DALISⅠ: naujas apsauginis cistanche tubulosa ekstrakto poveikis nuo mažo ryškumo mėlynos šviesos sukeltos degeneracinės retinopatijos
Mar 04, 2022
Susisiekite: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
Farmacijos mokykla, Farmacijos kolegija, Taipėjaus medicinos universitetas, Taipėjus, Oftalmologijos katedra, Taipėjaus medicinos universitetas, Taipėjus, Farmakologijos katedra, Medicinos mokykla, Medicinos kolegija, Taipėjaus medicinos universitetas, Taipėjus, Medicinos mokslų instituto absolventas Medicina, Taipėjaus medicinos universitetas, Taipėjus, Ph.D. Biotechnologijų tyrimų ir plėtros programa, Taipėjaus medicinos universiteto Farmacijos koledžas, Taipėjus, Taivanas
Abstraktus
Fonas / tikslai:Mėlynos šviesos diodo šviesos (BLL) sukeltas fototoksiškumas vaidina svarbų vaidmenį sergant akių ligomis ir sukelia tinklainės degeneraciją bei apoptozę žmogaus tinklainės pigmento epitelio (RPE) ląstelėse.Cistanche tubulosa ekstraktas (CTE)yra tradicinė kinų medicina, turinti daug naudingų apsauginių savybių; tačiau keliuose tyrimuose buvo ištirtas akių apsauginis CTE vaidmuo. Šiame tyrime ištyrėme mechanizmus, kuriais grindžiamas CTE poveikis BLL sukeltai apoptozei in vitro ir in vivo. Metodai: RPE ląstelės buvo naudojamos dabartiniame in vitro tyrime, o ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,{{6} }difeniltetrazolio bromido tyrimas. Su apoptoze susijusi baltymų ekspresija buvo nustatyta Western blot analize ir imunofluorescenciniu dažymu. Rudos Norvegijos žiurkės buvo naudojamos tiriant komerciškai prieinamą BLL poveikį in vivo. Tinklainės morfologinei deformacijai ištirti buvo naudojamas hematoksilino ir eozino dažymas, terminalo deoksinukleotidilo transferazės dUTP slapyvardžio žymėjimas (TUNEL) ir Western blot tyrimai. Rezultatai: CTE reikšmingai slopino vandenilio peroksido, tretbutilo hidroperoksido, natrio azido ir BLL sukeltą RPE žalą. Be to, CTE sumažino apoptotinių žymenų, tokių kaip suskaidyta kaspazė-3 ir TUNEL dažymas, ekspresiją po BLL poveikio, inaktyvuodama apoptotinius kelius, kaip rodo imunofluorescencinis dažymas. Be to, CTE slopino BLL sukeltą c-Jun N-galinės kinazės, papildomų su signalu susijusių kinazių 1/2 ir p38 fosforilinimą RPE ląstelėse. In vivo peroralinis CTE išgelbėjo 60-dieną periodiškai dėl BLL poveikio sukeltą tinklainės storio sumažėjimą ir sumažino TUNEL teigiamų ląstelių skaičių rudos Norvegijos žiurkės modelyje. Išvada: CTE yra galimas profilaktinis agentas prieš BLL sukeltą fototoksiškumą
Įvadas
Su amžiumi susijusios geltonosios dėmės degeneracijos (AMD) tyrimai parodė, kad šia liga serga 8,7 proc. pasaulio gyventojų [1]. AMD yra neurodegeneracinė liga, kuri sukelia fotoreceptorių deformaciją, tinklainės pigmento epitelio (RPE) atrofiją, ganglioninių ląstelių apoptozę ir centrinio regėjimo praradimą vyresnio amžiaus žmonėms, ir tampa pasauline socialine našta. AMD skirstomas į sausą arba šlapią formą [2, 3]. Tobulėjus technologijoms, žmonės daugiau laiko praleidžia naudodamiesi šiuolaikiniais skaitmeniniais įrenginiais, todėl žmonės ilgą laiką yra veikiami mėlynos šviesos (BL). Tačiau BL sukelto fototoksiškumo tinklainėje klausimas nėra gerai ištirtas. Dėl per didelio trumpo bangos ilgio BL (450–495 nm) susidaro reaktyviosios deguonies rūšys (ROS), tokios kaip superoksido ir hidroksilo radikalai, dėl kurių padidėja deguonies suvartojimas ir pažeidžiama mitochondrijų DNR. ROS kaupimasis sukelia oksidacinį stresą ir didelį retinoidų aduktų kaupimąsi, kurie dar labiau pažeidžia tinklainę [4]. Tyrimai parodė, kad oksidacinis stresas yra pagrindinis sausos AMD patogenezės veiksnys [5]. Be to, BL švitinimas sumažina tinklainės antioksidantų fermentų, tokių kaip superoksido dismutazė ir katalazės, ekspresiją, nes tarpininkauja Bax/Bcl-2 baltymų sąveikai ir skatina endogeninę ROS gamybą. Taigi RPE ląstelės ir fotoreceptorių išorinio segmento mitochondrijos kenčia nuo BL švitinimo sukeltos žalos [6, 7]. Be ROS generavimo, BL švitinimas aktyvina mitogeno aktyvuotas baltymų kinazes (MAPK), kurios vaidina svarbų vaidmenį ląstelių išgyvenime ir apoptozėje. nuo mitochondrijų priklausomi su apoptoze susiję proapoptoziniai baltymai, tokie kaip Bax ir kaspazė -3, aktyvuojami švitinant BL spinduliuojančiu šviesos diodu (BLL) per c-Jun N-galo kinazę (JNK) ir p38 kelius. RPE ir tinklainės ganglioninės ląstelės [8]. Be to, fosfatidilinozitolio 3-kinazė (PI3K)/Akt ir branduolinio faktoriaus eritroidinis 2-susijęs su 2 faktoriumi (Nrf2) priklausomi antioksidaciniai keliai yra RPE ląstelių gynybinės sistemos komponentai [{{34} }].
Cistanche tubulosa ekstraktas (CTE)sudėtyje yra feniletanoido glikozido darinių ir dešimtmečius buvo naudojamas kaip tradicinė kinų medicina. Echinakozidas, akteozidas ir izoakteozidas yra trys pagrindiniai aktyvūs CTE junginiai, pasižymintys neuroprotekcinėmis, atmintį gerinančiomis, imuninę sistemą reguliuojančiomis ir prieš kepenų fibrozę stabdančiomis savybėmis [13, 14]. Echinakozidas yra ROS šaliklis ir apsaugo nuo 1-metil-4-fenilpiridinio jonų (MPP plius) sukeltos apoptozės Parkinsono ligos gyvūnų modeliuose [15, 16]. Akteozidas apsaugo nuo amiloido{10}}sukeliamo neurotoksiškumo ir mažina lipopolisacharidų sukeltą uždegimą, susijusį su Nrf2 perkėlimu iš citoplazmos į branduolį ir prisijungimo prie antioksidantų atsako elementų. Šiuo metu prieinami šlapiojo AMD gydymo būdai, tokie kaip pegaptanibas, ranibizumabas, bevacizumabas ir afliberceptas, naudojami pernelyg didelei angiogenezei slopinti [17, 18]. Tačiau nėra veiksmingų sausos AMD gydymo būdų, nes yra daugybė patologinių šios ligos komplikacijų.
Šiame tyrime demonstruojame apsauginį CTE poveikį RPE ląstelėse ir Brown Norway (BN) žiurkėms. Be to, mes taikėme ilgalaikį mažo skaisčio BLL poveikį tiek in vitro, tiek in vivo modeliams, kad įvertintume apsauginį CTE poveikį. Mes nustatėme, kad CTE sumažino su apoptoze susijusių baltymų ekspresiją po BLL poveikio. Be to, CTE sumažino galinių deoksinukleotidiltransferazės dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) teigiamų ląstelių skaičių BN žiurkių tinklainėje po ilgalaikio mažo skaisčio BLL poveikio. Šis tyrimas suteikia papildomų įžvalgų apie naujus anti-apoptotinius CTE poveikius ir informaciją apie naują tinklainės degeneracijos gydymo strategiją.
Cistanche tubulosa ekstraktas (CTE): feniletanoido glikozidas
Medžiagos ir metodai
Chemikalai ir produktai
CTE dosniai suteikė „Sinphar Pharmaceutical Company“ (Jilanas, Taivanas). In situ ląstelių mirties aptikimo rinkiniai (kat. Nr. 11-684-817-910) buvo įsigyti iš Roche (Manheimas, Vokietija).
RPE ląstelių kultūra
RPE ląstelės (ARPE{{0}} ir ATCC® CRL-2302™) buvo įsigytos iš American Type Culture Collection (Manassas, VA) ir kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (Gibco, Grand Island, NY) papildytas 10 procentų galvijų vaisiaus serumu drėgnoje atmosferoje su 5 procentais CO2 37 laipsnių temperatūroje. ARPE-19 ląstelės per 19–30 buvo palaikomos 10-cm ląstelių kultūros induose (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgija). Po 0,05% tripsino-etilendiamino tetraacto rūgšties (Gibco) ląstelės buvo persodintos santykiu 1:4. Prieš bandymą ARPE-19 ląstelės buvo pasėtos į 48-šulinėlių plokšteles (Orange Scientific) ląstelių gyvybingumui tirti, esant 1,0 × 105 ląstelių/ml tankiui, ir ant 6-cm lėkštelių (Orange Scientific). ) Western blot analizėms esant 2, 0 × 105 ląstelių / ml tankiui 24 valandas. Kai ARPE-19 ląstelės pasiekė 80 procentų susiliejimą, buvo atlikti šie eksperimentai.
Gydymas vaistais ir ląstelių gyvybingumo tyrimas
RPE ląstelės per 19–30 buvo pasėtos į 48-šulinėlių plokšteles ir 24 valandas kartu apdorojamos skirtingomis koncentracijomis CTE, vandenilio peroksidu (H2O2), tret-butilo hidroperoksidu (t-BHP) ir natrio azidu ( NaN3). Tada ląstelės buvo kultivuojamos su 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromidu (MTT), kurios galutinė koncentracija buvo 1 mg /mL ir inkubuojamas 30 min. Tada į kiekvieną šulinėlį įpilama dimetilsulfoksido (200 µL), kad ištirptų ląstelės. Absorbcija buvo matuojama esant 570 nm, naudojant Sunrise™ spektrofotometro su fermentu susietą imunosorbento tyrimo skaitytuvą (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Vertės buvo pataisytos atsižvelgiant į fono absorbciją, atėmus atitinkamus tuščius laukelius. Duomenys gauti iš penkių nepriklausomų tyrimų.
In vitro BL poveikio protokolas
Šviesos šaltinis ir ląstelių plokštės buvo išdėstytos 25 cm atstumu, kaip aprašyta ankstesniame tyrime [19]. Šviesumas buvo matuojamas šviesos matuokliu (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipėjus, Taivanas). Priklausomai nuo eksperimento plano, BLL didžiausias buvo 46 0 nm (60 liuksų) nurodytą laiką (0–48 val.).
Western blotingas
Po 0–48-h bendro apdorojimo CTE ir BLL poveikiu ląstelės du kartus plaunamos lediniu fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) ir resuspenduojamos radioimunoprecipitacijos tyrimo lizės buferyje (1 proc. Nonidet). P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM etilenglikolio-bis(-aminoetileterio)-N,N,N′,N′-tetraacto rūgšties, 1 mM NaF ir proteazės/fosfatazės inhibitorių kokteilis). Ląstelių lizatas buvo gautas centrifuguojant 12, 000 × g 35 min., o supernatantas buvo surinktas, kad būtų nustatyta baltymų koncentracija naudojant Bradfordo reagentą (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Vienodas kiekis baltymų mėginių buvo atskirtas 10–12 procentų natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze ir po to perkeltas ant polivinilideno difluorido membranos. Po to, kai membrana buvo užblokuota 5 procentų neriebiu pienu ir 1 valandą inkubuojama Tris buferiniame fiziologiniame tirpale su Tween 20 (TBST), buvo atliktas imunoblotingas su pirminiais antikūnais, specifiniais skilusiai kaspazei -3, fosfo-JNK, JNK. , fosfo-p38, p38, su fosfo-ekstraląsteliniu signalu susijusi kinazė (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, su Fas susijęs baltymas su mirties domenu (FADD), kaspazė-8 (GeneTex, Irvine) , CA), Fas ligandu (Abcam, Kembridžas, JK) ir b-aktinu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Tada blotai buvo inkubuojami su krienų peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais (1:6000 TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 1 valandą kambario temperatūroje. Naudojant patobulintą chemiliuminescencijos rinkinį (Millipore, Billerica, MA), kiekvienos dėmės juostų intensyvumas buvo analizuojamas naudojant Image J programinę įrangą, normalizavus iki b-aktino.
Imunofluorescencija
RPE ląstelės buvo fiksuotos 4 procentų paraformaldehidu PBS 15 minučių. Tada į ląsteles 15 min buvo pridėta Triton X-100 PBS (0,2 proc.), po to 30 min. buvo pridėta 5 proc. galvijų vaisiaus serumo PBS; po to ląstelės 24 valandas buvo inkubuojamos su antikūnu prieš skilimą kaspazės -3 santykiu 1:250 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Ožkos anti-triušio IgG antrinis antikūnas (Dylight 594) buvo naudojamas santykiu 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ląstelių branduoliai buvo nudažyti 4′-6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Fluorescencijos pokyčiai buvo stebimi naudojant lazerinę CS SP5 konfokalinio spektrinio mikroskopo vaizdavimo sistemą (Leica, Teban Gardens, Singapūras).
TUNEL dažymas
DNR fragmentai, kuriuos galima aptikti TUNEL tyrimu, yra reikšmingas apoptozės požymis. Apoptozės užprogramuotai RPE ląstelių žūčiai pagal gamintojo protokolą išmatuoti naudojome In situ ląstelių mirties aptikimo rinkinį (kat. Nr. 11-684-817-910; Roche). Trumpai tariant, mes fiksavome RPE ląsteles 4 procentų paraformaldehidu ir pažymėjome DNR grandinės pertraukas fermentinėje reakcijoje, kad aptiktume TUNEL teigiamas ląsteles, kurios buvo su žaliai fluorescencine dėme. Tada nudažytos ląstelės buvo nuskaitytos ir analizuojamos naudojant „Tissue FAXS-plus“ vaizdo gavimo sistemą („TissueGnostics“, Viena, Austrija). Apribotame RPE regione buvo suskaičiuota dešimt tūkstančių įvykių, o TUNEL teigiamų ląstelių skaičiaus vaizdus išanalizavome naudodami „TissueQuest“ / „HistoQuest“ programinę įrangą („TissueGnostics“).
Eksperimentai su gyvūnais
BN žiurkių patinai (300–350 g kūno svorio) buvo įsigyti iš Nacionalinio laboratorinių gyvūnų centro (Taipėjus, Taivanas) ir laikomi 2–3 mėnesius. Žiurkės buvo laikomos 12-h/12-h šviesos/tamsos ciklu esant 26 ± 1 laipsniui, 35–47 procentų santykinės drėgmės santykiui ir ad libitum prieiga prie vandens ir maisto. Neapdorotos žiurkės buvo laikomos tamsoje, kad būtų naudojamos kaip kontrolinės. Tyrimo protokolus patvirtino Taipėjaus medicinos universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros komitetas (patvirtinimo numeris: LAC{10}}). Visos eksperimentinės procedūros, susijusios su gyvūnų naudojimu, atitiko Regos ir oftalmologijos tyrimų asociacijos pareiškimus dėl gyvūnų naudojimo atliekant oftalmologinius ir regos eksperimentinius tyrimus.
BLL sukeltas tinklainės degeneracijos žiurkės modelis
Naudojome periodinį mažo ryškumo ilgalaikį BLL poveikio sukeltą tinklainės degeneracijos modelį, kaip aprašyta ankstesniame tyrime [19]. Trumpai tariant, BN žiurkės buvo suskirstytos į tris grupes: kontrolinę grupę, kuri buvo laikoma tamsiomis sąlygomis; BLL paveikta grupė, kuri buvo periodiškai veikiama BLL tamsoje be vyzdžio išsiplėtimo (460 nm, 150 liuksų) 3 valandas per dieną 60 dienų; ir CTE gydyta ir BLL paveikta grupė, kuri buvo iš anksto gydoma CTE (100 mg/kg kūno svorio) 14 dienų, o po to kartu buvo gydoma periodiškai veikiant BLL 3 valandas per dieną 60 dienų. Visos žiurkės buvo grąžintos į gyvūnų kolonijas ir eksperimentinio laikotarpio pabaigoje buvo atnaujintas normalus šviesos / tamsos ciklas (250 liuksų, 12 val. / 12 val.).
Statistinė analizė
Reikšmingi skirtumai buvo apskaičiuoti naudojant vienpusę dispersijos analizę, po kurios buvo atliktas Tukey post hoc testas ir kelių palyginimų testas. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas pagal p-reikšmes<>
Cistanche tubulosa produktai
Rezultatai
CTE apsaugo RPE ląsteles nuo oksidacinio streso pažeidimo
Norint įvertinti CTE citotoksiškumą naudojant MTT tyrimą, RPE ląstelėms buvo pritaikytos kelios CTE koncentracijos ({{{20}}}–500 ug/mL). CTE gydymas neturėjo akivaizdaus toksinio poveikio RPE ląstelių gyvybingumui esant nė vienai iš tirtų koncentracijų (1A pav.). Todėl tolesniuose eksperimentuose buvo naudojami 50 ir 100 ug/mL CTE. Norint ištirti anti-apoptotinį CTE poveikį, skirtingi oksidaciniai induktoriai (H2O2, t-BHP ir NaN3) buvo skiriami kartu su CTE RPE ląstelėms 24 valandas. H2O2, NaN3 ir t-BHP sumažino ląstelių gyvybingumą ir pakenkė RPE ląsteles priklausomai nuo dozės (nubrauktos juostos, 1B, 1C ir 1D pav.); ląstelių gyvybingumas buvo žymiai mažesnis ląstelėse, apdorotose 0,03 mM H2O2, 0,3 mM NaN3 ir 0,3 mM t-BHP, nei kontrolinėje grupėje.
Tačiau bendras gydymas 50 ir 100 ug/mL CTE susilpnino H2O2-, NaN3- ir t-BHP sukeltą RPE ląstelių pažeidimą ir pakeitė ląstelių gyvybingumo sumažėjimą (juodos juostos, 1 pav. 1B, 1C ir 1D). Pirmiau pateikti duomenys rodo, kad CTE gelbsti RPE ląsteles nuo oksidacinio streso pažeidimo.
CTE slopina BLL sukeltą RPE ląstelių mirtį
Ankstesniame tyrime nustatėme, kad BLL yra citotoksiškas RPE ląstelėms, o tai buvo siejama su Bcl{0}} ir Bax ekspresijos pokyčiais. Šiame tyrime toliau nagrinėjome apsauginį CTE poveikį BLL sukeltam RPE ląstelių pažeidimui. Į ląstelių kultūros inkubatorių įdėjome dvi mėlynas elektrines LED plokštes. Atstumas tarp šviesos šaltinio ir ląstelių plokščių buvo 25 cm, o BLL intensyvumas buvo 60 liuksų, matuojant šviesos matuokliu (2A pav.). MTT tyrimas parodė, kad BLL poveikis skirtingais laikotarpiais (6–48 val.) sukėlė RPE ląstelių mirtį priklausomai nuo laiko (2B pav.). BLL sukeltas ląstelių gyvybingumo sumažėjimas po 24 ir 48 valandų buvo žymiai susilpnėjęs, kai ląstelės buvo kartu apdorotos CTE (100 ug/ml) (2C pav.). Šie duomenys rodo, kad CTE apsaugo RPE ląsteles nuo BLL sukelto fototoksiškumo.
CTE slopina BLL sukeltą apoptozę RPE ląstelėse, reguliuodamas Bcl-2/Bax ir Fas/FasL kelius
Remdamiesi galimu apsauginiu CTE poveikiu RPE ląstelėse, toliau tyrėme galimą CTE dalyvavimą šiame procese. Buvo ištirti du apoptoziniai signalizacijos keliai, ty Bax/Bcl{{0}} ir Fas/Fas ligandų (FasL) keliai ir susiję baltymai (pvz., pro-kaspazė-8 ir pro-kaspazė -3; 3A ir 3B pav.). Nustatyta, kad BILL ekspozicija (6–48 val.) padidina Bax/Bcl-2, FasL ir FADD baltymų ekspresiją priklausomai nuo laiko (3A pav.). Be to, BLL sumažino prokaspazės-3 ir prokaspazės-8 baltymų ekspresiją, todėl po BLL poveikio atsiranda daugiau kaspazės-3 ir kaspazės-8 skilimo formų, o tai atitinka mūsų ankstesnis tyrimas [19]. Siekiant toliau įvertinti apsauginį CTE poveikį, skirtingos koncentracijos CTE buvo taikomos BLL paveiktoms RPE ląstelėms (3B pav.). Po 48-h BLL poveikio CTE (50 µg/mL) sumažino Bax/Bcl-2 santykį. Be to, CTE (100 µg/mL) sumažino FasL ir FADD baltymų ekspresiją, bet žymiai padidino prokaspazės-8 ir prokaspazės-3 kiekį (1 pav.). 3C ir 3D). Tyrimai parodė, kad kaspazės -3 aktyvacija yra RPE ląstelių apoptozės žymuo [20]. Siekdami toliau patvirtinti apsauginį CTE poveikį, atlikome imunofluorescencinį suskaidytos kaspazės dažymą-3. Nustatyta, kad BILL ekspozicija 48 valandas sukelia kaspazės -3 skilimą ir perkėlimą į branduolį, dėl kurio atsiranda RPE ląstelių apoptozė (geltonos rodyklės, 4A pav.). Tačiau kai BLL paveiktos ląstelės buvo kartu apdorojamos CTE (100 µg/mL), BLL sukelta skaldomos kaspazės -3 ekspresija buvo slopinama. Norėdami geriau suprasti anti-apoptotinį CTE poveikį, mes panaudojome TUNEL dažymą, kad aptiktume DNR fragmentus RPE ląstelėse. Po 48-h BLL poveikio TUNEL teigiamų ląstelių skaičius padidėjo nuo 1,78 ± 0,36 proc. iki 23,82 ± 0,33 proc.; šis poveikis susilpnėjo kartu gydant CTE (nuo 23,82 ± 0,33 proc. iki 2,22 ± 0,11 proc.; 4B, 4C ir 4D pav.). Šie rezultatai rodo, kad gydymas CTE stipriai apsaugo RPE ląsteles nuo BLL sukeltos apoptozės, tarpininkaudamas Bax/Bcl-2 ir FasL/FADD keliams.
CTE slopina BLL sukeltą streso atsako baltymų fosforilinimą RPE ląstelėse
Ankstesni tyrimai parodė, kad MAPK keliai, tokie kaip ERK, JNK ir p38 MAP, aktyvuojami RPE ląstelėse ir tinklainėje po ultravioletinių spindulių arba BL poveikio [21, 22]. Taigi, norint ištirti reguliuojamąjį CTE poveikį MAPK atsako į stresą keliui po BLL poveikio, 100 µg/mL CTE buvo pritaikyta RPE ląstelėms esant skirtingam BLL poveikio laikui (5A pav.). Western blot analizė parodė, kad fosforilinti ERK, JNK ir p38 buvo aktyvuoti po BLL poveikio, tačiau reikšmingai slopinami kartu apdorojant CTE RPE ląstelėse (5B pav.). Pirmiau pateikti rezultatai rodo, kad CTE slopina BLL sukeltą RPE ląstelių pažeidimą, kuris gali būti susijęs su MAPK slopinimu RPE ląstelėse.
CTE gelbsti BLL sukeltą tinklainės pažeidimą po ilgalaikio periodinio poveikio žiurkės modeliui
Norėdami įvertinti apsauginį CTE poveikį, BN žiurkes veikėme ilgalaikiam BLL poveikiui 6 0 dienas ir įvertinome CTE poveikį. Kaip parodyta schemoje, pateiktoje 6A pav., BN žiurkės buvo suskirstytos į tris grupes: kontrolinę grupę, BLL paveiktą grupę ir CTE ir BLL grupę (6A pav.). CTE ir BLL grupėje BN žiurkėms buvo nuolat papildomas CTE (100 mg/kg kūno svorio) per burną vieną kartą per parą 14 dienų prieš BLL poveikį. 0 dieną BN žiurkės buvo kartu gydomos CTE (100 mg / kg kūno svorio) ir 60 dienų buvo veikiamos BLL 3 valandas per dieną. Po 60 dienų BLL poveikio gyvūnai buvo paaukoti Western blot analizei ir imunohistocheminiam dažymui. CTE ir BLL grupėje procaspazės -3 baltymo ekspresija žiurkės akių homogenatuose po gydymo CTE buvo didesnė nei BLL grupėje (6B ir 6C pav.). Šie duomenys rodo, kad CTE užkerta kelią ilgalaikiam mažo skaisčio BLL sukeltam tinklainės fototoksiškumui ir apoptozei, nes slopina suskaidytos kaspazės aktyvavimą-3. Imunohistocheminis dažymas suteikė daugiau įrodymų apie apsauginį CTE poveikį tinklainės struktūrai ir fiziologiniams takams (7 pav.). Be to, po BLL poveikio mes nustatėme, kad vidinis neuronų sluoksnis sumažėjo ir pastebėjome morfologines deformacijas išoriniame neuronų sluoksnyje (ONL), įskaitant vidinį segmentą / išorinį segmentą tiek centrinėje, tiek periferinėje tinklainėje, o tai atitinka mūsų ankstesnį tyrimą ( 7B pav.). Svarbu tai, kad CTE užkirto kelią RPE ląstelių deformacijai, neuronų ląstelių pažeidimui ir bendram tinklainės retėjimui CTE ir BLL grupėje (7C pav.). Be to, mes nepastebėjome TUNEL teigiamų ląstelių normalių žiurkių centrinėje ir periferinėje tinklainėje (8Ab ir 8Bb pav.). Ir atvirkščiai, po 60 dienų BLL poveikio, TUNEL teigiamos ląstelės buvo dažnai aptinkamos centrinės ir periferinės tinklainės ONL (8Ae ir 8Be pav.). Centrinės tinklainės ONL dažymas DAPI buvo žymiai sumažėjęs BLL grupėje (8 pav. Ad). Tačiau TUNEL teigiamų ląstelių buvimas buvo susilpnintas, o centrinės ir periferinės tinklainės ONL DAPI dažymas padidėjo CTE ir BLL grupėje (8Ai ir 8Bi pav.).
Cistanche tubulosa produktai
