1 dalis: Cistanche Tubulosa feniletanoidiniai glikozidai sukelia kepenų ląstelių karcinomos ląstelių apoptozę ir sustiprina priešnavikinį poveikį
Mar 25, 2022
Susisiekite: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Airire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, PhD1 ir Jinyao Li, PhD1
Abstraktus
Cistanche kanalėliaia yra kinų vaistažolių medicinos rūšis ir atlieka įvairias biologines funkcijas. Ankstesni tyrimai įrodė, kadCistanche tubulosa feniletanoidiniai glikozidai(CTPG) turi priešnavikinį poveikį įvairioms naviko ląstelėms. Tačiau priešnavikinis CTPG poveikis HepG2 ir BEL{1}} hepatoceliulinės karcinomos (HCC) ląstelėms vis dar sunkiai suprantamas. Mūsų tyrimas parodė, kad CTPG reikšmingai slopino HepG2 ir BEL-7404 ląstelių augimą, sukeldamas ląstelių ciklo sustabdymą ir apoptozę, o tai buvo susiję su MAPK kelių, kuriems būdingas padidėjęs p38, JNK, fosforilinimas, aktyvacija. ir ERK1/2 bei nuo mitochondrijų priklausomas kelias, kuriam būdingas mitochondrijų membranos potencialo sumažėjimas. Gydymas CTPG vėliau padidino citochromo c išsiskyrimą ir kaspazės -3, -7, -9 ir PARP skilimą. Be to, CTPG žymiai slopino HepG2 migraciją, sumažindamas matricos metaloproteinazės{13}} ir kraujagyslių endotelio augimo faktorių kiekį. Įdomu tai, kad CTPG ne tik padidino splenocitų proliferaciją, bet ir sumažino cisplatinos sukeltą splenocitų apoptozę. H22 naviko pelės modelyje CTPG kartu su cisplatina dar labiau slopino H22 ląstelių augimą ir sumažino šalutinį cisplatinos poveikį. Apibendrinant, CTPG slopino HCC augimą dėl tiesioginio priešnavikinio poveikio ir netiesioginio imuniteto stiprinimo bei pagerino cisplatinos priešnavikinį veiksmingumą.
Raktiniai žodžiai Cistanche tubulosa feniletanoidiniai glikozidai, apoptozė, MAPK kelias, nuo mitochondrijų priklausomas kelias, cisplatina, imuniteto stiprinimas
Cistanche turi priešnavikinį poveikį.
Spustelėkite Cistanche produktus ir Cistanche
Įvadas
Numatyta, kad 2018 m. kepenų vėžys bus šeštas dažniausiai diagnozuojamas vėžys ir ketvirta pagrindinė mirties nuo vėžio priežastis visame pasaulyje, o Pietryčių Azijoje (Mongolijoje, Kambodžoje ir Vietname) kasmet miršta apie 841 000 naujų atvejų ir 782 000 mirčių. .1 Kinijoje kepenų vėžys buvo trečia pagrindinė su vėžiu susijusių mirčių priežastis 2015 m.2 Daugiau nei 90 procentų pirminių kepenų vėžio atvejų yra hepatoceliulinė karcinoma (HCC) visame pasaulyje. Šiuo metu pagrindiniai HCC gydymo metodai yra hepatektomija, kepenų transplantacija ir perkutaninė abliacija. Deja, šie gydymo būdai yra veiksmingi 30 procentų pacientų, kuriems diagnozuotas ankstyvas kepenų vėžys, o pacientai, kuriems diagnozuotas pažengęs kepenų vėžys (40 procentų), turi pasikliauti paliatyviu gydymu, kad pailgėtų jų išgyvenamumas.3,4 Sorafenibas kartu su kepenų ligomis. arterijų chemoembolija yra svarbus ir įprastas paliatyvus gydymas daugeliui pacientų, sergančių pažengusiu HCC Azijos ir Ramiojo vandenyno regione.5 Sorafenibas, FDA patvirtintas 2006 m. pažengusiam kepenų vėžiui gydyti, yra daugybinis kinazės inhibitorius, slopinantis naviko ląstelių dauginimąsi ir kraujagysles. gamybą ir skatina naviko ląstelių apoptozę. Sorafenibas žymiai pailgina paciento išgyvenamumą 3–5 mėnesiais, tačiau turi rimtų šalutinių poveikių ir yra glaudžiai susijęs su atsparumo vaistams atsiradimu.6 Todėl būtina skubiai sukurti naujus vaistus ar strategijas HCC gydymui.
Tradicinė kinų medicina (TCM) atskirai arba kartu su kitomis strategijomis buvo naudojama gydant HCC ir parodė klinikinę naudą, įskaitant ilgesnį išgyvenamumą, geresnę gyvenimo kokybę, sumažintą nepageidaujamų reakcijų skaičių ir pan.7,8Cistancheyra TCM, turintis feniletanoidinių glikozidų (PhG), iridoidų, lignino ir polisacharidų, kuris atlieka įvairias biologines funkcijas, tokias kaip antioksidacinės, priešuždegiminės, senėjimą stabdančios, atminties stiprinimo ir imuninės sistemos stiprinimo funkcijos.9 PhG buvo laikomi pagrindiniai aktyvūs Cistanche komponentai ir atlieka daugybę funkcijų, įskaitant antioksidaciją, priešuždegiminį, antiapoptozę, kepenų apsaugą ir neuroprotekciją.{7}} Mūsų grupė pranešė, kadCistanchetubulosa feniletanoidiniai glikozidai(CTPG) gali slopinti melanomos B16-F10 ląstelių, stemplės karcinomos Eca-109 ląstelių ir HCC H22 ląstelių augimą per išorinius arba vidinius signalizacijos kelius in vitro arba in vivo; be to, CTPG turėjo imunostimuliacinį poveikį.13-15
Šiame tyrime mes ištyrėme priešnavikinį CTPG poveikį ir mechanizmą HepG2 ir BEL{1}} ląstelėms in vitro, išanalizavome CTPG imunomoduliacinę funkciją in vitro ir in vivo ir toliau vertinome terapinį CTPG poveikį kartu su chemoterapija. vaisto cisplatina ant HCC H22 naviko pelių in vivo. Mes nustatėme, kad CTPG gali slopinti HepG2 ir BEL-7404 ląstelių augimą per nuo mitochondrijų priklausomą apoptozę ir MAPK signalizacijos kelią. CTPG reikšmingai slopino HepG2 ląstelių migraciją, sumažindamas matricos metaloproteinazės -2 (MMP-2) ir kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) kiekį. Be to, CTPG skatino imuninių ląstelių dauginimąsi ir aktyvavimą bei sustiprino pelių imunitetą. Svarbu tai, kad CTPG kartu su cisplatina gali dar labiau slopinti H22 ląstelių augimą in vivo ir sumažinti šalutinį cisplatinos poveikį.
Cistanche stiprina imunitetą.
Medžiagos ir metodai
Gyvūnai
Maždaug 6–8 savaičių BALB/c, Kunmingo pelių ir C57BL/6 pelių patelės buvo nupirktos iš Sindziango medicinos universiteto (Urumčis, Sindziangas, Kinija) gyvūnų laboratorijos centro ir laikomos Sindziango universiteto gyvūnų patalpoje su kambario temperatūra. (RT) 25±3 laipsniai ir 12/12 valandų šviesos ir tamsos periodas.
Ląstelių linijos ir ląstelių kultūra
Pelės H22 ląstelės buvo įsigytos iš Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Uhanas, Hubei, Kinija), o žmogaus HCC HepG2 ir BEL{2}} ląstelės buvo gautos iš Sindziango pagrindinės biologinių išteklių ir genų inžinerijos laboratorijos, Sindziango universitetas (Urumčis, Sindziangas, Kinija) ir kultivuojamas RPMI 1640 terpėje (Gibco, JAV) arba Dulbecco modifikuotoje Erelio terpėje (DMEM) (Gibco), kurioje yra 10 procentų termiškai inaktyvuoto galvijų vaisiaus serumo (MRC, Kinija), 1 procentas L- glutamino (100 mM), 100 V/mL penicilino ir 100 ug/mL streptomicino 37 laipsnių temperatūroje drėgnoje 5 procentų CO2 atmosferoje.
Aukštos kokybės skysčių chromatografija (HPLC)
Pagrindiniai CTPG junginiai (Upbio Tech Co., Ltd., Šanchajus, Kinija) buvo kvalifikuoti ir kiekybiškai įvertinti HPLC, kaip buvo pranešta anksčiau.13 Buvo naudojama ZORBAX SB-C18 kolonėlė (25{7}}×4,6 mm; 5 μm). o judriąją fazę sudarė 0,2 procento skruzdžių rūgšties tirpalas ir metanolis su gradientu nuo 23 procentų iki 31 procento. Iš viso buvo įšvirkšta 10 μL mėginio ir aptikta 330 nm. CTPG komponentams analizuoti buvo naudojami echinakozido ir akteozido standartai (Yuanye, Šanchajus, Kinija).
echinakozidas
Ląstelių gyvybingumo analizė
Priešnavikinis CTPG poveikis HepG2 ir BEL{1}} ląstelėms buvo įvertintas naudojant MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolio bromidas). HepG2 ir BEL{11}} ląstelės buvo dedamos į 96-šulinėlių plokšteles (5 × 104 ląstelės šulinėlyje) ir apdorotos 0, 200, 400 ir 600 ug/mL CTPG atitinkamai 24 ir 48 valandas po 24 valandų inkubacijos 37 laipsnių temperatūroje. Kaip teigiama kontrolė buvo naudojama apie 35 ug/ml cisplatinos (Yuanye). Tada į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 100 μL MTT (0,5 mg/ml, praskiesta terpe be FBS terpės) ir kultivuojama 3 valandas 37 laipsnių temperatūroje ir 5 proc. CO2. Po inkubacijos plokštelės buvo centrifuguojamos 1200 aps./min. greičiu 7 minutes, terpė pašalinta ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 200 ug/mL DMSO, kad ištirptų susidarę formazano kristalai. OD490 vertės buvo išmatuotos 96-šulinėlių mikroplokštelių skaitytuvu (Bio-Rad Laboratories, CA, JAV). Norint įvertinti CTPG poveikį splenocitams, ląstelės buvo išskirtos iš C57BL/6 pelių ir pasodintos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 1 × 105 ląstelių/šulinėlių. Splenocitai buvo gydomi 0, 200, 400 ir 600 ug/ml atitinkamai 24, 48 ir 72 valandas. Ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę: Ląstelių gyvybingumas (procentais)=(ODapdorotas / ODneapdorotas) × 100 procentų.
Ki aptikimas-67
Ki{{0}} buvo nustatytas pagal mūsų ankstesnį tyrimą.16 Trumpai tariant, BEL-7404 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis (0, 200, 400 ir 600 ug/mL) CTPG. arba cisplatina (35 ug/ml). Po 24 valandų ląstelės buvo surinktos ir plaunamos PBS, po to fiksuotos ir pralaidžios Foxp3 dažymo buferio rinkiniu (eBioscience, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Intraląstelinis dažymas buvo atliktas naudojant FITC konjuguotą Ki{10}} antikūną (BD Biosciences, San Chosė, CA, JAV) 15 minučių kambario temperatūroje. Mėginiai buvo analizuojami srauto citometrija (BD FACSCalibur, CA, JAV).
Ląstelių apoptozės ir ląstelių ciklo analizė
HepG2 ir BEL-7404 ląstelės buvo pasėtos 2,5 × 105 ląstelių / lėkštelės tankiu ir inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje per naktį. Ląstelės buvo tripsinizuojamos ir surenkamos centrifuguojant po apdorojimo įvairių koncentracijų CTPG arba iš anksto apdorotos kaspazės inhibitoriumi (Z-VAD-FMK) arba kaspazės -3 inhibitoriumi (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kinija) 2 valandas prieš tai. CTPG gydymas. Po 24 valandų apoptozė buvo aptikta srauto citometrija. Trumpai tariant, surinktos ląstelės buvo plaunamos šaltu PBS (Gibco) ir resuspenduojamos aneksiną surišančiame buferyje su 2,5 μL anneksino V-FITC ir 5 μL PI-PE dažymo tirpalu (Solarbio, Pekinas, Kinija), o po to ląstelės buvo inkubuojamos kambario temperatūroje. tamsoje 15 minučių. Ląstelių ciklo pasiskirstymo analizei ląstelės buvo paimtos po apdorojimo CTPG ir fiksuotos šaltame 70 procentų etanolyje 4 laipsnių temperatūroje 30 minučių. Ląstelės buvo nudažytos PI (BD Biosciences) tamsoje 30 minučių. Mėginiai buvo analizuojami srauto citometru (BD FACSCalibur). Ląstelių apoptozės ir su ciklu susijusių baltymų ekspresijos lygiai buvo nustatyti Western blot metodu.
Western Blot
Western blot buvo atliktas pagal mūsų ankstesnį tyrimą.17HCC buvo apdoroti CTPG 24 valandas. Du kartus nuplovus lediniu PBS, visos prilipusios ir plūduriuojančios ląstelės buvo surinktos ir 2 0 minutes lizuojamos RIPA lizės buferyje (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) ant ledo. Po centrifugavimo 12 000 aps./min 4 laipsnių 10 minučių, baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Ta pati baltymų koncentracija buvo atskirta 12 procentų SDS-PAGE ir perkelta į PVDF membranas. Po plovimo PBST buferiu (PBS su 0,05 proc. Tween-20), membranos buvo užblokuotos 5 proc. neriebiu pienu 37 laipsnių temperatūroje 1 valandą ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais (Cell Signaling Technology, MA, JAV). tinkamai praskiedus per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Po 3 kartų plovimo PBST membrana buvo inkubuojama su atitinkamais HRP konjuguotais antriniais antikūnais (eBioscience) 2 valandas 37 laipsnių temperatūroje. Tiksliniai baltymai buvo aptikti naudojant ECL tyrimo rinkinį (Beyotime). Pilkos spalvos nuskaitymo duomenys buvo gauti naudojant Image J.
Mitochondrijų membranos potencialo (Δψm) analizė
Δψm buvo nustatytas membranai pralaidžiais JC-1 dažais (Beyotime). Trumpai tariant, HepG2 ir BEL{3}} ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis CTPG (0, 200, 400 ir 600 ug/ml) 24 valandas. Visos ląstelės buvo surinktos ir išplautos JC-1 plovimo buferiu. Ląstelės buvo nudažytos JC-1 fluorescenciniu zondu pagal gamintojo instrukcijas 20 minučių kambario temperatūroje. Du kartus nuplovus PBS, visi mėginiai buvo analizuojami srauto citometrija (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 dažymas
Dažymas Hoechst 33342 buvo atliktas pagal mūsų ankstesnį tyrimą.16 Branduolių morfologiniai pokyčiai buvo tiriami naudojant membranai pralaidžius DNR surišančius dažus Hoechst 33342 (Beyotime). Trumpai tariant, ląstelės buvo pasėtos į 6-šulinėlių plokštelę, koncentraciją 1 × 105 ląstelių/šulinėlių 2 ml terpėje. Pasiekus 70–80 procentų susiliejimą, ląstelės buvo gydomos 200, 400 ir 600 ug/ml CTPG arba cisplatina 24 valandas. Ląstelės buvo plaunamos PBS ir fiksuojamos 4 procentais ledo šalto paraformaldehido 4 laipsnių temperatūroje 10 minučių. Po plovimo PBS ląstelės buvo nudažytos Hoechst 33342 4 laipsnių temperatūroje 10 minučių. Mėginiai buvo stebimi fluorescenciniu apverstu mikroskopu (Nikon Eclipse Ti-E, Japonija).
cistanche ekstraktas
Migracijos tyrimas
HCC ląstelių migracija buvo aptikta atliekant žaizdų gijimo tyrimą. Trumpai tariant, HepG2 ląstelės (2 × 104/šulinėlis) buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokštelę. Pasiekus 80 procentų santaką, kiekvieno šulinėlio centras buvo vieną kartą subraižytas 20 μl pipetės antgaliu. Po plovimo PBS, ląstelės buvo apdorotos cisplatina (35 ug / ml) arba skirtingomis koncentracijomis (0, 200, 400 ir 600 ug / ml) CTPG 37 laipsnių temperatūroje. Po 24 valandų kiekvieno mėginio vaizdai buvo paimti mikroskopu (Nikon Eclipse Ti-E). Vidutiniai ląstelių migracijos atstumai buvo išanalizuoti pagal J vaizdą. Žaizdų gijimo procentas buvo apskaičiuotas pagal lygtį: žaizdų gijimas (procentais )=(1 – įbrėžimo plotas nurodytu laiko tašku/įbrėžimo plotas 0 val.) × 100 procentų . Su ląstelių migracija susijusių baltymų MMP-2 ir VEGF ekspresijos lygiai buvo nustatyti Western blot metodu.
Splenocitų proliferacija ir apoptozė
Proliferacijos analizei splenocitai buvo išskirti iš 3 C57BL/6 pelių ir nudažyti CFSE (eBioscience). CFSE pažymėtos ląstelės buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 2 × 106 ląstelės 1 ml terpėje vienoje duobutėje ir apdorotos skirtingomis koncentracijomis CTPG (200, 400 ir 600 ug/ml) arba sujungtos su 35 ug. /mL cisplatinos 72 valandas. Srauto citometrijos analizė atlikta po dažymo CD3-APC ir CD19-PE (BD Biosciences). Apoptozės analizei splenocitai buvo inokuliuoti į 24-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 2 × 106 ląstelės 1 ml terpėje vienoje duobutėje ir apdorotos skirtingomis koncentracijomis CTPG (200, 400 ir 600 ug/ml) arba sujungtos su cisplatina 24 valandas. Srauto citometrijos analizė buvo atlikta po dažymo 2,5 μL aneksino V-FITC ir 5 μL PI-PE tirpalo.
CTPG saugos įvertinimas ir imunostimuliuojanti veikla in vivo
Norint įvertinti CTPG imunostimuliuojančią veiklą in vivo, 6–8 savaičių Kunmingo pelių patinai buvo atsitiktinai suskirstyti į 7 grupes (5 pelės grupėje). Poodinė injekcija (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoninė injekcija (ip, 200, 400 mg/kg) ir intragastrinė injekcija (ig, 200, 400 mg/kg) buvo atliekamos kas 2 dienas iš viso 7 kartus. , o kontrolinė grupė negavo jokio gydymo. Pelės svėrės kas antrą dieną, o pelių būklė buvo stebima kiekvieną dieną. Po gydymo CTPG pelių organai buvo atskirti ir pasverti. Organų indeksai buvo apskaičiuoti pagal formulę: organo indeksas=organo svoris (mg)/kūno svoris (g). Splenocitai buvo surinkti, suskaičiuoti ir nudažyti anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC arba anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Mėginiai buvo aptikti srauto citometrija (BD FACSCalibur).
Priešnavikinis CTPG, derinio su cisplatina, veiksmingumas pelėms, turinčioms H22 navikus, maždaug 6–8 savaičių amžiaus BALB/c pelių patinams po oda buvo sušvirkštos H22 ląstelės (1.{7}} × 106 vienai pelei 100 μL PBS). Kai auglio tūris pasiekė apytiksliai 60 mm3, naviką turinčios pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į 4 grupes (6 pelės grupėje) ir gydomos cisplatina (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatina (4 mg/kg) ir CTPG. 400 mg/kg) arba be gydymo (kontrolinė grupė). Auglio pelėms buvo į pilvaplėvės ertmę įšvirkšta CTPG atitinkamai 5, 7, 9, 11 ir 13 dienomis. Cisplatina buvo švirkščiama į veną 7 ir 11 dienų. Auglio tūris ir kūno svoris buvo matuojami kas antrą dieną. Naviko tūris buvo apskaičiuotas taip: Naviko tūris (V)=a × b2/2, kuriame a ir b atitinkamai reiškia ilgiausią ir trumpiausią naviko skersmenį, išmatuotą nonijaus slankmačiu. 20 dieną organai ir navikai buvo išskirti ir pasverti. Splenocitai buvo surinkti, suskaičiuoti ir nudažyti anti-CD3-APC ir anti-CD19-PE arba anti-CD4-FITC ir anti-CD8-APC arba anti-CD11b-PE ir anti-Gr-1-APC arba anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC ir anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Vėliau ląstelių dažnis ir skaičius buvo analizuojami srauto citometrija (BD FACSCalibur).
Cistanche sustiprina priešnavikinį poveikį ir gerina imunitetą.
Norėdami gauti daugiau informacijos, spustelėkite paveikslėlį.
Statistinė analizė
Visi duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM). Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę/dvipusę dispersijos analizę (ANOVA) naudojant Prism5.{2}} programinę įrangą. P<.05 was="" considered="" statistically="">
