2 dalis|Glikogeno sintazės kinazės 3b hiperaktyvumas išsausėjusiose šlapimo ląstelėse prognozuoja diabetinės inkstų ligos progresavimą

Spustelėkite čia, norėdami pamatyti 1 dalį

Norėdami gauti daugiau informacijos, kreipkitės:emily.li@wecistanche.com

DISKUSIJA

Jungtinėse Amerikos Valstijose ir kitose Vakarų šalyse DKD išlieka pagrindinė progresuojančios ligos etiologijalėtinė inkstų ligair užkrauna didelę naštą iždui ir sveikatos priežiūros sistemoms, kol dar nėra galutinio gydymo.5 Jau seniai pripažinta, kad ne visiems diabetu sergantiems pacientams išsivystys DN.5 Priklausomai nuo tirtos kohortos, buvo apskaičiuota, kad DN. serga nuo 30 iki 50 procentų diabetu sergančių pacientų. Dabartinės klinikinės praktikos taikomos priemonės, skirtos nustatyti diabetu sergančius pacientus, kuriems yra rizika susirgti DKD, daugiausia apsiriboja akių tyrimais dėl retinopatijos ir šlapimo tyrimu dėl albuminurijos.5 Tačiau suartėję epidemiologiniai duomenys rodo, kad ekstrarenalinė mikrovaskulopatija arba albuminurija labai prieštarauja dėl to progresuojančiam DKD.12,13,26,27 Todėl yra neatidėliotinas poreikis sukurti naują biomarkerį, skirtą tiksliai stratifikuoti diabetu sergančius pacientus, kuriems gresia DN. Šis tyrimas pirmą kartą praneša, kad GSK3b yra pernelyg išreikštas ir hiperaktyvus parenchiminėjeinkstasląstelės tiek eksperimentinėje, tiek klinikinėje DN, susijusios suinkstų ligos progresavimas. Be to, GSK3b hiperaktyvumas šlapimu išsausėjusiose ląstelėse greičiausiai gali numatyti DN progresavimą.

Cistanche tubulosa apsaugo nuo inkstų ligos, spustelėkite čia, kad gautumėte mėginį

GSK3b, labai konservuota, redoksui jautri serino / treonino baltymų kinazė, yra centrinė insulino signalizacija, taip pat daugybė kitų ląstelių signalų kelių, kurie yra labai svarbūs patofiziologiniams procesams, susijusiems suinkstassužalojimas, remontas ir regeneravimas. Insulinui jautriuose audiniuose, pvz., kepenyse ir griaučių raumenyse, GSK3b yra aktyvus bazinėmis sąlygomis ir slopina glikogeno sintazės aktyvumą.19,28 Insulinas greitai inaktyvuoja GSK3b slopindamas fosforilinimą serine 9, todėl vyksta glikogeno biosintezė. Vis daugiau įrodymų rodo, kad GSK3b reguliavimo sutrikimas yra susijęs su 2 tipo cukriniu diabetu.19,29–31 Iš tiesų, yra duomenų, rodančių GSK3b perteklinę ekspresiją ir hiperaktyvumą diabetu sergančių pacientų raumenyse31–33 ir nutukusių diabetu sergančių pelių riebaliniuose audiniuose. , transgeninė pernelyg didelė GSK3b ekspresija pelių skeleto raumenyse sukelia sutrikusią gliukozės toleranciją, atsparumą insulinui ir hiperinsulinemiją.29,35 Priešingai, pelėms, kurių skeleto raumenyse trūksta GSK3b, pagerėjo gliukozės tolerancija.36 Nuosekliai GSK3 inhibitoriai, pvz., litis, gali imituoja insulino veikimą ląstelių linijose ir audiniuose.37 Be to, nutukusių cukriniu diabetu sergančių pelių GSK3 inhibitoriai pagerino jautrumą insulinui ir gliukozės homeostazę.inkstastradiciškai nebuvo laikomas insulino veikimo organu. Tačiau neseniai įtikinami įrodymai rodo, kad insulino signalizacija yrainkstasląstelės, ypač podocituose, atlieka pagrindinį vaidmenį palaikant glomerulų irinkstashomeostazė.39–41 Defektyvus insulino signalizavimas podocituose dėl insulino trūkumo arba atsparumo insulinui greičiausiai yra pagrindinis daugelio DN pastebėtų patologinių pažeidimų iniciatorius. Be to, klinikiniai tyrimai parodė, kad atsparumas insulinui koreliuoja su albuminurijos pasireiškimu ir sunkumu net normalios kraujospūdžio pacientams, nesergantiems cukriniu diabetu, o tai rodo, kad pats atsparumas insulinui gali sukelti albuminuriją.42 Panašiai pelėms, kurioms būdingas podocitų atsparumas insulinui, pasiekiama sąlyginis insulino receptoriaus išmušimas glomerulų podocituose, išsivystė albuminurija ir glomerulų pažeidimai, kurie apibendrina DN, nepaisant to, kad nėra hiperglikemijos ar diabeto.41 Ir atvirkščiai, diabetu sergantiems gyvūnams insulino sensibilizatoriai gali sulėtinti DN progresavimą nepriklausomai nuo glikemijos kontrolės.43 Šie duomenys rodo, kad insulino signalizacija reguliuoja podocitų funkciją nepriklausomai nuo gliukozės kiekio kraujyje. Tačiau, kaip pagrindinio insulino signalizacijos kelio keitiklio, GSK3b vaidmuo DN patogenezėje ir progresavime buvo labai nepakankamai ištirtas.

Vidujeinkstas, GSK3b daugiausia ekspresuojamas podocituose ir, kiek mažesniu mastu, mezangialinėse ir endotelio ląstelėse glomeruluose20, 21 ir plačiai ekspresuojamas inkstų kanalėlių ląstelėse. Yra duomenų iš mūsų ir kitų grupių, rodančių, kad GSK3b tarpininkauja podocitų autonominiam pažeidimui, integruodamas kelis podocitų topatinius signalizacijos kelius.17,20,44,45 Nenuoseklumas, genetinė ar farmakologinė GSK3b blokada gali apsaugoti nuo podocitų pažeidimo ir susilpninti proteinuriją gyvūnų modeliuose įvairios nediabetinės glomerulopatijos.21 Be to, sergant progresuojančialėtinisinkstasligaNustatyta, kad GSK3b yra inkstų kanalėlių ir intersticinio pažeidimo moduliatorius. Tačiau, ar ir kaip GSK3b dalyvauja DN, buvo neaišku ir labai prieštaringa, nors šis tyrimas parodė, kad sustiprintas GSK3b aktyvinimasinkstaso šlapime išsisluoksniavusios ląstelės gali būti susijusios su DKD išsivystymu ar progresavimu. Pavyzdžiui, žiurkėms, sergančioms streptozotocino sukeltu diabetu, Lin ir kt.46 nustatė, kad GSK3b slopinimas adenozino trifosfato konkuruojančiu inhibitoriumi (20 Z,30 E)-6- Bromas indirubino-30 -oksime ( BIO) susilpnino proteinuriją ir pagerėjo DN glomerulų pažeidimai, nesant hiperglikemijos korekcijos, o tai rodo, kad GSK3b vaidina žalingą vaidmenį DN. Be to, žiurkėms, sergančioms streptozotocino sukeltu diabetu, Paeng ir kt.22 padarė panašių išvadų naudodami BIO ir padarė išvadą, kad padidėjęs GSK3b aktyvumas podocituose diabetinėmis sąlygomis yra susijęs su podocitų apoptoze ir DN praradimu. Tai sutampa su kitu in vitro tyrimu, kuriame nustatyta, kad GSK3b tarpininkauja podocitų diferenciacijai ir sužalojimui po didelės gliukozės koncentracijos terpės.47 Priešingai, Mariappan ir kt.48 teigė, kad GSK3b aktyvinimas pagerina diabeto sukeltą ligą.inkstassužalojimas. Jų tyrime streptozotocino sukeltos diabetinės pelės buvo gydomos natrio nitroprussidu, azoto oksido donoru, galinčiu aktyvuoti GSK3b. Jie nustatė, kad albuminurija, inkstų hipertrofija ir ekstraląstelinės matricos kaupimasis glomeruluose pagerėjo, jei nepagerėjo hipertenzija ar hiperglikemija. Tačiau šie radiniai smarkiai prieštarauja duomenims, gautų į genus nukreiptų „knock-in“ pelių, turinčių konstituciškai aktyvų GSK3, kurioms išsivystė spontaninė albuminurija ir podocitų pažeidimas.49 Norint suderinti prieštaringus duomenis, reikia atsargiai interpretuoti duomenis, gautus naudojant cheminius inhibitorius ar aktyvatorius. GSK3b. Nors BIO ne kartą buvo patvirtinta, kad jis yra labai selektyvus mažos molekulės GSK3b inhibitorius, natrio nitroprusidas nėra specifinis GSK3b aktyvatorius, tačiau žinomas, kad jis turi stiprų hemodinaminį poveikį50, o tai gali supainioti jo albuminuriją mažinantį ir renoprotekcinį poveikį. diabetinės pelės. Apskritai, nepaisant kai kurių prieštaringų duomenų, vyraujantys įrodymai linkę patvirtinti, kad GSK3b greičiausiai yra susijęs suinkstassužalojimasir proteinurija DN. Reikia paminėti keletą šio tyrimo apribojimų. Pirma, ikiklinikiniai duomenys apsiribojo DB / DB pelių modeliais. Nustatyti GSK3b vaidmens apibendrinimądiabetinis inkstų pažeidimas, būtina patvirtinti kitų DN modelių, įskaitant 1 tipo DN modelius, išvadas. Antra, klinikiniai stebėjimai buvo gauti iš retrospektyvių diabetu sergančių pacientų grupių, kurių imties dydis buvo ribotas ir stebėjimo laikas buvo palyginti trumpas. Tiesa, norint patikrinti mūsų pastebėjimus ir patvirtinti GSK3b galią šlapimu išsausėjusiose ląstelėse numatant DKD baigtį, reikalingi didelio masto, perspektyvūs, atsitiktinių imčių, daugiacentriai tyrimai.

GSK3b, labai konservuota, redoksui jautri serino / treonino baltymų kinazė, yra centrinė insulino signalizacija, taip pat daugybė kitų ląstelių signalų kelių, kurie yra labai svarbūs patofiziologiniams procesams, susijusiems suinkstassužalojimas, remontas ir regeneravimas. Insulinui jautriuose audiniuose, pvz., kepenyse ir griaučių raumenyse, GSK3b yra aktyvus bazinėmis sąlygomis ir slopina glikogeno sintazės aktyvumą.19,28 Insulinas greitai inaktyvuoja GSK3b slopindamas fosforilinimą serine 9, todėl vyksta glikogeno biosintezė. Vis daugiau įrodymų rodo, kad GSK3b reguliavimo sutrikimas yra susijęs su 2 tipo cukriniu diabetu.19,29–31 Iš tiesų, yra duomenų, rodančių GSK3b perteklinę ekspresiją ir hiperaktyvumą diabetu sergančių pacientų raumenyse31–33 ir nutukusių diabetu sergančių pelių riebaliniuose audiniuose. , transgeninė pernelyg didelė GSK3b ekspresija pelių skeleto raumenyse sukelia sutrikusią gliukozės toleranciją, atsparumą insulinui ir hiperinsulinemiją.29,35 Priešingai, pelėms, kurių skeleto raumenyse trūksta GSK3b, pagerėjo gliukozės tolerancija.36 Nuosekliai GSK3 inhibitoriai, pvz., litis, gali imituoti insuliną

veikia ląstelių linijas ir audinius.37 Be to, nutukusių diabetu sergančių pelių GSK3 inhibitoriai pagerino jautrumą insulinui ir gliukozės homeostazę.38 Inkstai tradiciškai nebuvo laikomi insulino veikimo organu taikiniu. Tačiau neseniai įtikinami įrodymai rodo, kad insulino signalizacija inkstų ląstelėse, ypač podocituose, vaidina pagrindinį vaidmenį palaikant glomerulų ir inkstų homeostazę.39–41 Sugedusi insulino signalizacija podocituose dėl insulino trūkumo arba atsparumo gali būti pagrindinis iniciatorius. daugeliui patologinių pažeidimų, pastebėtų DN. Be to, klinikiniai tyrimai parodė, kad atsparumas insulinui koreliuoja su albuminurijos pasireiškimu ir sunkumu net normalios kraujospūdžio pacientams, nesergantiems cukriniu diabetu, o tai rodo, kad pats atsparumas insulinui gali sukelti albuminuriją.42 Panašiai pelėms, kurioms būdingas podocitų atsparumas insulinui, pasiekiama sąlyginis insulino receptoriaus išmušimas glomerulų podocituose, išsivystė albuminurija ir glomerulų pažeidimai, kurie apibendrina DN, nepaisant to, kad nėra hiperglikemijos ar diabeto.41 Ir atvirkščiai, diabetu sergantiems gyvūnams insulino sensibilizatoriai gali sulėtinti DN progresavimą nepriklausomai nuo glikemijos kontrolės.43 Šie duomenys rodo, kad insulino signalizacija reguliuoja podocitų funkciją nepriklausomai nuo gliukozės kiekio kraujyje. Tačiau, kaip pagrindinio insulino signalizacijos kelio keitiklio, GSK3b vaidmuo DN patogenezėje ir progresavime buvo labai nepakankamai ištirtas.

Inkstuose GSK3b daugiausia ekspresuojamas podocituose ir, mažesniu mastu, mezangialinėse ir endotelio ląstelėse glomeruluose20, 21 ir plačiai ekspresuojamas inkstų kanalėlių ląstelėse. Yra duomenų iš mūsų ir kitų grupių, rodančių, kad GSK3b tarpininkauja podocitų autonominiam pažeidimui, integruodamas kelis podocitų patinius signalizacijos kelius.17,20,44,45 Nenuoseklumas, genetinė ar farmakologinė GSK3b blokada gali apsaugoti nuo podocitų pažeidimo ir susilpninti proteinuriją gyvūnų modeliuose įvairios nediabetinės glomerulopatijos.21 Be to, sergant progresuojančia lėtineinkstasligaNustatyta, kad GSK3b yra inkstų kanalėlių ir intersticinio pažeidimo moduliatorius. Tačiau, ar ir kaip GSK3b dalyvauja DN, buvo neaišku ir labai prieštaringa, nors šis tyrimas parodė, kad padidėjęs GSK3b aktyvavimas inkstuose ir šlapimo nuluptose ląstelėse gali būti susijęs su DKD vystymusi ar progresavimu. Pavyzdžiui, žiurkėms, sergančioms streptozotocino sukeltu diabetu, Lin ir kt.46 nustatė, kad GSK3b slopinimas adenozino trifosfato konkuruojančiu inhibitoriumi (20 Z,30 E)-6- Bromas indirubino-30 -oksime ( BIO) susilpnino proteinuriją ir pagerėjo DN glomerulų pažeidimai, nesant hiperglikemijos korekcijos, o tai rodo, kad GSK3b vaidina žalingą vaidmenį DN. Be to, žiurkėms, sergančioms streptozotocino sukeltu diabetu, Paeng ir kt.22 padarė panašių išvadų naudodami BIO ir padarė išvadą, kad padidėjęs GSK3b aktyvumas podocituose diabetinėmis sąlygomis yra susijęs su podocitų apoptoze ir DN praradimu. Tai sutampa su kitu in vitro tyrimu, kuriame nustatyta, kad GSK3b tarpininkauja podocitų diferenciacijai ir sužalojimui po didelės gliukozės koncentracijos terpės.47 Priešingai, Mariappan ir kt.48 teigė, kad GSK3b aktyvinimas pagerina diabeto sukeltą ligą.inkstassužalojimas. Jų tyrime streptozotocino sukeltos diabetinės pelės buvo gydomos natrio nitroprussidu, azoto oksido donoru, galinčiu aktyvuoti GSK3b. Jie nustatė, kad albuminurija, inkstų hipertrofija ir ekstraląstelinės matricos kaupimasis glomeruluose pagerėjo, jei nepagerėjo hipertenzija ar hiperglikemija. Tačiau šie radiniai smarkiai prieštarauja duomenims, gautų į genus nukreiptų „knock-in“ pelių, turinčių konstituciškai aktyvų GSK3, kurioms išsivystė spontaninė albuminurija ir podocitų pažeidimas.49 Norint suderinti prieštaringus duomenis, reikia atsargiai interpretuoti duomenis, gautus naudojant cheminius inhibitorius ar aktyvatorius. GSK3b. Nors BIO ne kartą buvo patvirtinta, kad jis yra labai selektyvus mažos molekulės GSK3b inhibitorius, natrio nitroprusidas nėra specifinis GSK3b aktyvatorius, tačiau žinomas, kad jis turi stiprų hemodinaminį poveikį50, o tai gali supainioti jo albuminuriją mažinantį ir renoprotekcinį poveikį. diabetinės pelės. Apskritai, nepaisant kai kurių prieštaringų duomenų, vyraujantys įrodymai linkę patvirtinti, kad GSK3b greičiausiai yra susijęs suinkstassužalojimasir proteinurija DN. Keletas apribojimų

reikia paminėti dabartinį tyrimą. Pirma, ikiklinikiniai duomenys apsiribojo dB / dB pelių modeliais. Nustatyti GSK3b vaidmens apibendrinimądiabetinis inkstų pažeidimas, būtina patvirtinti kitų DN modelių, įskaitant 1 tipo DN modelius, išvadas. Antra, klinikiniai stebėjimai buvo gauti iš retrospektyvių diabetu sergančių pacientų grupių, kurių imties dydis buvo ribotas ir stebėjimo laikas buvo palyginti trumpas. Tiesa, norint patikrinti mūsų pastebėjimus ir patvirtinti GSK3b galią šlapimu išsausėjusiose ląstelėse numatant DKD baigtį, reikalingi didelio masto, perspektyvūs, atsitiktinių imčių, daugiacentriai tyrimai.

Apibendrinant, mūsų tyrimai parodė, kad GSK3b inkstų ekspresija ir aktyvumas yra sustiprinti eksperimentiniame ir klinikiniame DN. GSK3b aktyvumas šlapimo nuluptose ląstelėse gali būti naujas biomarkeris prognozuojant DN progresavimą. Mūsų duomenys gali sudaryti sąlygas plataus masto nuodugniam tyrimui, kokią reikšmę GSK3b šlapime išsausėjusiose ląstelėse gali naudoti kaip prognozinis DN biomarkeris.

METODAI

Gyvūnų tyrimai

Tyrimus su gyvūnais patvirtino Institucinė gyvūnų priežiūra ir komitetas, jie atitinka JAV Žemės ūkio departamento nuostatas ir Nacionalinio sveikatos instituto žmonių priežiūros ir laboratorinių gyvūnų naudojimo vadovą. DB / DB pelių patinai ir kontroliniai db/m 6 savaičių jaunikliai buvo įsigyti iš NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nandzingas, Kinija) ir apgyvendinti Džengdžou universiteto centrinėje gyvūnų gamykloje. Visos pelės buvo šeriamos ad libitum, o 8–10 pelių buvo nužudytos nurodytu amžiumi. Nurodytais laiko momentais buvo imami šlapimo ir kraujo mėginiai. Po nužudymo inkstai buvo paimti tolesniam tyrimui. Šlapimo albumino kiekis buvo matuojamas naudojant pelių albumino fermentų imunosorbento tyrimo kiekybinio nustatymo rinkinį (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Kreatinino kiekis šlapime buvo nustatytas naudojant kreatinino tyrimo rinkinį (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Ląstelių kultūros

Sąlygiškai įamžinti pelių podocitai tarp 21 ir 25 pasažų buvo kultivuojami Roswell Park Memorial Institute 1640 terpėje, papildytoje 10 procentų galvijų vaisiaus serumo, leistinomis sąlygomis, kaip aprašyta anksčiau.22 Podocitų subkultūros buvo veikiamos neleistinomis sąlygomis, kad sukeltų diferenciaciją, ir buvo auginamos 14 dienų. tada veikiama normalia aplinka/kultūros terpe, kurioje buvo 5 mM gliukozės, diabeto aplinką, susidedančią iš gliukozės (25 mM) ir transformuojančio augimo faktoriaus b1 (2 ng/ml), arba didelio osmoliškumo kontrolinę terpę, kurioje yra 20 mM manitolio 48 val. valandų. Pelės proksimalinės kanalėlių epitelio ląstelės ir pelės glomerulinės mezangialinės ląstelės buvo palaikomos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje/F12, papildytoje 5 procentų galvijų vaisiaus serumu. Ląstelės buvo pasodintos 70 procentų santakoje į terpę, kurioje buvo 5 procentai galvijų vaisiaus serumo, 24 valandoms, o po to dar 24 valandas buvo badaujamos serume, o po to buvo veikiamos normalioje aplinkoje / kultūros terpėje, kurioje buvo 5 mM gliukozės, diabetinėje aplinkoje, kurią sudaro didelis kiekis gliukozės (25 mM) ir transformuojančio augimo faktoriaus b1 (2 ng/ml) arba didelio osmoliškumo kontrolinės terpės, kurioje yra 5 mM gliukozės ir 20 mM manitolio, 48 valandas. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas tripano mėlynos spalvos išskyrimu. Nurodytais laiko momentais ląstelės buvo fiksuotos arba ląstelių lizatai surinkti tolesniam tyrimui.

Trumpalaikė vektorių transfekcija

Vektorius, koduojančius tuščią vektorių arba hemagliutininu (HA) pažymėtą konstituciškai aktyvų (S9A) GSK3b mutantą (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3), pateikė dr. Gail VW Johnson (Birmingemas, AL) ir buvo transfekuoti į auginamus podocitus. mezangialinės ląstelės ir kanalėlių epitelio ląstelės, naudojant Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA), kaip aprašyta anksčiau.44 Transfekcijos efektyvumas buvo patikrintas imunofluorescenciniu dažymu arba imunoblotingu HA po 12 valandų. Vėliau ląstelės buvo surinktos ir paruoštos Western blot analizei ar kitiems tyrimams.

RNAi

3 pelių, GSK3b specifinių mažų, trukdančių RNR dvipusių – 50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 ir 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 – rinkinys. – buvo sukurti ir susintetinti pagal visą pelių GSK3b geno kodavimo seką (GenBank registracijos Nr. BC060743.1). Be to, kaip RNRi kontrolė buvo naudojama sumaišyta maža, trukdanti RNR seka (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30), kurios seka nepanaši į jokias žinomas pelių, žiurkių ar žmonių genų sekas. Lipofektamino (Invitrogen, Carlsbad, CA) sukelto genų slopinimo efektyvumas buvo įvertintas atliekant GSK3b imunoblotinę analizę. 24 valandas po RNR buvo pastebėtas patenkinamas GSK3b baltymo ekspresijos slopinimas kultivuotuose podocituose, mezangialinėse ląstelėse ir kanalėlių epitelio ląstelėse. Tada ląstelės buvo veikiamos normalioje aplinkoje / kultūros terpėje, diabetinėje aplinkoje arba didelio osmoliškumo kontrolės terpėje 48 valandas, kaip nurodyta aukščiau, prieš ląsteles apdorojant tolesniems tyrimams.

Klinikiniai tyrimai

Klinikinė šio tyrimo dalis atitiko 1975 m. Helsinkio deklaracijos etikos gaires ir buvo patvirtinta Džengdžou universiteto pirmosios dukterinės ligoninės Institucinės peržiūros tarybos. Žmonių tyrimų dalyviai nebuvo specialiai įdarbinti šiam tyrimui. Visi klinikiniai duomenys buvo surinkti retrospektyviai peržiūrint diagramas ir ištyrus archyvuotus audinių skyrius arba sukauptus šlapimo mėginius. Pernelyg dideli arba išmesti inkstų biopsijos mėginiai, taip pat frakcionuoti šlapimo mėginiai buvo reguliariai kaupiami Džengdžou universiteto Pirmosios asocijuotos ligoninės Nefrologijos institute. Archyvuoti neatpažinti formalinu fiksuoti parafinu įterpti inkstų biopsijos audiniai iš įvairių DN stadijų pacientų buvo atsitiktinai atrinkti tyrimui. Papildomi inkstų mėginiai be histomorfologinių pažeidimų buvo paimti iš inkstų, kurie buvo išmesti transplantacijai dėl kraujagyslių anomalijų, arba iš priešimplantacijos biopsijos audinių ir buvo naudojami kaip normalios kontrolės. Atliekant retrospektyvinį kohortos tyrimą, iš viso 127 pacientai, sergantys 2 tipo cukriniu diabetu, kurie nuo 2010 m. buvo stebimi su kauptais frakcionuoto šlapimo mėginiais, buvo retrospektyviai patikrinti, ar įtraukti į šį tyrimą. Tirti pacientai buvo nuo 29 iki 80 metų amžiaus ir jiems diagnozuotas 2 tipo diabetas pagal Amerikos diabeto asociacijos kriterijus. Atmetimo kriterijai buvo tolesnių veiksmų praradimas, nepakankama informacija,inkstasdisfunkcija, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 metai. Įprasto stebėjimo metu buvo dokumentuojami demografiniai duomenys, taip pat klinikiniai parametrai, įskaitant lytį, amžių, gretutines ligas, vaistus, diabeto trukmę, kraujospūdį, glikemijos lygį, kreatinino kiekį serume, šlapimo analizės duomenis, JAE ir eGFR. Klinikinis rezultatas po 5 metų stebėjimo buvo inkstų funkcijos sutrikimo progresavimas arba nebuvimas, kuris buvo apibrėžiamas kaip eGFR sumažėjimas 25 procentais USD arba albuminurijos progresavimas, kaip rodo albuminurijos sunkumo padidėjimas įvairiose klinikinėse ligos stadijose. DN, tai yra normoalbuminurija, mikroalbuminurija, makroalbuminurija arba atvira proteinurija. Visi pacientai pateikė raštišką informuotą sutikimą.

Inkstų morfologijos įvertinimas ir imunohistocheminė analizė

Parafinu įterpti formalinu fiksuoti pelių inkstų audinių blokai buvo supjaustyti į 3- mm pjūvius. Bendrajai histologijai sekcijos buvo apdorotos periodiniam dažymui rūgštimi-Schiffu. Imunohistocheminis GSK3b ir p-GSK3b dažymas buvo atliktas naudojant VECTASTAIN ABC rinkinį (Vector Laboratories, Burlingame, CA), kaip aprašyta anksčiau.20 Kaip neigiama kontrolė, pirminis antikūnas buvo pakeistas neimuniniu serumu iš tos pačios rūšies; dėmių neatsirado. Visų pjūvių morfologines ypatybes vertino vienas stebėtojas aklu būdu, padedamas inkstų patologo.

Imunofluorescencinis dažymas

Kultivuotos ląstelės arba užšaldytos kriostato sekcijos buvo fiksuotos ir nudažytos pirminiais antikūnais, o po to buvo naudojami Alexa Fluor konjuguoti antriniai antikūnai (Invitrogen). Kaip neigiama kontrolė, pirminiai antikūnai buvo pakeisti priešimuniniu IgG iš tos pačios rūšies; dėmių neatsirado. Galiausiai sekcijos buvo nudažytos 40 6-diamidino-2-fenilindoliu arba propidžio jodidu ir pritvirtintos VECTASHIELD tvirtinimo priemone (Vector Laboratories). Atliekant FL fluorescencinę mikroskopiją, visi skyriai buvo analizuojami tuo pačiu metu, kad būtų pašalinti artefaktai dėl kintamo fluorochromo skilimo. Pjūviai buvo tiriami naudojant Olympus FL fluorescencinį mikroskopą su Spot II skaitmenine kamera (Olympus, Tokijas, Japonija). Dviejų spalvų dažymui vaizdai buvo gauti nuosekliai, kad būtų išvengta dažų trukdžių. „ImageJ“ programinė įranga (Nacionaliniai sveikatos institutai, Bethesda, MD) buvo naudojama tolesniam vaizdų apdorojimui, pavyzdžiui, mastelio keitimui, sujungimui ir kolokalizacijos analizei.

Kompiuterizuota morfometrija

Imunohistocheminio dažymo vaizdai buvo užfiksuoti ir suskaitmeninti naudojant kompiuterizuotą vaizdų analizės sistemą, kurią sudaro didelės skiriamosios gebos įkrovimu sujungtas skaitmeninis fotoaparatas, prijungtas prie mikroskopo (Olympus BX41, Olympus) ir prie kompiuterio. Vaizdai buvo rodomi 1024 768 pikselių taškais (erdvinė skiriamoji geba, 0,24 mm/pikselis). Žmogaus inkstų audinių imunohistocheminio dažymo vaizdams „ImageJ“ programinė įranga buvo naudojama vaizdo segmentavimui, slenksčio nustatymui ir signalo intensyvumo matavimams. Prireikus buvo atlikti rankiniai pataisymai. Iš viso morfometrinei analizei buvo paimta 10 glomerulų arba 10 atsitiktinių tubulointersticinių laukų, o galutiniai duomenys buvo išreikšti kaip integruoto pikselių tankio vertė, palyginti su kontroline grupe.

Vakarų imunoblotinė analizė

Kultivuotos ląstelės buvo lizuotos;inkstasaudiniųarba izoliuoti inkstų glomerulai buvo homogenizuoti radioimunoprecipitacijos tyrimo buferyje, papildytame proteazės inhibitoriais, o mėginiai buvo apdoroti imunoblotinei analizei. Riboto šlapime nuskilusių ląstelių skaičiaus imunoblotinei analizei Western blot protokolas buvo modifikuotas, kaip aprašyta anksčiau, naudojant didelio našumo NuPAGE Bis-Tris gelius (Invitrogen) ir aukštos kokybės pernešimo membranas.25 Patobulintas imunoblotingas galėtų aptikti vidutiniškai išreikštus baltymus vos 1000 ląstelių. Antikūnai prieš GSK3b, fibronektiną, kolageną IV, aktiną ir gliceraldehido -3-fosfato dehidrogenazę (GAPDH) buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); preparatai prieš sinaptopodiną buvo įsigyti iš PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelbergas, Vokietija); o prieš ZO-1 ir p-GSK3b buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistinė analizė

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 palyginimai. Kategoriniai duomenys buvo lyginami tarp grupių naudojant chi kvadrato testą. Galimiems 2 parametrų ryšiams ištirti buvo pritaikyta tiesinė regresinė analizė. Vienamatė Cox proporcingų pavojų regresijos analizė buvo atlikta siekiant įvertinti sąsajas tarp atitinkamų kintamųjų ir inkstų funkcijos sutrikimo progresavimo rizikos, o po to buvo atlikta daugiamatė analizė, atsižvelgiant į galimus sutrikimus. Buvo atlikta ROC kreivės analizė ir išmatuotos sritys po ROC kreivėmis, siekiant išanalizuoti tam tikrų kintamųjų galią prognozuojant diabetu sergančių pacientų inkstų funkcijos sutrikimo progresavimą. Nenormaliai paskirstyti kintamieji, tokie kaip JAE, buvo transformuoti logaritmu, kad būtų pasiektas Cox proporcijos pavojų regresijos analizės ROC kreivės analizės normalumas. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant PSS 22 versiją (IBM Corporation, Armonk, NY). P reikšmės<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

ATSKLEIDIMAS

Visi autoriai nedeklaravo konkuruojančių interesų.

PADĖKA

Dalis šio tyrimo buvo pristatyta kaip žodinis pranešimas KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 2016 m. lapkričio 15–20 d., Čikagoje, IL. RG iš dalies parėmė Sveikatos fondas. XL buvo remiama mokslinių tyrimų stipendija gauti neakivaizdinį mokymą. ZL rėmė Nacionalinis Kinijos gamtos mokslų fondas U1604284, 81770672 ir 81873612 dotacijomis. Finansuotojai neturėjo jokio vaidmens kuriant ir vykdant šį tyrimą, renkant ir interpretuojant duomenis arba ruošiant ir tvirtinant rankraštį.

AUTORIŲ INSTRUKCIJA

RG sukūrė konceptualias idėjas. XL, ZL ir RG prisidėjo prie tyrimo plano. XL, PW, BC, YG, AYG ir BF atliko ląstelių kultūros eksperimentus. XL ir ZL atliko eksperimentus su gyvūnais ir rinko diabetu sergančių pacientų duomenis. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, ir prisidėjo prie diskusijos ir rezultatų interpretavimo. ėmėsi iniciatyvos rašant rankraštį. XL, BC ir BF prisidėjo prie rankraščio redagavimo. Visi autoriai sutiko, kad visa šio darbo koncepcija ir nuosavybė priklauso RG. Visi autoriai patvirtino galutinį rankraštį.

PAPILDOMA MEDŽIAGA

Papildomi metodai.

S1 lentelė. Kontrolės tiriamųjų ir pacientų, sergančių diabetine nefropatija, charakteristikos, suskirstytos pagal histologines diabetinės nefropatijos klases. S2 lentelė. Pradiniai demografiniai, klinikiniai ir laboratoriniai duomenys apie ankstyvos stadijos cukriniu diabetu sergančių pacientų, neturinčių DKD požymių, retrospektyvinės kohortos. S3 lentelė. Ankstyvosios stadijos 2 tipo cukriniu diabetu sergančių pacientų demografiniai, klinikiniai ir laboratoriniai duomenys, suskirstyti pagal jų inkstų rezultatus po 5 stebėjimo metų. S1 paveikslas. Padidėjęs GSK3b inkstų aktyvumas numato ligos vystymąsi ir sunkumądiabetikamsinkstasligadb/db pelėse. Pelių patinai db/db ir db/m buvo stebimi nuo 4 iki 13 savaičių amžiaus. (A) Kraujo mėginiai buvo paimti iš nevalgiusių pelių 4 ir 7 savaičių amžiaus ir buvo ištirtas gliukozės kiekis plazmoje. *P < 0.001,="" palyginti="" su="" db/m="" pelėmis="" 7="" savaičių="" amžiaus.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" šlapimas="" buvo="" paimtas="" 4,="" 7,="" 10="" ir="" 13="" savaičių="" amžiaus="" ir="" buvo="" atliktas="" albumino="" ir="" šlapimo="" kreatinino="" tyrimas,="" siekiant="" nustatyti="" albumino="" ir="" kreatinino="" santykį="" šlapime="" (uacr).="" *p="">< 0,001,="" palyginti="" su="" db/m="" pelėmis="" 10="" savaičių="" amžiaus="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001,="" palyginti="" su="" db/m="" pelėmis="" 13="" savaičių="" amžiaus.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" visoms="" pelėms="" buvo="" atlikta="" atvira="" inkstų="" biopsija="" 7="" savaičių="" amžiaus,="" o="" biopsijos="" mėginiai="" buvo="" apdoroti="" p-gsk3b,="" gsk3b="" ir="" gapdh="" imunoblotinei="" analizei.="" (d)="" imunoblotams="" buvo="" atlikta="" densitometrinė="" analizė.="" santykinis="" gsk3b="" ir="" p-gsk3b="" gausumas="" buvo="" nustatytas="" kaip="" atitinkamos="" molekulės="" gapdh="" densitometriniai="" santykiai,="" kaip="" kartų="" pokyčiai,="" palyginti="" su="" kontrolinėmis="" db="" m="" pelėmis.="" santykinis="" gsk3b="" aktyvumas="" buvo="" apskaičiuotas="" kaip="" p="" gsk3b="" ir="" gsk3b="" santykis="" kaip="" kontrolinių="" db/m="" pelių="" raukšlės.="" (e)="" tiesinės="" regresijos="" analizė="" parodė="" statistiškai="" reikšmingą="" teigiamą="" koreliaciją="" tarp="" inkstų="" gsk3b="" aktyvumo="" 7="" savaičių="" amžiaus="" db/db="" pelių="" ir="" albuminurijos="" išsivystymo="" bei="">diabetikamsinkstasliga13 savaičių amžiaus. R ¼ 0.699; P ¼ 0.{16}}{{20}}1. (F) Imtuvo veikimo charakteristikų kreivės analizė parodė, kad inkstų GSK3b aktyvumas ankstyvose diabeto stadijose (7 savaičių amžiaus) suteikia puikų tikslumą ir galią prognozuoti albuminurijos ir DKD vystymąsi 13 savaičių amžiaus db / db pelėms. S2 paveikslas. Atsparumas insulinui ir didelė aplinkos gliukozė sinergiškai aktyvina GSK3b inkstų ląstelėse. (A) išauginti pelių podocitai, (B) šlapimo glomerulinės mezangialinės ląstelės (MMC) ir (C) inkstų kanalėlių epitelio ląstelės (TEC) buvo transfekuotos sumaišytais siRNR oligonukleotidais (siCon) arba siRNR oligonukleotidais (siIRb), būdingais b izoformai. insulino receptorius (IRB), kad modeliuotų atsparumo insulinui būklę in vitro. Tada ląstelės 48 valandas buvo veikiamos normalioje gliukozės turinčioje normalioje aplinkoje (NG) arba daug gliukozės turinčioje diabetinėje aplinkoje (HG). Ląstelių lizatai buvo surinkti ir jiems buvo atlikta imunoblotinė IRB, p-GSK3b, GSK3b ir GAPDH analizė, po to atlikta densitometrinė blotų analizė. *P < 0,01,="" palyginti="" su="" irb="" ekspresija="" sicon="" apdorotose="" ląstelėse,="" veikiamose="" ta="" pačia="" aplinka="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05,="" palyginti="" su="" ta="" pačia="" baltymo="" ekspresija="" siirb="" þ="" ng="" arba="" sicon="" þ="" hg="" grupėje="" (n="" ¼="" 3),="" &="" p="">< 0,05,="" palyginti="" su="" ta="" pačia="" baltymo="" ekspresija="" antroje="" þ="" hg="" arba="" siirb="" þ="" ng="" grupėje="" (n="" ¼="" 3).="" s3="" pav.="" gsk3b="" mrnr="" ekspresijos="" lygiai="" žmogaus="" inkstų="" mėginiuose,="" gautuose="" iš="" sveikų="" donorų="" ir="" pacientų,="" sergančių="" diabetine="" nefropatija.="" duomenys="" buvo="" gauti="" iš="" www.nephroseq.org="" remiantis="" ju="" ckd="" glom="" duomenų="" rinkiniu51="" ir="" išreikšti="" kaip="" log2="" mediana="" orientuotas="" intensyvumas.="" s4="" pav.="" padidėjęs="" gsk3b="" aktyvumas="" šlapimo="" nuluptose="" ląstelėse,="" surinktose="" iš="" ankstyvos="" stadijos="" diabetu="" sergančių="" pacientų,="" prognozuoja="" diabetinės="" inkstų="" ligos="" vystymąsi.="" (a,="" b)="" gsk3b="" ir="" aktyvuoto="" gsk3b="" aptikimas="" šlapimo="" nuluptose="" ląstelėse,="" surinktose="" iš="" ankstyvos="" stadijos="" diabetu="" sergančių="" pacientų="" (pts)="" ir="" sveikų="" kontrolinių="" asmenų="" (ctrl).="" su="" šlapimu="" išsausėjusios="" ląstelės="" buvo="" surinktos="" ir="" lizuotos.="" ląstelių="" lizatai="" buvo="" apdoroti="" gsk3b,="" p-gsk3b="" ir="" gapdh="" imunoblotinei="" analizei.="" (c)="" imunoblotams="" buvo="" atlikta="" densitometrinė="" analizė.="" santykinis="" gsk3b="" ir="" p-gsk3b="" gausumas="" buvo="" nustatytas="" kaip="" atitinkamos="" molekulės="" gapdh="" densitometriniai="" santykiai,="" kaip="" kartų="" pokyčiai,="" palyginti="" su="" kontrole="" (ctrls).="" santykinis="" gsk3b="" aktyvumas="" buvo="" apskaičiuotas="" kaip="" p-gsk3b="" ir="" gsk3b="" santykis="" kaip="" normalios="" kontrolės="" raukšlės="" (ctrls).="" (d)="" imtuvo="" veikimo="" charakteristikų="" kreivės="" analizė="" parodė,="" kad="" santykinis="" gsk3b="" aktyvumas="" (p-gsk3b/gsk3b="" santykis)="" šlapime="" išsausėjusiose="" ląstelėse,="" surinktose="" iš="" ankstyvos="" stadijos="" diabetu="" sergančių="" pacientų,="" suteikia="" puikų="" tikslumą="" prognozuojant="" diabeto="">diabetinė inkstų ligaper 5 metus, kai plotas po kreive (AUC) yra 0,886.

NUORODOS

1. Umanathas K., Lewisas JB. Diabetinės nefropatijos naujinys: pagrindinė 2018 m. mokymo programa. Am J Inkstų dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J ir kt. Su diabetu susijusių komplikacijų pokyčiai Jungtinėse Valstijose, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr ir kt. Olmesartanas skirtas mikroalbuminurijos atidėjimui arba profilaktikai sergant 2 tipo cukriniu diabetu. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetiniai diabetinės nefropatijos mechanizmai. J Am Soc Nephrol. 2005;16(priedas 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Diabetinės nefropatijos klinikinės apraiškos ir natūrali istorija. Prisidėti Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA ir kt. 10-metų stebėjimas intensyviai kontroliuojant 2 tipo diabetą. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE ir kt. Mikroalbuminurija ir ankstyvo progresuojančio inkstų funkcijos pablogėjimo rizika sergant 1 tipo cukriniu diabetu. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM ir kt. Normoalbuminurinės CKD progresavimo iki paskutinės stadijos inkstų ligos rizika diabetu sergantiems žmonėms: CRIC (chroninio inkstų nepakankamumo kohortos) tyrimas. Esu J Inkstas Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Ankstyvųjų diabetinės nefropatijos rizikos prognozių poreikis: ar pakanka albumino išskyrimo greičio? Diabetas. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Žemas glomerulų filtracijos greitis pacientams, sergantiems normoalbuminuriniu 1 tipo cukriniu diabetu: labiau pažengusių glomerulų pažeidimų rodiklis. Diabetas. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Progresuojantis inkstų nuosmukis: nauja diabetinės nefropatijos paradigma sergant 1 tipo cukriniu diabetu. Diabeto priežiūra. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Neproteinurinė diabetinė nefropatija. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE ir kt. Nefropatijos vystymasis ir progresavimas sergant 2 tipo cukriniu diabetu: Jungtinės Karalystės perspektyvinis diabeto tyrimas (UKPDS 64). Kidney Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L ir kt. Šlapimo biomarkeriai vertinant ankstyvą diabetinę nefropatiją. J Diabetes Res. 2016 m.; 2016 m.: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y ir kt. Šlapimo IgG4 ir Smad1 yra specifiniai biomarkeriai, rodantys inkstų struktūrinius ir funkcinius pokyčius ankstyvose diabetinės nefropatijos stadijose. Diabetas. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M ir kt. Egzocitozės sukeltas viso ilgio megalino išsiskyrimas su šlapimu yra susijęs su diabetinės nefropatijos patogeneze. Diabetas. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z ir kt. Glikogeno sintazės kinazė 3b diktuoja podocitų judrumą ir židinio adhezijos apyvartą, moduliuodama paksilino aktyvumą: poveikis mažos ličio dozės apsauginiam poveikiui podocitopatijoje. Esu J Patholas. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glikogeno sintazės kinazė-3: savybės, funkcijos ir reguliavimas. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glikogeno sintazės kinazė-3 (GSK3): reguliavimas, veiksmai ir ligos. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L ir kt. GSK3 b izoforma tarpininkauja podocitų autonominiam pažeidimui proteinurinėje glomerulopatijoje. J Pathol. 2016;239:23.