1 dalis: Echinakozidas padidina žiurkių spermatozoidų kiekį, nukreipdamas į pagumburio androgenų receptorius

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 ir Xiaoying Zhang1,2

Pls spustelėkite čia, kad pamatytumėte 2 dalį

Vyrų nevaisingumas yra pagrindinė sveikatos problema, pasaulyje paplitęs 4,2 procento vyrų nevaisingumo. Mūsų ankstyvas darbas tai parodėCistanche ekstraktaiapsaugoti nuo pelių spermos pažeidimo ir taiechinakozidas(ECH) yra vienas iš pagrindinių aktyvių komponentų. Čia pranešame apie esminį ECH, natūralaus produkto, kuris pakeičia žiurkėms oligoastenospermiją arba apsaugo nuo jos, vaidmenį. ECH buvo tiriamas HPLC, buvo įvertintas spermatozoidų kiekis ir kokybė, o hormonų lygis nustatytas radioimunosorbentiniu tyrimu. ECH sumažino androgenų receptorių (AR) ir pagrindinių steroidogeninių genų lygį, kaip nustatyta Western blot ir qPCR analize. ECH ir AR sąveika buvo įvertinta netiesioginiu ELISA ir molekuliniu prijungimu. Rezultatai rodo, kad ECH kartu su pagumburio AR Met-894 ir Val-713 kišenėje slopina AR perdavimą iš citoplazmos į pagumburio branduolius. Nors neigiamas grįžtamasis ryšys apie lytinių hormonų reguliavimą buvo slopinamas, teigiamas grįžtamasis ryšys buvo skatinamas padidinti liuteinizuojančio hormono ir testosterono sekreciją, o tai vėliau padidino spermatozoidų kiekį. Visi šie duomenys rodo, kad ECH blokuoja AR aktyvumą pagumburyje, kad padidintų spermatozoidų kiekį ir apsaugotų nuo oligoastenospermijos žiurkėms.

Cistanche

Testosterono gamybą sėklidžių ląstelėse stipriai reguliuoja pagumburio-hipofizės-lytinių liaukų ašis (HPG), sudarydama homeostatinę grįžtamojo ryšio kilpą1. Gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas (GnRH), išskiriamas pagumburio, gali paskatinti liuteinizuojančio hormono (LH) sekreciją iš hipofizės, o tai dar labiau skatina testosterono gamybą sėklidžių Leydig ląstelėse. Testosteroną biosintetina daugybė steroidogeninių fermentų. Steroidogeninis ūmus reguliuojantis (StAR) baltymas, kaip vienas iš pagrindinių būdų, gali pernešti cholesterolį iš tarpląstelinių šaltinių į mitochondrijas2, kur jis yra veikiamas cholesterolio šoninės grandinės skilimo fermento (CYP11A1), 3 -hidroksisteroido dehidrogenazės (HSD3), { {10}}hidroksilazė (CYP17A1) ir 17 -hidroksisteroidų dehidrogenazė (HSD 17 ), kurios katalizuoja cholesterolio pavertimą testosteronu3,4. Testosteronas neigiamai grįžta į HPG elementą, kad sumažintų tolesnę LH sekreciją priklausomai nuo dozės.

Testosterono poveikis HPG ašies grįžtamojo ryšio kilpai atsiranda prisijungdamas prie androgenų receptorių (AR), randamų ir pagumburyje, ir hipofizėje5. Pelėms dėl AR abliacijos ir minimalios testosterono gamybos padidėja LH ir folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) lygis6, o tai rodo, kad AR dalyvauja reguliuojant neigiamą pašarų kilpą. Klasikinis genominis testosterono signalizacijos mechanizmas atsiranda, kai testosteronas difunduoja į ląstelę ir prisijungia prie AR. Tada šis ligandų-receptorių kompleksas persikelia į branduolį, kur jungiasi su androgenų atsako elementais (ARE) į testosteroną reaguojančių genų reguliavimo regionuose, kad pakeistų jų translokaciją. Testosteronas taip pat skatina neklasikinį steroidinio hormono veikimo būdą, kuriam būdingi greiti įvykiai, dėl kurių suaktyvėja citozolinės signalizacijos kaskados, kurias paprastai sukelia augimo faktoriai7,8. Tiek klasikiniai, tiek neklasikiniai testosterono keliai padeda palaikyti spermatogenezę ir vaisingumą. Tačiau AR funkcija yra svarbesnė klasikiniame kelyje, nes testosteronas pagerina spermos kokybę.

Echinakozidas(ECH) yra vienas iš biologiškai aktyvių komponentų, gautų iš vaistinių augalų Echinacea9 irCistanche10. Plataus spektro farmakologinės veiklos ežiuolės ekstraktai yra 1Šiuolaikinės biotechnologijos tyrimų centras, Biotechnologijos ir maisto inžinerijos mokykla, Anyang technologijos institutas, Anyangas, Henanas, 455000, Kinija. 2 Veterinarinės medicinos koledžas, Šiaurės vakarų A & F universitetas, Yangling, Shaanxi, 712100, Kinija. 3 Biomedicinos mokslų katedra, Ontarijo veterinarijos koledžas, Gvelfo universitetas, Gvelfas, Ontarijas, N1G 2W1, Kanada. Susirašinėjimus ir prašymus dėl medžiagos reikia adresuoti XZ

vienas populiariausių vaistažolių papildų Europoje ir JAV daugiausia dėl savo antioksidacinių savybių11 ir gebėjimo apsisaugoti nuo peršalimo12. Įdomu,Cistanche ekstraktai ir ECH tradicinėje kinų medicinoje buvo tradiciškai naudojami kaip tonizuojanti priemonė, skirta reprodukcinei disfunkcijai gydyti ir vyrų seksualinei veiklai skatinti10. Kai kurie ne biržos produktaiCistanche ekstrahavimas buvo sukurtas kaip maitinantis papildas ir populiarėja sveiko maisto rinkose Kinijoje ir kai kuriose kitose Azijos šalyse (Kinijos maisto ir vaistų administracija)13. Tačiau pagrindiniai ECH veikimo mechanizmai lieka neaiškūs.

Vyrų nevaisingumas yra pagrindinė sveikatos problema, o pasaulyje paplitimas sudaro 4,2 proc. vyrų nevaisingumo14. Vyrų nevaisingumo diagnozė šiuo metu pagrįsta spermos kokybės tyrimu, įskaitant sėklinių parametrų, tokių kaip spermos koncentracija, judrumas ir morfologija, analizę15. Estrogeną imituojantis bisfenolis A (BPA) yra plačiai paplitęs aplinkos teršalas, kurio poveikis kelių gyvūnų rūšių ir žmonių patinų vaisingumui buvo ištirtas16. BPA sutrikdo pagumburio-hipofizės-lytinių liaukų ašį, slopina sėklidžių steroidogeninių fermentų ekspresiją ir testosterono sintezę patinų jaunikliams17, sukeldamas hipogonadotropinio hipogonadizmo būseną18. Šiame tyrime tiriame ECH poveikį spermos kokybei ir hormonų lygiui. Be to, BPA buvo pasirinktas kaip spermos pažeidimo modelio agentas, siekiant toliau tirti apsauginį ECH poveikį nuo prastos spermos kokybės.

Cistanche ekstraktai

Rezultatai

ECH padidina spermatozoidų kiekį. Spermatozoidų skaičius uodegos epididimyje, spermatozoidų gyvybingumas ir spermatozoidų judrumas pateikti 1 lentelėje. Gydymas 80 mg/kg ECH ir 15 mg/kg testosterono propionato (TP) reikšmingai padidino prielipo spermatozoidų skaičių. Tačiau reikšmingo spermos gyvybingumo ir judrumo skirtumo nebuvo.

ECH padidina testosterono ir LH kiekį serume, encefalone ir hipofizėje bei sėklidėse. Gydymas ECH žymiai padidino LH kiekį serume, encefaloną, hipofizę ir sėklidę (1A pav.). ECH(H) grupėje LH lygis reikšmingai padidėjo 1.{2}}kartu serume, 14-kartu encefaloje ir hipofizėje ir 12-kartu sėklidėje. Testosteronas po ECH(H) gydymo žymiai padidėjo 1,5 ir 1.{10}}karto encefalonu, hipofizėje ir sėklidėje, bet ne serume. Po gydymo TP testosterono kiekis serume, encefalone, hipofizėje ir sėklidėje žymiai padidėjo 1,6, 1,8 ir 1.{16}}karto.

ECH padidino steroidogeninio fermento geno ekspresiją. ECH žymiai padidino pagrindinių steroidogeninių fermentų ekspresiją sėklidėje (1B pav.). CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 ir HSD17 mRNR lygiai ECH(H) grupėje padidėjo daugiau nei 3- kartus, o StAR mRNR lygiai reikšmingų skirtumų, gydant ECH. (p > 0.05). TP reikšmingai nepakeitė CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 ir HSD17 ekspresijos. Tai atsispindi išsamioje ECH poveikio steroidogeninių fermentų ekspresijai analizėje, rodančioje, kad ECH žymiai padidino CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 ir HSD17, ypač HSD3 1/ mRNR lygį. 2 (1C pav.).

ECH gali prasiskverbti per kraujo-smegenų barjerą ir, kiek mažesniu mastu, per kraujo-sėklidžių barjerą. Norint įvertinti androgenų grįžtamąjį ryšį HPG ašyje, ECH gebėjimas patekti į pagumburį buvo įvertintas atliekant keletą PK tyrimų. ECH koncentracija buvo aptikta pagumburyje po 12 valandų vienkartinio 30 mg/kg ECH vartojimo per burną, o ECH buvo ryškus pagumburio įsiskverbimas, o vidutinis pagumburio ir plazmos santykis buvo 33,92 proc. (2A pav.). T1/2 reikšmės buvo atitinkamai 2,61 ± 0,42 h ir 1,88 ± 0,22 h plazmoje ir pagumburyje (2B pav.). Tačiau naudojant HPLC buvo aptiktas labai ribotas ECH patekimas į sėklidę. ECH koncentracijos sėklidėse buvo 0.083 ug/mL, 0,043 ug/mL ir 0,028 ug/mL atitinkamai po 0,5 val., 1 val. ir 1,5 val. gydymas.

ECH sumažina pagumburio AR perkėlimą į branduolį. Norint patikrinti ECH poveikį AR translokacijai, AR ekspresija sėklidžių ir pagumburio citoplazmoje ir branduolyje buvo nustatyta naudojant Western blot analizę. Kaip parodyta 3A pav., ECH sumažino AR baltymą pagumburio branduoliuose, lyginant su kontroline grupe. Gydymas enzalutamidu, AR inhibitoriumi, sumažino AR baltymo kiekį pagumburio branduoliuose 4 8- kartus. Pažymėtina, kad citoplazminis AR buvo didesnis gydant ECH ir gydant enzalutamidu nei kontrolinių, o tai rodo, kad ECH blokuoja AR transportavimą iš citoplazmos į pagumburio branduolį. Kaip ir tikėtasi, ECH neslopina AR transportavimo iš citoplazmos į sėklidės branduolį (3B pav.).

ECH padidino su HPG ašimi susijusių genų ekspresiją. ECH reikšmingai padidino LH , LHR, GnRH 1 ir Gnrhr ekspresijas encefalono ir hipofizės mišiniuose, tačiau po gydymo TP reikšmingo GnRH 1 lygių skirtumo nebuvo. Šilumos žemėlapio analizė rodo, kad GnRH 1 ir LH ekspresijos buvo didžiausios tarp su HPG ašimi susijusių genų.

1 pav. ECH poveikis LH, testosterono ir pagrindinių steroidogeninių fermentų lygiams. Pastaba: (A) LH lygis serume, encefaloje, hipofizėje ir sėklidėje (mIU/mL, vidurkis ± SD);

T lygis serume, encefaloje ir hipofizėje bei sėklidėje (ng/mL, vidurkis ± SD); (B) pagrindinių steroidogeninių fermentų ekspresija;

(C) hierarchinis skirtingų steroidogeninių fermentų mRNR ekspresijos grupavimas sėklidėse. Žalia, žalia-raudona ir raudona spalvos reiškia žemą,

vidutinio ir didelio gausumo, atitinkamai, n=7. a,b,c Skirtingos raidės žymi statistiškai skirtingas grupes (p <>

2 pav. ECH pasiskirstymas ir farmakokinetiniai parametrai pagumburyje. Pastabos: (A) pagumburio ir plazmos santykis (procentais ) buvo apskaičiuotas remiantis ECH (koncentracijos) ekspozicija plazmoje ir pagumburyje 0,5 val., 1.0 val., 1,5 val., 2.{101} {8}} val., 2,5 val., 3.0 val., 6.0 val., 9.0 val. ir 12.{18}} val. išgėrus. (B) ECH farmakokinetiniai (PK) parametrai plazmoje ir pagumburyje. T1/2, pusinės eliminacijos laikas; Cmax, didžiausia koncentracija; Vz/F, tariamasis pasiskirstymo tūris; MRT, vidutinis sulaikymo laikas; AUC, plotas po koncentracijos ir laiko kreive.

AR yra ECH taikinys. Siekiant patvirtinti ryšį tarp ECH ir AR, buvo sėkmingai susintetintas ECH-ovalbuminas (ECH-OVA) (5A, B pav.). ECH-OVA molekulinė masė yra didesnė nei OVA, todėl jų mobilumo greitis skiriasi (5A pav.), o ECH-OVA absorbcijos smailė yra tarp ECH ir OVA (5B pav.).

Cistanche ekstraktai

Paveikslas 3. ECH poveikis AR transportavimui sėklidėse ir pagumburyje. Pastabos: (A) ECH poveikis AR transportavimui pagumburyje. AR baltymų lygis buvo nustatytas Western blot analize, o juostelės rodo densitometrinį branduolinio AR, normalizuoto iki B laminato, ir citoplazminio AR, normalizuoto pagal GAPDH, kiekybinį įvertinimą. Kiekviena vertė yra šešių nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. a,b,c Skirtingos raidės virš juostų žymi statistiškai skirtingas grupes (p < 0.05);="">B) ECH poveikis AR transportavimui sėklidėse.

tai rodo, kad ECH buvo sėkmingai konjuguotas su OVA. Netiesioginiai ELISA rezultatai (5C pav.) rodo, kad anti-AR antikūnas gali aptikti AR baltymą, esantį duobutėse, kuriose yra ECH-OVA (rodomas anti-OVA antikūnu), o tai rodo, kad ECH gali prisijungti prie AR baltymo.

ECH derinamas su Met{0}} ir Val-713 AR kišene. Junginys ECH buvo prijungtas prie AF2 vietos žmogaus AR paviršiuje, o teorinis ECH ir AR surišimo būdas parodytas 5D pav. Junginys ECH priėmė kompaktišką konformacijos surišimą žmogaus AR kišenėje. Dvi ECH fenilo grupės jungiasi AR kišenės hidrofobiniame domene ir palaiko glaudžius hidrofobinius kontaktus su liekanomis Leu-712, Val{5}}, Met-734, Ile-737 , Met-894 ir Ile-898, o kitos dvi ECH pusės buvo išdėstytos prie kišenės įėjimo ir užmezgė tik keletą kontaktų. Išsami analizė parodė, kad ir Met-894 (ryšio ilgis: 2,4 Å), ir Val-713 (ryšio ilgis: 2,7 Å) sudarė vandenilinius ryšius su ECH hidroksi1 grupėmis, o tai buvo pagrindinė ECH sąveika. ir žmogaus AR.

ECH sumažina BPA sukeltą reprodukcinės sistemos pažeidimą. Norint ištirti ECH poveikį reprodukcinei žalai, BPA sukeltų pelių spermos kokybė ir lytinių hormonų bei steroidogeninių fermentų lygis buvo tiriamas. Kaip parodyta 6 pav., gydymas BPA žymiai sumažino spermatozoidų skaičių ir spermatozoidų judrumą atitinkamai 26,5 proc. ir 39,2 proc. ECH vartojimas neleido spermatozoidų skaičiui ir judrumui sumažinti atitinkamai 35,5 ir 30,1 proc. Vartojant BPA taip pat labai sumažėjo LH ir T sekrecija, o ECH žymiai padidino LH ir T kiekį atitinkamai 24,1 proc. ir 18,3 proc. , palyginti su gydymu vien BPA (6A, B pav.). StAR, CYP17A1, 3 -HSD ir 17 -HSD mRNR lygiai gydant BPA-ECH buvo žymiai didesni, palyginti su gydymu BPA (6C, D pav.).

4 pav. Su HPA susijusios genų ekspresijos pokyčiai po gydymo ECH. Pastabos: (A–D) juostos rodo LH , LHr, Gnrh 1 ir Gnrhr mRNR lygius encefalone ir hipofizėje. a,b,c Skirtingos raidės virš juostų žymi statistiškai skirtingas grupes (p < 0.05).="" (e)="" skirtingų="" steroidogeninių="" fermentų="" mrnr="" ekspresijos="" hierarchinė="" grupuotė.="" žalia,="" žalia-raudona="" ir="" raudona="" spalvos="" reiškia="" atitinkamai="" mažą,="" vidutinį="" ir="" didelį="" gausumą,="" n="7." kontrolė="" (apdorota="" įprastu="" fiziologiniu="" tirpalu="" 10="" ml/kg),="" ech(l)="" (apdorota="" ech="" 5="" mg/kg),="" ech(m)="" grupė="" (apdorota="" ech="" 20="" mg/kg),="" ech(h)="" (apdorota="" ech="" 80).="" mg/kg),="" tp="" (gydoma="" tp="" 15="">