1 dalis: Verbascoside apsaugo kasos ląsteles nuo ER streso

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1 plius , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 ir Carla Perego 1,*

Santrauka:

Esminiai epidemiologiniai įrodymai rodo, kad dieta, kurioje gausu polifenolių, apsaugo nuo 2 tipo diabeto išsivystymo. Feniletanoidinis glikozidasverbaskozidas / akteozidas, plačiai paplitęs polifenolinis augalinis junginys, turi keletą biologinių savybių, įskaitant stiprią antioksidacinę, priešuždegiminę ir neuroprotekcinę veiklą. Šio tyrimo tikslas buvo patikrinti galimą poveikįverbascosidekasos ląstelėse – taikinys, kuris anksčiau nebuvo išbandytas. Pelės ir žmogaus ląstelės buvo inkubuojamos suverbascoside(0,8–16 uM) iki penkių dienų, o biocheminių ir vaizdo gavimo metodų derinys buvo naudojamas ląstelių išgyvenimui ir funkcijai įvertinti normaliomis arba endoplazminio tinklo (ER) stresą sukeliančiomis sąlygomis. Mes nustatėme nuo dozės priklausomą apsauginį poveikįverbascosideprieš oksidacinį stresą kloninėse ir žmogaus ląstelėse. Mechanistiniai tyrimai atskleidė, kad polifenolis apsaugo ląsteles nuo ER streso sukeltų disfunkcijų, moduliuodamas į baltymo kinazės RNR panašios endoplazminės tinklelio kinazės (PERK) šakos aktyvavimą išskleisto baltymo atsako ir skatindamas mitochondrijų dinamiką. Dėl to šiose ląstelėse buvo aptiktas padidėjęs gyvybingumas, mitochondrijų funkcija ir insulino kiekis. Šie tyrimai įrodo, kadverbascosidepadidina ląstelių gebėjimą susidoroti su ER stresu, kuris yra svarbus ląstelių disfunkcijos ir nepakankamumo veiksnys sergant diabetu, ir palaiko terapinį verbaskozido potencialą sergant diabetu.

Raktiniai žodžiai:

verbascoside; polifenoliai; insuliną gaminančios ląstelės; diabetas; UPR; oksidacinis stresas; ER-stresas; PERK; priešuždegiminis; mitochondrijos

1. Įvadas

Cukrinis diabetas yra lėtinė liga, kuria serga šimtai milijonų žmonių [1]. Skirtinga etiologija apibūdina 1 tipo (T1D) ir 2 tipo diabetą (T2D), kuriems būdingas insulino trūkumas [2]. Insulinas reguliuoja gliukozės koncentraciją plazmoje, stimuliuodamas gliukozės įsisavinimą raumenų ir riebalų ląstelėse bei moduliuodamas gliukozės metabolizmą kepenyse. Maistinių medžiagų prieinamumas, hormonai ir nervų įvestis reguliuoja kasos insulino sekreciją ir palaiko gliukozės koncentraciją kraujyje fiziologiniame diapazone [3–5]. Todėl ląstelių disfunkcija sukelia diabetą, kuriam būdinga hiperglikemija nevalgius.

T2D yra progresuojanti būklė, kai atsparumas insulinui ir ląstelių veikimo sutrikimai yra tarpusavyje susiję, o naujausi įrodymai padidino susidomėjimą svarbiu pirminiu ląstelių vaidmeniu hiperglikemijos būklei [6, 7]. Nutukusių asmenų, nesergančių diabetu, ląstelės kompensuoja atsparumą insulinui padidindamos hormono sekreciją. Tačiau kai kuriems asmenims, pablogėjus jų būklei, insulinemija sumažėja, o gliukozės kiekis pakyla iki hiperglikemijos [8, 9].

Gliukozė yra svarbiausias ląstelių funkcijų moduliatorius. Gliukozės stimuliacija veikia genų reguliavimą ir baltymų, dalyvaujančių daugelyje ląstelių funkcijų, tokių kaip glikolizė, insulino sintezė ir sekrecija, ekspresiją [10]. Gliukozės sukelta insulino sekrecija priklauso nuo oksidacinio metabolizmo, kad susidarytų adenozino trifosfatas (ATP), o fiziologiškai susidaro mažas reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kiekis. Tačiau ląstelės nėra labai gerai aprūpintos šalinančių fermentų ir dėl šio silpnumo jos labai jautrios oksidaciniam stresui [11,12]. Didėjant oksidaciniam stresui - ląstelėse mažėja insulino gamyba, o ląstelės gamina citokinus, kurie uždegimo ir apoptozės būdu uždega ląsteles [13]. Įdomu tai, kad nors sumažėjusi ląstelių masė anksčiau buvo siejama su ląstelių mirtimi, naujausi tyrimai rodo, kad svarbus ląstelių dediferenciacijos vaidmuo [14,15]. Paaiškėjo, kad keli etapai važiuoja į T2D. Metaboliniai ir oksidaciniai pažeidimai sukelia endoplazminio tinklo (ER) stresą, dėl kurio sulėtėja insulino sintezė ir sekrecija, citokinų išsiskyrimą lydi uždegiminiai procesai, o ląstelės gali netekti dėl apoptozės ir dediferenciacijos. Šios žinios yra būtinos norint sukurti tinkamas gydymo strategijas, nes oksidacinis stresas ir uždegimas gali būti neutralizuojami, o kasos ląstelių plastiškumas suteikia galimybę kamienines ląsteles paversti ląstelėmis, kaip įrodyta pelėms [16].

Pastaruoju metu ląstelių pažeidžiamumas oksidaciniam stresui sėkmingai paskatino naudoti dietinius antioksidantus, kad būtų išvengta diabeto [17]. Vienas įdomiausių antioksidacinių maisto produktų, alyvuogių aliejus dėl savo naudingų savybių buvo žinomas nuo senovės graikų. Alyvuogių aliejuje yra daug mononesočiųjų riebalų rūgščių (MUFA) ir kelių polifenolių, tokių kaip tirozolis, hidroksitirozolis, oleuropeinas ir verbaskozidas.

Verbascoside, dar žinomas kaip akteozidas, yra feniletanoido glikozidas, išgautas iš Olea europea, Verbascum rūšies augalų ir 23 kitų augalų šeimų [18–20]. Jis taip pat gali būti gaunamas iš alyvuogių aliejaus šalutinių produktų (jis yra praturtintas alyvuogių malūnų nuotekomis, gaunamomis perdirbant alyvuogių vaisius) arba gali būti gaunamas taikant medžiagų apykaitos inžinerijos ir sintetinės biologijos metodus [21].

Kol kas nėra duomenų apie verbaskozido biologinį prieinamumą žmonėms. Tyrimai, atlikti su pelėmis, SKBR3 ir Caco{1}} ląstelėmis, rodo, kad nemetabolizuotam verbaskozidui gali būti įmanoma pereiti žarnyno barjerą, cirkuliuoti kraujo plazmoje ir turėti antioksidacinį poveikį [20, 22, 23]. Skirtingai nuo daugelio augalų polifenolių, verbaskozidas daugiausia veikia ląsteles, moduliuodamas įvairių fermentų ir reguliuojančių faktorių genų transkripciją, sukeldamas antioksidacinį ir priešuždegiminį poveikį [24–30].

Nors žinoma daug naudingų verbaskozido poveikių žmonių sveikatai, duomenų apie jo poveikį kasos ląstelėms nėra. Kadangi oksidacinis stresas ir uždegimas yra T2D patogenezės pagrindas, ištyrėme, ar gydymas verbaskozidu gali pagerinti ląstelių gyvybingumą ir

funkcija ER stresą sukeliančiomis sąlygomis ir apibūdinome jo veikimo molekulinius mechanizmus. Mūsų duomenys rodo, kad verbaskozidas apsaugo nuo ląstelių oksidacinio streso ir uždegimo, moduliuodamas išsiskleidusio baltymo atsako aktyvavimą ir skatina mitochondrijų dinamiką, todėl padidėja ląstelių gyvybingumas ir padidėja insulino kiekis.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Ląstelių kultūra ir medžiagos

Pelės tc3 ląstelės (prof. Hanahan – Biochemijos ir biofizikos katedra, Kalifornijos universitetas, San Franciskas, CA [31]) buvo kultivuojamos terpėje RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italija), papildytas 10 procentų (t/v) termiškai inaktyvuoto veršelio vaisiaus serumo (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italija), 1 procento (t/v) penicilino-streptomicino (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italija) ir 1 procentą (t/v) L-glutamino (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italija). Žmogaus Langerhanso salelės buvo išskirtos Milane (Niguarda Ca' Granda) iš lavoninių daugelio organų donorų pagal Ricordi ir kt. aprašytą procedūrą. [32]; jie buvo auginami RPMI auginimo terpėje, kurioje yra 5,5 mmol/l gliukozės, 10 procentų termiškai inaktyvuoto galvijų vaisiaus serumo, 0,7 mM glutamino, 50 vienetų/ml penicilino ir 50 ug/ml streptomicino (EuroClone, SpA, Pero MI, Italija). Naudotas keturių skirtingų salelių preparatas, salelių grynumas 80 ± 10 proc. Salelių izoliaciją ir salelių tyrimus patvirtino Milano Niguarda Ca' Granda ligoninės etikos komitetas (2009 m. gruodžio 11 d.). tc3 ląstelės buvo apdorotos 0,8, 1,6 ir 16 uM verbaskozido (Carbosynth, OV08034, Compton, JK), kavos rūgštimi ir hidroksitirozoliu (prof. Dell'Agli, Farmakologijos ir biomolekulinių mokslų katedra, Universita degli Studi di Milano dovana). Milanas, Italija) pilnoje RPMI terpėje 5 dienas, o žmogaus salelės su 16 uM verbaskozido. Metanoliu / etanoliu apdorotos ląstelės buvo naudojamos kaip kontrolė. Siekiant sukelti oksidacinį stresą, ląstelės prieš analizę 20 min buvo apdorotos H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, JAV) pilnoje RPMI terpėje 20 min. ) buvo atliktas 7 valandas, kad būtų sukeltas ER stresas.

2.2. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu

Ląstelės buvo pasodintos į 96 kelių šulinėlių plokšteles ir praėjus penkioms dienoms po gydymo verbaskozidu jos buvo inkubuojamos su 0,5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazolas{{7}). }il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) (Sigma-Aldrich, M5655, Sent Luisas, MO, JAV) 4 valandas drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 proc. CO2, esant 37 oC temperatūrai. Po inkubacijos ląstelės buvo švelniai resuspenduojamos 100 ul DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italija), o absorbcija ties 540 nm buvo aptikta mikroplokštelių skaitytuvu (Benchmark, mikroplokštelių skaitytuvas, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, JAV) [33]. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais, o duomenys buvo išreikšti kaip dvigubas padidėjimas, palyginti su kontroliniais mėginiais.

2.3. Ląstelių žūties aptikimas srauto citometrija

Praėjus penkioms dienoms po inkubacijos su 16 uM verbaskozidu, -ląstelės buvo atskirtos 7 minutes inkubuojant su tripsinu/EDTA, surenkamos ir centrifuguojamos; granulės buvo švelniai resuspenduojamos fosfatiniame buferiniame druskos tirpale, kuriame mažai druskų. Ląstelės buvo nudažytos MuseTM skaičiaus ir gyvybingumo reagentu (Millipore, MCH100102, Burlington MA, JAV) pagal gamintojo protokolą ir analizuojamos naudojant srauto citometriją. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais, o duomenys buvo išreikšti kaip negyvų ląstelių procentas nuo bendro skaičiaus.

2.4. ROS karta

Intraląstelinis ROS buvo įvertintas naudojant DCFDA (2/,7/-dichlorofluoresceino diacetatą) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, JAV), pralaidų membraną zondą, kuris tampa fluorescencinis, kai yra prijungtas prie ROS [34]. tc3 ląstelės buvo iš anksto įdėtos 15 uM DCFDA Krebs-Ringer buferyje (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 ir 2 mM CaCl2).

papildyta 11 mM gliukozės 1 val. 37 oC temperatūroje. ROS kiekis buvo aptiktas 30 minučių tiek bazinėmis, tiek stresinėmis sąlygomis naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Šveicarija). Vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai buvo pagrįsti trimis nepriklausomais eksperimentais.

2.5. Western blotavimas

tc3 ląstelės buvo surinktos ir ištirpintos RIPA buferyje (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 proc. TERGITOLw NP40, 0,5 proc. deoksicholato), pridėjus aprotinino (Sigma Aldrich, St. A452). Louis, MO, JAV), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, JAV) ir Roche inhibitoriais (Sigma Aldrich, 5892953001, Sent Luisas, MO, JAV) 40 min 4 oC temperatūroje. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo tyrimu [35], naudojant Bradfordo reagentą (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, JAV), 30 ug baltymų buvo ištirpinti 10 procentų SDS-PAGE ir perkelti ant nitroceliuliozės membranų (Millipore, Burlington). MA, JAV). Pirminiai antikūnai buvo naudojami 2 valandas blokuojančiame buferyje su 5 procentų neriebaus pieno arba 5 procentų BSA tirpalais; buvo naudojami šie pirminiai antikūnai: pelės anti- -aktinas (Novus International Inc., NB600501, Sent Luisas, MO, JAV), pelių antiakroleinas (Abcam, ab48501, Kembridžas, JK), pelės anti-BIP (prof. Borgese Nica, Neurologijos institutas, CNR, Milanas, Italija), triušio anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, JAV), pelės anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc.) ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, JAV), triušio anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, JAV), pelės anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc.) ., 4814, Danvers, MA, JAV), triušio anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, JAV), triušio anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, JAV), avių anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), triušio anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, JAV), triušio anti-eIF2 (ląstelių signalizacijos technologija) Inc., 5324, Danvers, MA, JAV) ir triušio anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, JAV). Antriniai antikūnai, konjuguoti su HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, JAV), buvo naudojami praskiedimu 1:5000. Baltymai buvo aptikti naudojant ECL aptikimo sistemą (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italija) naudojant Odyssey Fc Image sistemą (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Vokietija), o juostos tankis buvo kiekybiškai įvertintas Image Studiow Lite programine įranga (LI). -COR Biosciences, Linkolnas, NE, JAV) [36]. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais, o duomenys buvo išreikšti kaip dvigubas padidėjimas, palyginti su kontroliniais mėginiais.

2.6. Mitochondrijų membranos potencialas

tc3 ląstelės ir žmogaus Langerhanso salelės buvo inkubuojamos su 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milanas, Italija) arba 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805 Italija), 3 min., 0 Camp 3 Milano. oC; Fluorescencijos intensyvumas buvo aptiktas mikroplokštelių skaitytuvu TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em, skirtas MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em, skirtas MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧, Mäcannite⑧ Group). Ląstelės buvo inkubuojamos su 500 uM H2O2 20 minučių, o fluorescencijos intensyvumas buvo nustatytas, kaip aprašyta anksčiau. Vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai buvo pagrįsti trimis skirtingais eksperimentais.

2.7. Mitochondrijų morfologija ir dinamika

tc3 ląstelės buvo iš anksto pakrautos 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milanas, Italija) 11 mM gliukozės Krebs-Ringer buferyje 37 oC temperatūroje 30 min. Mėginiai buvo patalpinti į vaizdo kamerą, o atsitiktiniai laukai buvo vaizduojami naudojant Axio Observer Z1 mikroskopo rodano filtrą (Zeiss, Oberkochen Vokietija). Norint įvertinti mitochondrijų morfologiją, naudojant ImageJ dalelių analizatoriaus programinę įrangą buvo išanalizuoti šie parametrai: plotas (um2), apskritimas (4mArea2/Perimeter2) ir didžiausias Feret skersmuo (um) [37].

Atliekant eksperimentus su laiko intervalu, vienos ląstelės vaizdavimas buvo atliekamas 1 kadru per sekundę 30 s kontroliuojamomis arba oksidacinio streso sąlygomis. Norint išmatuoti mitochondrijų kaupiamąjį atstumą (um2), vaizdai pirmiausia buvo pakoreguoti dėl nuotraukų balinimo, tada vaizdo įrašai buvo analizuojami naudojant esamą Image-Pro Plus įskiepį (objektų sekimą) (Media Cybernetics, Rockville, MD, JAV). Iki dvylikos

ląstelės buvo vaizduojamos trijuose nepriklausomuose eksperimentuose, o duomenys buvo pateikti kaip vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai.

2.8. Insulino sekrecija

Žmogaus išskirtos Langerhanso salelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelę, kurios tankis buvo 20 salelių vienoje duobutėje, o po 5 gydymo dienų insulino kiekis ir sekrecija buvo išmatuotas baziniame (3,3 mM gliukozės) ir stimuliuojamas (16,7 mM gliukozės). ) sąlygomis ELISA imunologiniu tyrimu (Mercodia, 10-1113-01, Upsala, Švedija).

2.9. Statistinės analizės

Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant „GraphPad Prism 8“.{1}} naudojant nepriklausomus biologinius pakartojimus. Dviejų grupių vidurkiai buvo įvertinti naudojant dvipusį Stjudento t testą, o p reikšmė < 0,05="" buvo="" laikoma="" statistinio="" reikšmingumo="" įrodymu.="" trijų="" ar="" daugiau="" grupių="" vidurkiai="" buvo="" lyginami="" dispersijos="" analize="" (anova),="" po="" to="" buvo="" atliktas="" daugkartinis="" post-hoc="" (tukey's)="" palyginimo="" testas.="" naudotas="" statistinis="" testas,="" tikslios="" p="" ​​reikšmės="" ir="" kopijų="" skaičius="" (n)="" nurodomi="" atskirose="" figūrų="" legendose.="" klaidų="" juostos="" paveiksluose="" rodo="" vidurkį="" ±="" sd="" arba="" vidurkį="" ±="" se,="" kaip="">

3. Rezultatai

3.1. Verbascoside pagerina ląstelių gyvybingumą

Kadangi nebuvo duomenų apie verbaskozido poveikį ląstelėms, atlikome MTT testą, kad įvertintume ląstelių gyvybingumą ir, kaip parodyta 1A paveiksle, buvo pastebėta teigiama nuo dozės priklausoma tendencija. Todėl tolesniems tyrimams pasirinkome 16 uM koncentraciją, kuri statistiškai buvo įrodyta veiksminga ląstelių gyvybingumui padidinti. Srauto citometrijos būdu ištyrėme penkių dienų verbaskozido inkubacijos poveikį ląstelių išgyvenimui bazinėmis sąlygomis ir po 2{21} } min pirminio apdorojimo 500 uM H2O2. Esant bazinei būklei, verbaskozidas neturėjo įtakos ląstelių išgyvenimui, o tai rodo, kad MTT tyrime pastebėtas padidėjęs ląstelių gyvybingumas gali būti dėl pagerėjusio mitochondrijų aktyvumo. Tuo tarpu po H2O2 poveikio 16 uM verbaskozido išankstinis apdorojimas žymiai sumažino oksidacinio streso sukeltą ląstelių mirtį (1B, C pav.). Verbaskozidas yra sudėtinga molekulė, kurią gali modifikuoti hidrolizuojantys fermentai [18]. Norint patikrinti, ar verbaskozido metabolitai gali būti atsakingi už pastebėtą apsauginį poveikį, tc3 ląstelės buvo apdorotos hidroksitirozoliu ir kafeino rūgštimis (0, 8 ir 16 uM) 5 dienas. Abu metabolitai nepadidino ląstelių gyvybingumo, priešingai, citotoksinis poveikis, reikšmingesnis po H2O2 poveikio, buvo aptiktas esant 16 uM koncentracijai (S1 pav.). Šis atradimas įrodo, kad verbaskozidas, o ne jo metabolitai, turi apsauginį poveikį H2O2 gydymui.

3.2. Verbascoside moduliuoja redokso homeostazę ir daro priešuždegiminį poveikį ląstelėse

Pirmiausia tc3 ląstelėse patvirtinome verbaskozido priešuždegiminį ir antioksidacinį poveikį, pastebėtą kitų tipų ląstelėse [24, 29, 34]. Verbaskozido ROS pašalinimo aktyvumas buvo įvertintas naudojant tc3 ląsteles, pažymėtas ROS specifiniu DCFDA (2/,7/-dichlorofluoresceino diacetato) ląstelių pralaidžiu zondu. Kaip parodyta 2A paveiksle, po pirminio apdorojimo verbaskozidu buvo nustatytas reikšmingas ROS kiekio sumažėjimas tiek bazinio, tiek oksidacinio streso sąlygomis.

Western blot analizė atskleidė reikšmingą oksidacinio streso žymenų akroleino ir 4-hidroksinonenalo (HNE) ekspresijos sumažėjimą verbaskozidu apdorotose ląstelėse. Be to, mes nustatėme, kad padidėjo superoksido dismutazės (SOD1) ekspresija, o tai rodo, kad verbaskozidas veikia savo antioksidacinį aktyvumą tikriausiai dviem skirtingais mechanizmais, tiesiogiai kaip ROS sugėriklis ir netiesiogiai sukeldamas antioksidantų fermentų ekspresiją (2B, C pav.).

Priešuždegiminis verbaskozido poveikis ląstelėms buvo įvertintas įvertinus NFKB kelio, svarbiausio priešuždegiminio kelio šiose ląstelėse, aktyvavimą [38]. Atlikdami Western blot analizę nustatėme sumažėjusią branduolinio faktoriaus kappa B (IKB ) ir branduolinio faktoriaus kappa lengvosios grandinės stipriklio (NFKB) inhibitorių ekspresiją ir reikšmingą NFKB fosforilinimo sumažėjimą iš anksto apdorotose ląstelėse, patvirtinančius hipotezę verbascoside veiksmingumas mažinant ląstelių uždegimą (2D, E pav.).

3.3. Verbascoside moduliuoja ląstelių baltymų atsaką

Tada nuodugniai išanalizavome molekulinį mechanizmą, kuriuo verbaskozidas atlieka antioksidacinį ir priešuždegiminį vaidmenį, daugiausia dėmesio skirdami endoplazminiam tinklui, kuris atsiranda kaip pagrindinis metabolinių ir streso signalų jutiklis ląstelėse. Esant streso sąlygoms, organelės sukelia homeostatinį atsaką, žinomą kaip išsiskleidusio baltymo atsakas (UPR), kuriuo siekiama atkurti ER funkciją; tačiau per didelis šio kelio aktyvavimas sukelia apoptozę [39,40].

Padidėjusio ER streso žymenys yra chaperonų baltymų reguliavimas ir UPR atsako aktyvinimas. Verbaskozidu apdorotų ląstelių Western blot analizė atskleidė sumažėjusį dviejų chaperoninų šilumos šoko baltymo 70 (HSP70) ir jungiamojo imunoglobulino baltymo (BIP) kiekį (3A, B pav.). Be to, buvo aptiktas reikšmingas baltymo kinazės RNR tipo ER kinazės (PERK) ekspresijos sumažėjimas ir sumažėjęs jos pasroviui priklausančio efektoriaus, eukariotinės transliacijos iniciacijos faktoriaus 2 (eIF2), fosforilinimas.

Spustelėkite čia, kad pamatytumėte 2 dalį