Apsauginis naujojo Wenshen Shengjing nuoviro poveikis ciklosporino sukeltam testosterono sintezės ir spermatogeninės apoptozės sutrikimui
Mar 03, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN, XIYAN WANG, XUENAN WANG, WANSHENG ZHANG4, ZHANXUAN SUN1, XUAN XUAN LIANG, XUE ZHANG, WENJUN LI ir ZHIXIN LI
Abstraktus
Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti galimą apsauginį naujojo Wenshen Shengjing nuoviro (naujojo WSSJD; įskaitant Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ženšenį, Cynomorium soliariumą,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum ir Angelica Sinensis) dėl ciklosporino sukelto testosterono sintezės ir spermatogeninės apoptozės pelių pažeidimo. Iš viso 90 suaugusių Kunmingo pelių patinų buvo suskirstyti į šias 6 grupes: kontrolinė (be intervencijos), dimetilsulfoksidas (DMSO; gavo tik DMSO), ciklosporinas A (CSA), klomifeno citratas (CC; CsA ir CC, 15 mg/kg). per dieną), WSSJD (CsA plius WSSJD, neapdorotas vaistas 12 g/kg per dieną) ir naujas WSSJD (CsA plius naujas WSSJD, žalias vaistas 12 g/kg per dieną). Visos pelės buvo gydomos 30 dienų per burną. Vėliau sėklidės buvo fiksuotos ir nudažytos hematoksilinu ir eozinu, kad būtų galima įvertinti sėklinio epitelio vystymąsi. Imunohistocheminiai metodai buvo naudojami liuteinizuojančio hormono receptoriaus (LHR) ekspresijai ir P450 šoninės grandinės skilimui (P450scc) nustatyti sėklidžių Leydig ląstelėse. Be to, spermatogeninių ląstelių apoptozė sėklidėse buvo aptikta naudojant terminalinį deoksinukleotidiltransferazės sukeltą dUTP slapyvardžio žymėjimo testą, o srauto citometrija buvo naudojama spermos išgyvenamumui ir ankstyvai apoptozei prielipyje analizuoti. Palyginti su CsA ir CC grupėmis, naujas WSSJD vartojimas žymiai padidino testosterono kiekį serume ir LHR bei P450scc ekspresiją sėklidžių Leydig ląstelėse (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Įvadas
Ciklosporinas A (CSA) yra plačiai naudojamas imunosupresinis agentas, kuris specifiškai veikia T ląsteles ir slopina interleukino-2 sekreciją ir žymiai padidina kepenų, inkstų ir ragenos transplantacijų sėkmingumą bei išgyvenamumą. gavėjai (1-3). Tačiau imunosupresija, kurią sukelia ilgalaikis CsA vartojimas, žymiai padidina širdies ir kraujagyslių ligų, infekcijų ir piktybinių navikų riziką (4). Eid ir kt. (5) pranešė, kad spermos koncentracija ir judrumas buvo neigiamai koreliuojami su CsA koncentracija serume pacientams, kuriems persodintas inkstas, o tai rodo, kad CsA gali sukelti vyrų recipientų reprodukcinės sistemos disfunkciją. Be to, buvo dokumentuota, kad CsA gali būti atsakinga už sutrikusią spermatogenezę ir žalą vyrų reprodukcinei sistemai (6).
Ankstesni tyrimai parodė, kad CsA sumažino testosterono kiekį serume, paveikdamas testosterono biosintezę ir sekreciją sėklidėse. Jis ir kt. (7) pastebėjo, kad žiurkėms, kurios buvo gydomos 40 mg/kg per parą CsA, buvo žymiai didesnis liuteinizuojančio hormono (LH) kiekis ir žymiai mažesnis testosterono kiekis serume, todėl sutriko sėklidžių vystymasis. Ali ir kt. (8) pranešė, kad gydymas CsA sumažino LH receptorių (LHR) ekspresiją Leydig ląstelių membranoje, o tai vėliau sumažino LH sukeltą testosterono sintezę ir sekreciją iš Leydig ląstelių. Kitas Seethalakshmi ir kt. (9) atliktas tyrimas pranešė, kad CsA sumažino testosterono lygį, nes testosterono biosintezės metu slopino 17 alfa hidroksilazės aktyvumą ir konkurencinį 17 -hidroksisteroidų dehidrogenazės aktyvumą, o pagrindinė CsA slopinimo vieta buvo nutrauktas ciklinis adenozinas. monofosfato stimuliavimas. Be to, ši ataskaita parodė, kad CsA sukeltas sumažėjęs testosterono sekrecija Leydig ląstelėse tiesiogiai paveikė vyrų reprodukcinės sistemos vystymąsi ir reprodukcinių gebėjimų palaikymą. Seethalakshmi ir kt. (10) CsA gydytoms žiurkėms suleido egzogeninį testosteroną, kad padidintų endogeninio testosterono kiekį. Pastebėta, kad padidintos egzogeninio testosterono dozės reikšmingai atstato reprodukcinio organo svorį, folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) koncentraciją serume ir padidino lytinių ląstelių skaičių, o tai rodo, kad CsA sukeltam spermatogenezės sutrikimui iš dalies gali užkirsti kelią egzogeninis. testosterono skyrimas (10). Tačiau buvo nustatyta, kad egzogeninio testosterono nepakanka pažeistam sėklidžių audiniui atstatyti, nes testosterono sekrecijai ir spermatogenezei vis tiek turėjo įtakos CsA, o spermatozoidų ir spermatogeninių ląstelių apoptozės dažnis buvo didelis (10).
Wenshen Shengjing nuovirą (WSSJD) sudaro 15 vaistažolių, visų pirma Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ženšenis, Cynomorium soliariumas,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum ir Angelica Sinensis (11). Įrodyta, kad WSSJD palengvina ciklofosfamido sukeltą spermatogeninę apoptozę (11). Siekiant dar labiau pagerinti terapinį WSSJD poveikį, šiame tyrime buvo sukurtas naujas WSSJD, pagrįstas CsA sukelto sėklidžių audinio pažeidimo mechanizmu, koreguojant WSSJD komponentų dozę. Šiuolaikiniai farmakologiniai tyrimai parodė, kad rago aksomas sergant WSSJD gali veikti kaip lytinis hormonas (12); Radix Astragali gali pagerinti sėklidžių Sertoli ląstelių dauginimąsi ir aprūpinimą maistinėmis medžiagomis (13), o Panax ženšenis gali sumažinti sėklidžių hiperoksido kiekį ir slopinti spermatogeninę apoptozę (14). Aukščiau minėti vaistai taip pat gali pagerinti inkstų funkciją ir paskatinti spermatogeninių ląstelių vystymąsi (12-14). Ankstesniuose klinikiniuose tyrimuose buvo įrodyta, kad klomifeno citratas (CC) turi gydomąjį poveikį vyrų nevaisingumui (15, 16). Be to, CC buvo siejamas su pagerėjusiais testosterono ir spermos parametrais, o CC apsauginiai mechanizmai gali būti panašūs į WSSJD (15, 16). Be to, Wang ir kt. (17) tyrime CC buvo naudojamas kaip gydymo kontrolė, siekiant ištirti kinų medicinos Shengjing poveikį pelių spermatogenezės sutrikimams. Remiantis tuo, šiame tyrime CC buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė.
Šiame tyrime buvo ištirtas mechanizmas, kuriuo grindžiamas naujos WSSJD apsauginis poveikis sėklidžių audiniuose, siekiant nustatyti modifikuoto vaisto terapinį veiksmingumą. Apsauginio mechanizmo išaiškinimas gali būti pagrindas naudoti naują WSSJD, siekiant palengvinti CsA sukeltą spermatogeninį pažeidimą.
Cistanche deserticola poveikis: užkirsti keliąspermatogeninis pažeidimas
medžiagos ir metodai
Gyvūnai. Iš viso 90 Kunmingo pelių patinų (8-savaičių amžiaus; 35-40 g) pateikė Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, Kinija). Šis tyrimas buvo atliktas patvirtinus Jilin medicinos universiteto (Changchun, Kinija) etikos komitetui. Pelės buvo laikomos 21 ± 3 ° C temperatūroje ir 55–65 procentų santykinėje drėgmėje 12 valandų tamsios šviesos ciklo metu. Pelėms buvo suteikta nemokama prieiga prie standartinės laboratorinės pelių dietos ir sterilaus vandens.
WSSJD rengimas. 15 WSSJD kinų medicinos komponentų, įskaitant Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ženšenį, Cynomorium soliariumą,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum ir Angelica Sinensis (11), buvo įsigyti iš Tongrentang (Pekinas, Kinija). Šios medžiagos buvo išvirintos pagal tradicinį kiniško vaistinio nuoviro metodą (18). Trumpai tariant, ingredientai buvo pasverti pagal receptą ir iš viso įpilta 250 ml distiliuoto vandens, kad žolelės apsemtų. Žolelės mirkomos 30 min., o vėliau kaitinamos. Žolelės iš pradžių virinamos 10 min., o po to 20 min. sumažinama kaitra. Po 30 min pakaitinimo skystas nuoviras buvo atskirtas nuo žolelių, kurios toliau virinamos 200 ml distiliuoto vandens 80˚C temperatūroje dar 30 min. Šis procesas buvo pakartotas ir galutinis nuoviro skysčio tūris buvo filtruojamas per 4-5 marlės sluoksnius. Iš žolelių į filtruotą nuovirą taip pat buvo išspaustas skystis. Po to nuoviras buvo kaitinamas 80 °C temperatūroje vandens vonioje 6–7 valandas, kol koncentracija pasiekė 2 g žalio vaisto/ml, o nuoviras prieš naudojimą buvo laikomas 4 °C temperatūroje. naujas WSSJD buvo paruoštas remiantis WSSJD formule, šiek tiek pakoregavus Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali ir Epimedium brevicornum dozes. Išvalymo metodas buvo toks pat kaip ir WSSJD. naujas WSSJD, kurį sudaro: Panax ženšenis, 6 g; Cynomorium soliariumas, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola, 9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Plokščiastiebios pienės sėklos, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Didelė galvutė Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, ir Fructus Foeniculi, 3 g.
Neapdorotų vaistų ekstraktų koncentracijos buvo nustatytos taip: Nevalytos medžiagos masė/galutinis tūris. Šis skaičiavimo metodas plačiai naudojamas tiriant tradicinę kinų mediciną (19-21).Vaistų skyrimas. Pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į 6 grupes (15 pelių vienoje grupėje) ir joms buvo skiriamas vaistas į skrandį. Grupės buvo tokios: Kontrolė (normalus fiziologinis tirpalas); dimetilsulfoksidas (DMSO); CsA; CC; WSSJD; ir naujas WSSJD. Pelėms CsA, CC, WSSJD ir naujoms WSSJD grupėms 30 dienų buvo sušvirkšta 15 mg/kg per dieną CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, Kinija), kaip aprašyta anksčiau (8). ). Kontrolinės ir DMSO grupės pelėms per visą 30-dienos eksperimentinį laikotarpį buvo kasdien švirkščiama į veną su tokiu pat kiekiu normalaus fiziologinio tirpalo arba DMSO tirpiklio. Įprastu fiziologiniu tirpalu praskiesto DMSO koncentracija buvo 3,25 proc. (t/v). CC grupei buvo skiriama 21,6 mg/kg per dieną CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangdžou, Kinija), kaip aprašyta anksčiau (13), kuri taip pat buvo atskiesta 3,25 proc. (v/v) DMSO (pH{14}). }.2). Pelėms WSSJD ir naujoms WSSJD grupėms buvo skiriama atitinkamai 12 g neapdoroto vaisto / kg per dieną WSSJD ir naujo WSSJD.Dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E). Pelių sėklidės buvo paimtos ir nedelsiant fiksuotos 4 procentų paraformaldehidu (pH=7,2) kambario temperatūroje 24 valandas, po to dehidratacija etanoliu, apdorota ksilenu, kad būtų pašalintas etanolis, vaško įterpimas ir pjūvis. Histologiniai pjūviai (5 µm) buvo gauti naudojant sukamąjį mikrotomą. Jie buvo pritvirtinti prie stiklinių stiklelių H&E dažymui. Sėklidžių pjūviai buvo stebimi naudojant ryškią histopatologinę mikroskopiją, siekiant įvertinti sėklinių kanalėlių vystymąsi ir gauti histometrinius duomenis. Sėklinių kanalėlių išsivystymas buvo įvertintas naudojant Johnsen balų sistemą (22).
ELISA. 3 gydymo dieną 0 pelės buvo anestezuotos 10 procentų chloro hidratu (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) 0,004 ml/g kūno svorio ip prieš eutanaziją su CO2. Buvo paimtas kamieno kraujas, serumas atskirtas ir laikomas -20 °C temperatūroje. Trumpai tariant, kraujas buvo surinktas į 1,5 ml mėgintuvėlius ir per naktį laikomas 4 °C temperatūroje. Tada mėgintuvėlis buvo centrifuguojamas 1300 xg 4 °C temperatūroje 6 minutes ir serumas buvo surinktas. Testosterono (kat. Nr. EIA-2380) ir LH (kat. Nr. EIA-2385) kiekiui serume nustatyti buvo naudojami ELISA rinkiniai (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Šanchajus, Kinija). ) pagal gamintojo protokolą. Optinis tankis (OD) buvo nustatytas naudojant 680 modelio mikroplokštelių skaitytuvą (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, JAV), o testosterono ir LH lygiai buvo nustatyti pagal standartinę kreivę.
Imunohistochemija. Sėklidžių audiniai buvo fiksuoti 4 procentų formaldehidu kambario temperatūroje 24 valandas ir įterpti į parafiną. Parafino sekcijos buvo supjaustytos į 5 µm pjūvius ir vėliau nuvalytos. Antigenas buvo paimtas inkubuojant sekcijas 0.01 M citratiniame buferyje (pH=6.0) 95–98˚C temperatūroje 5 min. Vėliau sekcijos buvo užblokuotos 5 procentų galvijų serumo albuminu (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmštatas, Vokietija; A3675) kambario temperatūroje 1 val. Po blokavimo sekcijos buvo inkubuojamos su triušio polikloniniais antikūnais prieš LHR (kat. Nr. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) arba P450 šoninės grandinės skilimą (P450scc; kat. Nr. ab75497; Abcam, Cambridge, UK, Cambridge). ; 1:200) 4˚C temperatūroje per naktį tamsoje. Pagal gamintojo protokolą LHR ir P450scc ekspresijai nustatyti buvo naudojamas streptavidino-biotino komplekso (SABC) metodas, naudojant SABC rinkinį (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). Iš neigiamų kontrolinių pelių išskirtų audinių pirminis antikūnas buvo pakeistas PBS. LHR teigiamomis ląstelėmis buvo laikomos Leydig ląstelės, kurių membrana arba plazma nusidažė geltonai arba rudai. Iš kiekvieno mėginio buvo paimtos penkios skaidrės ir penki laukai Leydig audinių srityse buvo atrinkti atsitiktinai ir įvertinti fluorescenciniu mikroskopu (didinimas, x400). Vidutinis teigiamų ląstelių OD Leydig audinių srityse buvo gautas naudojant Image-Pro Plus 6.0 programinę įrangą (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, JAV). LHR ir P450scc ekspresijos buvo proporcingos OD reikšmėms, o didesnės OD reikšmės reiškia didesnę baltymų ekspresiją.
Terminalinės deoksinukleotidiltransferazės (TdT) tarpininkaujamos dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) tyrimas. Pelių sėklidės buvo išpjaustytos, įterptos į vašką ir padalintos. Tada pjūviai (5- µm storio) buvo nudažyti naudojant TUNEL tyrimo rinkinį (MK1024; Boster Biological Technology) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, kontrolinės (normalaus fiziologinio tirpalo), DMSO, CsA, CC, WSSJD ir naujų WSSJD grupių sėklidžių audiniai buvo nudažyti naudojant biotinu pažymėto digoksino antikūno 1:100 praskiedimą 30 minučių 37 °C temperatūroje. Dažytas žiurkės intersticinis epitelio audinys (pateiktas rinkinyje) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, o mėginiai, inkubuoti su PBS, o ne biotinu pažymėtu digoksino antikūnu, buvo naudojami kaip neigiama kontrolė. TUNEL teigiamų ląstelių, turinčių žalią branduolinį dažymą, dažnis buvo įvertintas naudojant lazerinį skenuojantį konfokalinį mikroskopą. Iš viso 10 atsitiktinių laukų buvo įvertinta dideliu padidinimu (x400) ir suskaičiuotos teigiamos ląstelės. Apskaičiuotas vidutinis teigiamų ląstelių skaičius viename lauke.
Propidžio jodido (PI) arba aneksino V-fluoresceino izotiocianato (FITC) dažymas ir srauto citometrinė analizė. Uodeginis prielipas buvo paimtas po to, kai buvo paaukota, o epidermis buvo perpjautas peiliuku, kad spermatozoidai iš prielipo išsiskirtų į 2 ml PBS 37 °C temperatūroje, kad būtų gautos prielipo suspensijos. Po to suspensijos buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 10 minučių, kad spermatozoidai galėtų išplaukti. Spermos agregacijos buvo išmestos, o likę spermos mėginiai buvo išskirti ir resuspenduojami PBS, kad būtų gauta 106 ląstelių/ml koncentracija. Spermos apoptozė buvo analizuojama naudojant aneksino V-FITC apoptozės aptikimo rinkinį (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nankinas, Kinija), pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, 1 ml spermos suspensijos buvo nudažyta 10 µl PI arba 500 µl surišimo buferio ir 5 µl aneksino V-FITC tamsoje 10 minučių kambario temperatūroje. Ląstelės buvo nedelsiant analizuojamos naudojant Epics XL srauto citometriją (Beckman Coulter, Inc.) ir naudojant TetraONE™ sistemą (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Ankstyvosiose apoptozės stadijose esančios ląstelės buvo identifikuotos naudojant aneksino V teigiamą dažymą, o nekrozinės ląstelės buvo identifikuotos pagal PI teigiamą dažymą.
Statistinė analizė. Duomenų analizė buvo atlikta naudojant SPSS 13.{1}} programinę įrangą (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) ir išreikšta kaip vidutinis pliusas arba ± standartinis nuokrypis, kaip nurodyta. Skirtumai tarp grupių buvo įvertinti dėl reikšmingumo naudojant vienpusę dispersijos analizę, po kurios buvo atliktas Tukey post hoc testas. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Rezultatai
Naujojo WSSJD poveikis sėklidžių sėklinių kanalėlių vystymuisi. Norint ištirti galimą naujojo WSSJD apsauginį poveikį pelių sėklidžių sėklinių kanalėlių vystymuisi, H&E dažytų pelių sėklidžių morfologija buvo palyginta naudojant šviesos mikroskopiją. CsA ir CC grupių pelių sėkliniuose kanalėliuose, palyginti su kontrole, susitraukė kanalėlių pakraštys, sumažėjo kanalėlių skersmenys ir sumažėjo sėklidžių sėklinio epitelio sluoksniai. Be to, spermatogeninės ląstelės išsidėstė netvarkingai, sumažėjo spermatogeninių ląstelių skaičius, o spindyje buvo matoma nedaug subrendusių spermatozoidų (1 pav.). Pelėms iš DMSO, WSSJD ir naujų WSSJD grupių buvo matoma daugiau sėklidžių sėklinio epitelio sluoksnių, o sėklinių kanalėlių pakraštys buvo integruotas be susitraukimo ar žlugimo (1 pav.). Johnseno balai reikšmingai nesiskyrė tarp DMSO grupės ir kontrolinių grupių arba tarp CC ir DMSO grupių. Tačiau Johnseno balas buvo reikšmingai sumažintas CsA grupėje ir WSSJD grupėje, palyginti su kontroline grupe, o WSSJD ir naujų WSSJD grupių balai buvo žymiai didesni, palyginti su CC arba CsA grupe (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Naujojo WSSJD poveikis serumo testosteronui ir LH. Vėliau buvo išmatuotas testosterono ir LH kiekis serume. Po DMSO vartojimo testosterono ir LH koncentracija serume nepakito. Priešingai, testosterono kiekis serume buvo žymiai sumažintas, o LH buvo žymiai padidintas CsA gydytų pelių, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Naujojo WSSJD poveikis LHR ir P450scc išraiškoms. P450scc ir LHR ekspresijos buvo įvertintos sėklidžių Leydig ląstelėse imunohistochemijos metodu (3 ir 4 pav.). Kontrolinėje grupėje LHR buvo išreikštas ant išorinių Leydig ląstelių membranų tarp sėklinių kanalėlių (3A pav.), o P450cc buvo išreikštas sėklidžių Leydig ląstelių citoplazmoje (4A pav.). Gydymas DMSO neturėjo reikšmingo poveikio LHR ir P450scc ekspresijai. Priešingai, gydymas CsA žymiai sumažino LHR ir P450scc ekspresiją, palyginti su kontrolinėmis pelėmis (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Naujojo WSSJD poveikis spermatogeninei ląstelių apoptozei. Spermatogeninių ląstelių apoptozė pelių sėklidėse buvo ištirta TUNEL tyrimu. Apoptotinių ląstelių branduoliai daugiausia buvo stebimi spermatogonijoje ir pirminiuose spermatocituose (5A pav.). Spermatogonijos yra didesnės už spermatocitus ir yra arčiau bazinės membranos (23). Gydymas DMSO neturėjo reikšmingos įtakos apoptotinių spermatogeninių ląstelių skaičiui sėklidėse. Priešingai, gydymas CsA žymiai padidino apoptozinių spermatogeninių ląstelių skaičių, palyginti su kontroline ir DMSO grupėmis (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Naujojo WSSJD poveikis spermos išgyvenimui ir ankstyvai apoptozei. Siekiant patikrinti naujo WSSJD apsauginį poveikį nuo CsA sukeltos spermatozoidų apoptozės, buvo nustatytas spermatozoidų išgyvenamumas ir ankstyva apoptozė prielipyje. Epididimo spermatozoidai buvo nudažyti PI arba aneksinu V ir analizuoti srauto citometrija (6 ir 7 pav.). Remiantis pirmiau minėtais rezultatais, gydymas CsA žymiai sumažino gyvų spermatozoidų procentą ir žymiai padidino ankstyvos apoptozinės spermos procentą (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Diskusija
Anksčiau buvo dokumentuota, kad ilgalaikis CsA, kaip imunosupresinės medžiagos, vartojimas turi įtakos reprodukciniam pajėgumui (6). Xu (24) pranešė, kad pacientų, gydytų CsA, spermos morfologija ir gyvybingumas buvo žymiai mažesni nei negydytoje grupėje, kaip pastebėta 26 inksto transplantacijos recipientų, gydytų įvairiomis CsA dozėmis, ir 12 sveikų savanorių spermos mėginiuose. Taip pat buvo pastebėta, kad CsA gydytų recipientų spermatozoidų galvos deformacijos dažnis buvo žymiai didesnis (24). Šie rezultatai rodo, kad CsA turėjo nuo dozės priklausomą poveikį spermos parametrams. Todėl būtina atlikti tyrimus, siekiant nustatyti naujus farmakologinius agentus, galinčius palengvinti CsA sukeltą sėklidžių pažeidimą ir pagerinti vyrų reprodukcinį gebėjimą po organų transplantacijos.
Specifinė sėklidžių mikroaplinka skatina spermatogenezę, todėl dėl sėklidžių struktūros ir funkcijos sutrikimo gali sustoti spermatogenezė (25). Monteiro ir kt. (26) Wistar žiurkes gydė CsA 15 mg/kg per parą doze 56 dienas ir pastebėjo, kad CsA gydytose žiurkėse padidėjo jungiamojo audinio tūrinė dalis ir sumažėjo Leydig ląstelių tūrinė dalis. Taip pat buvo pastebėta, kad CsA sukėlė sėklinio epitelio degeneraciją, dėl kurios atsirado Sertoli ląstelių vakuolizacija, nenormalios apvalios ir pailgos spermatidės bei likusios citoplazmos kaupimasis prie epitelio ribos, greta spindžio (26). Šiame tyrime Kunmingo pelės buvo gydomos 15 mg/kg CsA kasdien 30 dienų, dėl to sėklinių kanalėlių susitraukimas ir skersmuo, sėklinio epitelio sluoksnių sumažėjimas, netvarkingas sėklinių ląstelių išsidėstymas, subrendimo sumažėjimas. spermatozoidų spindyje ir žymiai sumažėjęs Johnsen balas.
Be to, gydant CsA, buvo labai pažeista sėklidžių struktūra. Šiame tyrime taip pat buvo įvertintas naujos WSSJD, kaip naujos kinų medicinos, apsauginis poveikis CsA gydytų pelių sėklidėms. Pastebėta, kad po gydymo nauju WSSJD buvo atstatyti sėklidžių sėklinio epitelio sluoksniai ir sėklinių ląstelių išsidėstymas. Be to, naujosios WSSJD grupės pelėms buvo integruoti sėkliniai kanalėliai be susitraukimo ar žlugimo ir jų Johnsen balas buvo žymiai didesnis, palyginti su CsA gydytų pelėmis. Šie rezultatai rodo, kad WSSJD reikšmingai atstatė CsA sukeltą sėklidžių pažeidimą, o tai rodo, kad šis vaistažolių junginys gali būti veiksmingas gydymas CsA sukelto sėklidžių pažeidimo prevencijai. Ar šis ląstelių atstatymas priklauso nuo epitelio nišos, taip pat yra svarbus klausimas, kurį reikėtų ištirti būsimuose tyrimuose.
Pagumburio-hipofizės-sėklidžių ašis atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant lytinių organų veiklą (27). Vyrų lytinių organų vystymąsi ir funkcionalumą reguliuoja hormonai iš pagumburio ir hipofizės (28). Krueger ir kt. (29) 6 dienas gydė Sprague Dawley žiurkes 25 mg/kg per dieną CsA arba 40 mg/kg per dieną CsA ir pastebėjo, kad LH ir FSH koncentracija serume padidėjo 2-4 kartus, o P450scc ekspresija. sumažėjo iki 30 procentų kontrolinėje grupėje. Be to, CsA gydytų pelių testosterono kiekis serume buvo žymiai sumažėjęs, todėl pablogėjo spermatogenezė (29). Šiame tyrime buvo įrodyta, kad gydymas CsA žymiai sumažino LHR ekspresiją Leydig ląstelėse. Nors LH serume padidėjo, sumažėjusi LHR ekspresija galėjo sutrikdyti LH sukeltą testosterono biosintezės atsigavimą ir sumažinti P450scc, kaip greitį ribojančio testosterono biosintezės fermento, ekspresiją (30), taip paveikdama testosterono biosintezę Leydig ląstelėse. Nauji naujojo WSSJD ingredientai, tokie kaip skraistės ragai, turi panašų poveikį kaip lytiniai hormonai (12), kurie gali pagerinti testosterono kiekį serume ir sumažinti LH kiekį serume, taip padidindami LHR ir p450scc ekspresiją Leydig ląstelėse. Pažymėtina, kad dabartiniai rezultatai parodė, kad naujasis WSSJD stimuliavo testosterono biosintezę ir sekreciją Leydig ląstelėse, kad skatintų spermatogenezę.
CSA sukeltas oksidacinis stresas ir sėklidžių pažeidimai sukelia spermatozoidų ir spermatogeninių ląstelių displaziją (31). Buvo pranešta, kad ilgalaikis gydymas CsA pažeidžia antioksidacinę sistemą gyvūnų sėklidžių audiniuose, todėl sumažėja glutationo, glutationo peroksidazės ir vandenilio peroksido kiekis bei padidėja malonio dialdehido kiekis sėklidėse (31). Todėl per didelis reaktyviųjų deguonies rūšių kiekis sėklidžių audiniuose negali būti pašalintas, o tai lemia spermatozoidų membranų lipidų peroksidaciją, DNR pažeidimą ir spermatozoidų gyvybingumo sumažėjimą. Šiame tyrime buvo pastebėta, kad gydymas CsA žymiai padidino DNR lūžimą ir spermatogeninių ląstelių apoptotinį greitį sėkliniuose kanalėliuose. Taip pat sumažėjo spermatozoidų išgyvenamumas prielipyje, o padidėjo ankstyvų apoptozinių spermatozoidų procentas, o tai rodo, kad sėklidžių spermatogeninis aktyvumas buvo žymiai pažeistas. Türk ir kt. (32) dokumentavo, kad apsauginis ellaginės rūgšties poveikis CsA sukeltam sėklidžių pažeidimui buvo susijęs su oksidaciniu stresu žiurkių patinams. Šiame tyrime naudojamame naujame WSSJD yra įvairių antioksidacinių komponentų, įskaitant vaistažolių preparatą Ženšenis, kuris anksčiau buvo įrodyta, kad žymiai sumažina hiperoksido kiekį sėklidėse (14).
Šiame tyrime buvo ištirtas naujojo WSSJD poveikis CsA sukeltam testosterono sintezės ir spermatogeninės apoptozės sutrikimui ir pastebėta, kad naujas WSSJD žymiai sumažino spermatogeninių ląstelių ir spermos apoptozės greitį ir taip pataisė sėklidžių sėklidžių pažeidimus. epitelis. Sėklidžių sėklinių kanalėlių morfologija ir spermatogeninių ląstelių bei spermatozoidų apoptozė buvo tiriama naudojant histochemiją ir tėkmės citometriją. Nors ląstelių ciklo pasiskirstymas ir kasdienė spermos gamyba nebuvo ištirti, jie bus būsimų mūsų grupės tyrimų dėmesio centre.
WSSJD žymiai padidino testosterono kiekį sėklidėse ir sumažino spermatogeninių ląstelių ir spermos apoptozę, kuri veiksmingai atstatė CsA sukeltą sėklidžių pažeidimą. Šie rezultatai rodo, kad naujasis WSSJD gali būti naudingas farmakologinis agentas gydant ir užkertant kelią CsA sukeltam sėklidžių pažeidimui.
Cistanche deserticola visos šaknys
Nuorodos
1. Pedersen M ir Seetharam A: Infekcijos po ortotopinės kepenų transplantacijos. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014 m.
2. Vora GK ir Ciolino JB: ragenos transplantato reakcija, susijusi su neokuliariniu uždegimu. Skaitmenis J Ophthalmol 20: 29–31, 2014 m.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P ir Pistorio ML: Psichopatologiniai inkstų transplantacijos aspektai: daugiadisciplininės komandos veiksmingumas. World J Transplant 4: 267-275, 2014 m.
4. El-Gowelli HM ir El-Mas MM: centrinis ciklosporino sukeltos hipertenzijos moduliavimas. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015 m.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA ir el-SaiedMA: nevaisingų inksto transplantacijos recipientų spermatozoidų judėjimo charakteristikų įvertinimas naudojant kompiuterinę analizę. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F ir Shalizar Jalali A: ciklosporino sukelto spermatozoidų pažeidimo ir embriotoksiškumo susilpninimas Crataegus monogyna vaisių vandeniniu ekstraktu. J 15 langelis: 198-205, 2013 m.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G ir Chen L: Ilgalaikis ciklosporino pavertimo rapamicinu poveikis sėklidžių funkcijai ir morfologijai žiurkės transplantacijos modelyje. Transplant Proc 45: 763-769, 2013 m.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM ir BelkahiaC: ciklosporino toksiškumo sėklidėms modelis: įvertinimas ir apsauga. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009 m.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB ir Menon M: ciklosporino veikimo mechanizmas slopinant testosterono biosintezę žiurkių Leydig ląstelėse in vitro. Transplantacija 53: 190-195, 1992 m.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA ir Menon M: Kiekybinis spermatogenezės palaikymas ciklosporinu gydytose žiurkėse, naudojant egzogeninį testosterono propionatą. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY ir Li ZX: „Wenshen Shengjing nuoviro“ poveikis ciklofosfamido sukeltai spermatogeninei ląstelių apoptozei ir histono H3K9 dimetilinimui. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (kinų k.).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R ir Tian SJ: lytinio hormono išgavimas iš rago aksomo su superkritiniu CO2. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (kinų k.).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC ir Tang F: Fructus Lycii ir Radix astragali poveikis Sertoli ląstelių funkcijai žiurkių sėklidėse. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (kinų k.).
14. Xu L, Liu XH ir Zhang L: bendro ginsenozidų kiekio poveikis NO, NOS ir bendram antideguonies pajėgumui pelės sėklidėse. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (kinų k.).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT ir Hotaling JM: Klomifeno citrato saugumas ir veiksmingumas hiperandrogeniniams ir nevaisingiems vyrams. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015 m.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A ir Abdelrahman S: Vitamino E ir klomifeno citrato derinys gydant pacientus, sergančius idiopatiniu oligo kaip azoospermija: perspektyvus atsitiktinių imčių tyrimas. Andrologija 3: 864-867, 2015 m.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH ir Zhang YX: Shengjing granulės: veiksmingas kinų vaistas nuo spermatogeninių sutrikimų pelėms. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (kinų k.).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (kinų kalba).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z ir LiD: Yiqi ir Yangyin formulė pagerina kraujodaros sistemos pažeidimą, kurį sukelia viso kūno švitinimas. J Radiat Res 58: 1-7, 2017 m.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T ir Makino T: Shin'iseihaito poveikis pelių alerginei reakcijai, kurią sukelia nosies jautrinimas. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015 m.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB ir Yang Y: Mahuang-xixin-fuzi nuoviras sumažina gripo viruso infekciją pelėms, turinčioms inkstų ir jang trūkumo sindromą. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016 m.
22. Johnsen SG: Sėklidžių biopsijos balų skaičiavimas – žmogaus sėklidžių spermatogenezės registravimo metodas: normalios vertės ir rezultatai 335 hipogonadiniams vyrams. Hormonai 1: 2-25, 1970 m.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD ir Singer-Sam J: spermatogonijų, spermatocitų ir apvalių spermatidų paruošimas genų ekspresijos analizei naudojant fluorescencijos aktyvuotą ląstelių rūšiavimą. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Ciklosporino A įtaka pacientų spermos parametrams po inkstų persodinimo. J Clin Urol 20: 603-605, 2005 m.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL ir Garde JJ: Be sėklidės dydžio: sezoninio veisimosi žinduolių spermatogenezės ir spermos savybių sąsajos. PLoS One 10: e0139240, 2015 m.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL ir Dolder H: Heteropterys aphrodisiaca infuzija sumažina šalutinį ciklosporino A poveikį sėklidėms. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008 m.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A ir Imura H: Sulpirido sukeltos lėtinės hiperprolaktinemijos įtaka normalių vyrų pagumburio-hipofizės-sėklidžių ašiai. Fertil Steril 44: 106-111, 1985 m.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR ir Romano MA: Wistar žiurkių bisfenolio A (BPA) poveikis suaugusiesiems pablogina spermos kokybę ir sutrinka. pagumburio-hipofizės-sėklidžių ašies. Toksikologija 329: 1-9, 2015 m.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM ir Maines MD: ciklosporino sukeltas liuteinizuojančio hormono receptorių slopinimas ir hemo biosintezė žiurkių sėklidėse: galimas testosterono kiekio serume sumažėjimo mechanizmas. Endokrinologija 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ ir Payne AH: Genotipas P450scc lokuse nulemia P450scc baltymo kiekio ir maksimalios testosterono gamybos skirtumus pelės Leydig ląstelėse. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A ir Ceribaşi AO: likopenas apsaugo nuo ciklosporino A sukelto toksiškumo žiurkių sėklidėms. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A ir Ateşşahin A: ciklosporino A sukeltų sėklidžių ir spermatozoidų pažeidimų, susijusių su oksidaciniu stresu, silpninimas ellago rūgštimi. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010 m.
