkijoje rastų šluotinių roplių rūšių tyrimas, kurį atliko Jedrejekas ir kt. [8] parodė, kad šios augalinės medžiagos kokybinė sudėtis yra panaši (dominuoja PPG), be to, ji prilygsta arba net viršijaCistanchespp. pagal veikliųjų medžiagų kiekį [8].

Cistanche deserticola turi daug efektų, spustelėkite čia, kad sužinotumėte daugiau

Šiuo tyrimu buvo siekiama įvertinti trijų įvairių fenilų turtingų šluotelių ekstraktų (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA ir P. ramosa – PR) antiradikalinį ir antioksidacinį potencialą, taip pat įtaką hemostazės parametrams. -

prostanoidai, taip pat atskiros jų PPG sudedamosios dalys. Antiradikalinis pajėgumas buvo išmatuotas naudojant 2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolino-6-sulfonrūgštį/trolokso ekvivalentą (ABTS/TE) ir 2,2-difenil-1-pikrilhibrazilą (DPPH). ) testai. Oksidacinis stresas plazmos testavimo sistemoje buvo sukeltas naudojant hidroksilo radikalą (H2O2/Fe), tada buvo išmatuota lipidų peroksidacija (tiobarbitūro rūgštimi reaktyvių rūšių (TBARS) tyrimas) ir baltymų karbonilo ir tiolio grupių lygis. Tarp nustatytų hemostazės parametrų buvo šie: aktyvuoto dalinio tromboplastino laikas (APTT), protrombino laikas (PT) ir trombino laikas (TT).

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Chemikalai

2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas (DPPH), 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolino-6-sulforūgštis (ABTS), kalio persulfatas, {{9 }}hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksirūgštis (Trolox), dimetilsulfoksidas (DMSO), tiobarbitūro rūgštis (TBA), skruzdžių rūgštis (LC-MS klasė), ir H2O2 buvo nupirkti iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Metanolis (HPLC gradiento klasė) ir acetonitrilas (LC-MS klasė) buvo įsigyti iš Merck (Darmstadt, Vokietija). Dešimt fenilo-

propano junginiai, išbandyti šiame darbe, įskaitant 2′-O-acetillakteozidą (97 proc.), 2'-O-acetilpoliumosidą (98 proc.), 3-O-metilpoliumosidą (96 proc.), acetonidą (99 proc.), areną viduje (97 proc.), krenatozidą (98 proc.), tenipozidą (99 proc.), poliumosidą (99 proc.), tubulozidą A (96 proc.) ir wiedemanniosidą D (96 proc.) išskyrėme iš žemiau nurodytos augalinės medžiagos. 8]. Junginių grynumas buvo įvertintas naudojant UHPLC-PDA-MS analizę. Itin grynas vanduo buvo paruoštas namuose, naudojant Milli-Q vandens valymo sistemą (Millipore Co.). Kiti reagentai buvo analitinės kokybės ir tiekiami iš vietinių komercinių tiekėjų.

2.2. Augalinė medžiaga

Žydinčius trijų šluotinių roplių rūšių augalus, tarp jų Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel ir P. Ramos (L.) Pomel, atpažino prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski universitetas, Kielce, Lenkija) ir surinkta iš natūralaus šaltinio Lenkijoje.

Kuponiniai egzemplioriai (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), kseroterminė pieva, parazituoja Galium boreale, 2014 m. gegužės mėn.; P. Arenaria – Zwierzyniec, lo pūdymas, parazituoja Artemisia campestris, 2014 m. birželis;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), laukas, parazituoja Solanum Lycopersicum, 2014 m. rugsėjis) yra saugomi Jano Kochanovskio universiteto Herbariume Kielce (KTC). Prieš ekstrahuojant augalinė medžiaga buvo liofilizuota ir smulkiai sumalta.

2.3. Šluostelių ekstraktų ruošimas

Miltelių pavidalo augalinė medžiaga (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g ir P. ramosa (PR) – 3 g) buvo ekstrahuota 80 procentų MeOH 40 ◦ C temperatūroje ir 1500 psi (tirpiklio slėgis) ) naudojant ASE 200 pagreitintą

tirpiklio ekstraktorius (Dionex, Sunnyvale, CA, JAV). Ekstraktai buvo išgarinti ir liofilizuoti (Gamma 2–16 LSC šaldymo džiovintuvas, Kristus, Vokietija). OC, PA ir PR ekstrahavimo efektyvumas buvo atitinkamai 55%, 37% ir 43% augalinės medžiagos masės. Dėl didelio angliavandenių kiekio (duomenys nerodomi), žaliaviniai ekstraktai buvo toliau gryninami kietosios fazės ekstrakcija (SPE) ant Oasis HLB mikrokolonėlės (500 mg; Waters, Milford, MA, JAV). Cukrus pašalintas 1 procentu MeOH, tada dominantys junginiai eliuuojami 80 procentų MeOH. Pašalinus tirpiklį, OC, PA ir PR ekstraktai buvo liofilizuoti (Gamma 2–16 LSC šaldymo džiovintuvas), o SPE gryninimo išeiga buvo 53 procentai (OC), 67 procentai (PA) ir 51 procentas (PR). .

2.4. Šluotų ekstraktų fitocheminės savybės

Kokybinė ir kiekybinė šluotų ekstraktų analizė buvo atlikta naudojant ACQUITY UPLC sistemą (Waters), prijungtą prie fotodiodų matricos detektoriaus (PDA) ir tandeminio kvadrupolio masės spektrometro (TQD-MS/MS). Liofilizuoti OC, PA ir PR ekstraktai buvo ištirpinti 50 procentų metanolyje, kurio koncentracija 0,50 mg/ml, o po to

Chromatografuota BEH C18 kolonėlėje (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters). Chromatografinės sąlygos buvo tokios: krosnies temperatūra – 25 ◦C,

linijinis gradientas 10→25 procentai judriosios fazės B (0.1 proc. skruzdžių rūgšties acetonitrile) judrioje fazėje A (0.1 proc. skruzdžių rūgšties H2O) virš 12 min, srautas – 0,4 mL/min, įpurškimo tūris – 2 μL, UV diapazonas – 190–490 nm (3,6 nm skiriamoji geba). MS analizė atlikta neigiamų jonų režimu su elektropurškimo jonizacija (ESI), naudojant šiuos nustatymus: skenavimo diapazonas 100–1200 m/z; kapiliarinė įtampa 2,8 kV; kūgio įtampa 35 V;

šaltinio temperatūra 150 ◦C; desolvatacijos temperatūra 450 ◦C; desolvacija

dujų srautas 900 L/h, o kūgio dujų srautas 100 L/h. Duomenų surinkimas ir apdorojimas buvo atliktas naudojant Waters MassLynx 4.1 programinę įrangą.

Fenilpropanoido glikozido (PPG) smailės buvo nustatytos palyginus gautus LC-MS duomenis su anksčiau išskirtų junginių duomenimis [8]. PPG kiekybinis nustatymas šluotų ekstraktuose buvo pagrįstas UPLC-UV metodu, aptikimu esant 330 nm, ir išoriniu standartiniu kalibravimu naudojantakteozido(Sigma-Aldrich, 99 proc., HPLC) kaip

grupės standartas. Linijinė kalibravimo kreivė buvo sudaryta šešiomis koncentracijomis 1–200 ug/mL diapazone ir parodė gerą tiesiškumą (R2

0.999). Kiekybiniai rezultatai rodo vidutinę trijų injekcijų SD vertę ir buvo išreikšti miligramaisakteozidoekvivalentai (ekv.) vienam gramui ekstrakto (mgakteozidoekv/g).

2.5. Antiradikalinis aktyvumas in vitro

2.5.1. ABTS radikalų pašalinimo tyrimas

ABTS antiradikalinis testas buvo atliktas naudojant metodą, aprašytą Kontek ir kt. [9], su nedideliais pakeitimais: reagentams paruošti buvo naudojamas 20 procentų MeOH (7 mM ABTS ir 4,9 mM kalio per-

sulfatas); buvo paruošti keturių 100–400 ug/mL koncentracijų intervalo OC, PA ir PR ekstraktų tirpalai ir šešių koncentracijų 10 250 ug/mL intervale Trolox tirpalai 50 procentų MeOH. Mėginio ir ABTS darbinio tirpalo santykis buvo 1:25 (t/v). Absorbcija ties 734 nm buvo išmatuota po 30 minučių inkubacijos

tamsoje, naudojant UV spindulių spektrofotometrą (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, JAV).

Absorbcijos slopinimas (procentais ) buvo apskaičiuotas taip: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Apskaičiuoti šluotinių šluotelių ekstraktų Trolox ekvivalentai (TE).

naudojant formulę TE=msample/mstandard, kur m yra tiesės nuolydis

linijos kreivės (absorbcijos slopinimas vs. koncentracija). TE vertė

mėginys apibūdina normalų aktyvumą prieš Trolox (TEstandartas =

1.{1}}). OC, PA ir PR ekstraktų bei Trolox IC50 vertės buvo

pasiekti eksperimentiškai, tada buvo apskaičiuoti pagal jų tiesiąją liniją

kreivės (absorbcijos slopinimas vs. koncentracija) ir išreiškiami

ug/mL.

Tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais, o rezultatai pateikiami

kaip vidurkiai ± standartiniai nuokrypiai (SD).

2.5.2. DPPH radikalų pašalinimo tyrimas

DPPH antiradikalinis testas buvo atliktas naudojant metodą, aprašytą Jedrejek ir kt. [8] ir Brand-Williams et al. [10], su nedideliais pakeitimais: OC, PA ir PR ekstraktų tirpalai keturiais koncentracijos lygiais 50▽ 250 ug/mL diapazone ir Trolox tirpalai, šešių koncentracijų lygiai 10▽ intervale. 250 ug/ml, buvo paruošti su 50 procentų MeOH. Mėginio ir DPPH santykis buvo 1:19 (t/v). Absorbcija ties 517 nm buvo išmatuota po 30 minučių inkubacijos tamsoje, naudojant UV-vis spektrofotometrą (Evolution 260 Bio). Absorbcijos slopinimas (procentais) buvo apskaičiuotas taip: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] × 100. Trolox Equivalent (TE) ir IC50 tiriamųjų mėginių reikšmės buvo apskaičiuotos taip pat, kaip ir atliekant ABTS testą (2.5.1 skirsnis). Tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais, o rezultatai pateikiami kaip vidurkiai ± SD.

2.6. Išbandytų augalų junginių ir ekstraktų pradiniai tirpalai eksperimentams su žmogaus plazma

Tirtų junginių ir augalų ekstraktų pradiniai tirpalai buvo paruošti 50 procentų DMSO. Galutinė DMSO koncentracija tirtuose mėginiuose buvo mažesnė nei 0,05 proc. ir jos poveikis nustatytas visuose eksperimentuose.

2.7. Žmogaus plazmos izoliacija

Žmogaus kraujas arba plazma buvo paimtas iš šešių nuolatinių donorų (nerūkančių vyrų ir moterų) į kraujo banką (Lodzė, Lenkija) ir medicinos centrą (Lodzė, Lenkija). Kraujas buvo paimtas kaip CPD tirpalas (citratas / fosfatas / dekstrozė; 9: 1; kraujas / t Donorai mažiausiai dvi savaites iki donorystės nevartojo jokių vaistų ar priklausomybę sukeliančių medžiagų (įskaitant tabaką, alkoholį ir antioksidantų papildus). Mūsų kraujo mėginių analizė buvo atlikta pagal Helsinkio žmogaus tyrimų deklaracijos gaires ir patvirtinta Lodzės universiteto Tyrimų su žmonėmis etikos komiteto. Plazma buvo paruošta centrifuguojant šviežią žmogaus kraują 4500x g 25 minutes kambario temperatūroje. Baltymų koncentracija buvo apskaičiuota išmatuojant tiriamų mėginių absorbciją esant 280 nm, pagal Whitaker ir Granum metodiką [11].

2.8. Oksidacinio streso žymenys žmogaus plazmoje

2.8.1. Lipidų peroksidacijos matavimas

Plazmos lipidų peroksidacija buvo kiekybiškai įvertinta matuojant su tiobarbitūro rūgštimi reaguojančių medžiagų (TBARS) koncentraciją. TBARS koncentracija apskaičiuota naudojant molinį ekstinkcijos koeficientą (ε=156, 000 M 1 cm 1 ). Metodas išsamiau aprašytas kitur [12,13]. 2.8.2. Karbonilo grupių matavimas Karbonilo grupių lygis buvo apskaičiuotas naudojant molinį ekstinkcijos koeficientą (ε=22,000 M 1 cm 1 ) ir buvo išreikštas nmol karbonilo grupėmis/mg plazmos baltymo, pagal Bartosz [ 13] ir Levine et al. [14]. 2.8.3. Tiolių grupės nustatymas Tiolio grupės kiekis plazmos baltymuose buvo matuojamas spektrofotometriškai naudojant SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Vokietija) pagal absorbciją prie 412 nm su 5,5′-ditiol-bis-(2- nitrobenzenkarboksirūgštimi). Metodas plačiau aprašytas kitur [15–17].

2.9. Hemostazės parametrai

2.9.1. Protrombino laiko (PT) matavimas

PT buvo nustatytas koagulometriškai, naudojant optinę koaguliaciją

Raidės nurodo Tukey testo rezultatus (p < 0.05), reikšmes su tokia pačia

raidė eilutėje labai nesiskiria.

2.9.2. Trombino laiko (TT) matavimas

TT buvo nustatytas koagulometriškai naudojant optinį koaguliacijos analizatorių (modelis K-3002, Kselmedas, Grudziadz, Lenkija), pagal Malinowska ir kt. aprašytą metodą. [18].

2.9.3. Aktyvuoto dalinio tromboplastino laiko (APTT) matavimas

APTT buvo nustatytas koagulometriniu būdu, naudojant K-3002 optinį koaguliacijos analizatorių (Kselmed, Grudziadz, Lenkija), remiantis Mali now ska ir kt. [18].

2.10. Duomenų analizė Q-Dixon testas buvo atliktas siekiant pašalinti neapibrėžtus duomenis.

Duomenys buvo tikrinami normaliam pasiskirstymui naudojant Shapiro-Wilk testą ir dispersijos lygybę su Levene testu. Statistiškai reikšmingi skirtumai buvo nustatyti naudojant ANOVA, po to Tukey daugkartinio palyginimo testą arba Kruskal-Wallis testą. Palyginimai buvo laikomi reikšmingais, kai p < 0.05.="" vertės="" pateikiamos="" kaip="" vidurkiai="" ±="">