Ⅱ dalis Europio nanodalelių šoninio srauto imunologinio tyrimo, skirto NGAL aptikimui šlapime ir ūminiam inkstų pažeidimui diagnozuoti, sukūrimas

Rezultatai

1. Rekombinantinio NGAL baltymo ekspresija ir gryninimas

pSecTag2A-NGAL rekombinantinė plazmidė buvo transfekuota į CHO ląsteles. NGAL-6×His baltymas daugiausia ekspresuojamas ląstelių supernatante ir vėliau išgryninamas Ni Sepharose. Išgrynintas rekombinantinis NGAL baltymas buvo gautas maždaug 95 procentų grynumo ir analizuojamas SDS-PAGE, kurio apytikslė molekulinė masė buvo 23,7 kDa (1 pav. A). Western blot taip pat patvirtino rekombinantinio baltymo NGAL ekspresiją ir gryninimą (1B pav.).

2. MAb generavimas

Pirmiausia palyginome nuolatinės srovės įtampos poveikį ląstelės membranos perforacijai esant skirtingam elektrinio lauko intensyvumui, o impulso amplitudė buvo atitinkamai 400 V, 450 V, 500 ir 550 V, kad optimizuotume elektrinės sintezės schemą. Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis, ląstelių koncentracija turi didelę įtaką sintezės efektyvumui[16]. Išskirtų blužnies ląstelių ir SP2/0 mielomos ląstelių mišri suspensija buvo perkelta į suliejimo kamerą skirtingomis koncentracijomis maždaug 2 × 106, 2 × 107 ir 2 × 108 ląstelių / ml. Suliejimo efektyvumas buvo didžiausias esant 450 V nuolatinei įtampai, o optimali ląstelių koncentracija buvo 2 × 107 ląstelės/mL (2 pav.).

3. MAb apibūdinimas

MAb buvo išgryninti Protein A kolonėlėje. Išgryninti MAb buvo atskirti 12 procentų SDS-PAGE ir redukuojančiomis sąlygomis buvo stebimos dvi juostos, kurių molekulinė masė 55 kDa ir 25 kDa. Neredukuojančiomis sąlygomis buvo pastebėtos aiškios 170 kDa juostos, o tai yra nepažeistas 2F4 ir 1G1 baltymas (3 A pav.). Western blot parodė, kad visi MAb specifiškai jungiasi su žmogaus NGAL baltymu (3B pav.). Po ląstelių elektrofuzijos ir subklonavimo hibridomų supernatantai buvo aptikti netiesioginiu ELISA metodu su NGAL-6×His ir PCT- 6×His, kad būtų užtikrintas specifinis antikūnų prisijungimas prie NGAL. Dvi labai teigiamos hibridomos (1G1, 2F4), turinčios specifinį NGAL prisijungimą, o be kryžminės reakcijos su PCT-6×His buvo sėkmingai atrinktos MAb gamybai ir gryninimui (3 C pav.). Norint nustatyti dviejų MAb afinitetą, sąveika tarp skirtingų koncentracijų antikūnų ir NGAL baltymo buvo ištirta BIAcore T200 sistema. Kinetinė diagrama parodė, kad 2F4 ir 1G1 afinitetas buvo atitinkamai 4,5 × 10-7 ir 6,0 × 10-7 (3D pav.). Tų dviejų MAb, kurie buvo aptikti komerciniais rinkiniais, izotipai buvo IgG1. Pagal cELISA aptikimą 2F4 ir 1G1-HRP susiejimo blokavimo dažnis buvo 63 proc., o tai rodo, kad jie atpažino skirtingus epitopus.

4. EU-NPS-LFIA procedūros

Remiantis EU-NPS kaip etiketėmis ir sumuštinio tipo imunologiniu tyrimu, LFIA buvo sukurta NGAL aptikti. MAb 2F4 buvo padengtas nitroceliuliozės membrana ir suporuotas su EU-NPS-1G1, remiantis antikūnų poravimu šoninio srauto imunochromatografijos platformoje. Kaip schematiškai parodyta (4 pav.), nitroceliuliozės membranos TL ir CL buvo padengti MAb 2F4 ir ožkos anti-pelės IgG. EU-NPS-1G1 buvo pažymėtas konjuguoto padėklo. Mėginys, kuriame yra NGAL antigeno, migravo link konjuguoto padėklo, kad susijungtų su EU-NPS-1G1 ir sudarytų antigeno-antikūno kompleksus. Vėliau kompleksai buvo užfiksuoti mAb 2F4 T linijoje, migruojant į sumuštinių kompleksus. Perteklinis kompleksas buvo sujungtas su ožkų anti-pelės IgG. Bandymo juostelės buvo išmatuotos fluorescencijos detektoriumi po 15 min.

5. Veiklos vertinimas

Antikūnų poros (2F4- pažymėtos1G1) kaip detektorius ir fiksuojantys antikūnai buvo panaudotos fluorescencinei imunochromatografijai nustatyti, o EU-NPS-LFIA analitinės savybės buvo įvertintos sudarant standartinę kreivę. Santykinis fluorescencijos intensyvumo santykis (HT/HC) buvo padidintas esant NGAL koncentracijai. EU-NPS-1G1 parodė reakciją į mAb 2F4 (5 pav. A). Didelės dozės kabliuko įtaka nebuvo aptikta, kai antigeno koncentracija pasiekė 3000 ng/mL. Regresijos lygtis parodyta taip: y=0.0012 x plius 0.0059 (R2=0.99), kur y reiškia HT/HC santykį, o x reiškia NGAL koncentraciją (1 pav.). 5B). Aptikimo riba (LOD) buvo 0,36 ng/mL (3 kartus didesnis už tuščiojo mėginio standartinį nuokrypį, n=20), apskaičiuotas pagal Klinikinių laboratorijų standartų instituto (CLSI) gaires EP17-A2, NGAL koncentracija. buvo tiesinis ryšys tarp 1-1500 ng/mL[17].

6. Tikslumas

Siekiant įvertinti imunologinio metodo tikslumą ir atkuriamumą, buvo atlikti vidinio ir tarpinio tyrimo atkūrimo eksperimentai. Į neigiamus šlapimo mėginius buvo pridėta skirtingų koncentracijų (50, 200 ir 800 ng/mL) NGAL standartinės medžiagos. Tyrimo tikslumas buvo apskaičiuotas trimis pakartojimais kiekvienai padidintai koncentracijai per 1 dieną, o tarp tyrimų tikslumas buvo apskaičiuotas trimis pakartojimais kiekvienai padidintai koncentracijai kas tris dienas penkiolika dienų ištisai[18]. Rezultatai pateikti 1 lentelėje, apskaičiuotas intratestinis variacijos koeficientas (CV) svyravo nuo 2,57 iki 4,98 procento (n=10), mažesnis nei 10 procentų. CV tarp tyrimų svyravo nuo 4,11 iki 7,83 procento (n=15), taip pat mažesnis nei 10 procentų.

Tyrimo viduje ir tarp tyrimų tikslumas buvo patikrintas dviem vertinimo prietaisais (Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd ir Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd), ir rezultatas galiausiai yra nuoseklus. Šie rezultatai paaiškino, kad sukurtos LFIA tikslumas buvo aukšto lygio, o atkuriamumas buvo priimtino lygio.

Norėdami nusipirkti, spustelėkite čiaCistanche papildai

7. Specifiškumas

Bandymo juostelių specifiškumas buvo įvertintas pridedant endogeninių medžiagų į normalią ir skirtingą šlapimo mėginių koncentraciją, įskaitant kreatininą, gliukozę ir karbamido azotą. Kaip parodyta 2 lentelėje, rezultatai parodė, kad visi santykiniai nuokrypiai (RD) buvo ± 10 procentų ribose, o tai rodo, kad antigeno ir antikūno sąveika buvo stabili, o bandymo juostelių specifiškumas buvo priimtinas NGAL atžvilgiu.

8. Klinikinių mėginių tyrimai

Siekiant įvertinti NGAL taikomąją kompetenciją pagal EU-NPS-LFIA klinikinių mėginių nustatymui, iš viso 83 šlapimo mėginiai, kuriuose yra 26 mažos vertės mėginiai (11–70 ng/mL), 19 mediana. vertės mėginiai (110–800 ng/mL), 38 didelės vertės mėginiai (800–1740 ng/mL), buvo išmatuoti ARCHITECT šlapimo NGAL tyrimu. Regresijos kreivės koreliacijos koeficiento (R2 ) rezultatai buvo 0,9829 (p < 0,01), o tai rodo, kad abu aptikimo metodai turėjo reikšmingą tiesinį ryšį (kur x reiškia NGAL koncentracijas, gautas ARCHITECT analizatoriumi, y reiškia reikšmes, išmatuotas sukurtos bandymo juostelės) (6 pav.). Taigi sukurta EU-NPS-LFIA, skirta NGAL nustatyti, buvo labai tiksli atliekant klinikinius tyrimus.

Diskusija

Mūsų tyrime buvo sukurtas EU-NPS-LFIA, skirtas NGAL aptikimui žmogaus šlapime ir AKI diagnozavimui. Dabartinę AKI diagnozę patvirtina kreatinino (sCr) koncentracija serume, kuri yra pastovi, nebent bent 50 procentų pažeista inkstų funkcija[19]. AKI išsivystė 89 procentams sunkių COVID{5}} sergančių pacientų, o daugumai pacientų vyrauja oligurija, kuri pasireiškia anksčiau nei kreatinino kiekis plazmoje[20]. Biomarkeriai padidino padidėjusį lygį priėmimo metu, o tai yra susiję su padidėjusiu mirtingumu. NGAL yra vienas iš šių biologinių žymenų, kurio lygiai gali teigiamai koreliuoti su COVID{7}} hospitalizuotų pacientų mirtingumo rizika[21]. Keli AKI tyrimai parodė, kad NGAL koncentracija šlapime yra reikšmingai susijusi su sCr koncentracija[22]. Pastaraisiais metais buvo sukurti įvairūs elektrocheminiai ir imunologiniai metodai, skirti aptikti NGAL, elektrocheminio nustatymo atvejus, kietosios fazės artumo ligavimo tyrimą ir befermentinį elektrocheminį imunologinį tyrimą [23, 24]. Tačiau šie metodai reikalauja tikslios įrangos, specializuoto personalo ir profesionalaus rezultatų interpretavimo. Todėl norint stebėti šį sutrikimą, labai svarbu sukurti veiksmingą ir patogų NGAL koncentracijos šlapime aptikimo tyrimą. Dėl mažo polietilenglikolio (PEG) sintezės efektyvumo įprastiniais metodais sunku gauti funkcinius antikūnus, optimizavome elektrinio sintezės parametrus, kurie leido padidinti suliejimo efektyvumą, kad būtų paruoštos gyvybingos hibridomos, ir gavome du anti-NGAL MAb. MAb yra ne tik didelio afiniteto, bet ir nukreipti į skirtingus epitopus, naudojami aukštos kokybės diagnostiniam tyrimui nustatyti.

Herba Cistanche

Pastaraisiais metais buvo pranešta, kad daugelis tyrimų sukūrė keletą greitųjų NGAL diagnostinių imunologinių tyrimų, įskaitant fotoelektrocheminį imunosensorių ir tris elektrocheminius imunosensorius, kietosios fazės artumo perrišimo tyrimą ir šoninio srauto tyrimą [25]. Viename tyrime imunosensorius buvo pagamintas naudojant NGAL gaudymo antikūnus, imobilizuotus ant ekrano atspausdinto modifikuoto anglies elektrodo, ir antrinio antikūno prieš NGA pridėjimą prie PB-NP dekoruotų g-C3N4 nanosferų, sudarančių sumuštinį ant SPCE[24]. Kito tyrimo metu buvo sukurtas antikūnas prieš NGAL, kuris buvo imobilizuotas ant ekrano atspausdinto elektrodo (SPCE), modifikuoto elektropolimerizuotu anilinu, nusodintu ant elektropurškimo grafeno/polianilino (G/PANI)[25]. Dvi ataskaitos parodė, kad LOD labai svyravo nuo 0,6 pg/mL iki 21,1 ng/mL, priklausomai nuo g-C3N4 nanosluoksnių su N elementu padidintu elektrokataliziniu nanohibridų efektyvumu nei grafeno nanoskopuose ir NGAL LOD. tyrimas skiriasi priklausomai nuo imunosensoriaus, konjuguoto komplekso ir antikūnų [26]. Remiantis tais tyrimais, mes išsiaiškinome, kad LFIA jautrumą galima pagerinti remiantis skirtingomis fluorescencinėmis nanodalelėmis, paminėtomis preambulės skyriuje. Didelio jautrumo nanodalelės, pažymėtos LFIA kaip fluorescenciniai zondai, buvo nuolat tiriamos per pastaruosius dešimtmečius, aukso nanodalelės yra plačiausiai naudojamos, tačiau šoninio srauto bandymų, pagrįstų tradicinėmis etiketėmis, taikymas apsiriboja prastu jų identifikavimu ir silpnesniu signalu. 27]. Šiuo metu yra antikūnų, skirtų NGAL kurti, buvo pritaikyti skirtingoms NGAL aptikimo platformoms, tačiau jų nėra LFIA, remiantis EU-NPS etiketėmis, eksperimentuotomis aptikti NGAL, be UCP technologija pagrįsto šoninio srauto tyrimo [28] , 29].

Fluorescenciniai imunologiniai tyrimai turi pranašumą įvairiose aptikimo srityse, ypač brandžiuose kvantiniuose taškuose, jų jautrumui įtakos turėjo MAb ir fluorescencinės medžiagos, o EU-NPS ir specifiniai MAb gali žymiai pagerinti fluorescencinius zondus[30 ]. EU-NPS buvo pritaikytas fluorescencinėms LFIA juostelėms, kurios subrendo aptikimo lauke ir padidino keletą LFIA pranašumų, susijusių su tyrimo jautrumu, specifiškumu ir stabilumu[31]. Dėl puikių EU-NPS savybių NGAL aptikimo riba šiuo metodu buvo 0,36 ng/mL, o sveikų asmenų vidutinis NGAL kiekis šlapime buvo apie 7,0 ng/ml[32]. . NGAL EU-NPS-LFIA kūrimas ir taikymas vis dar yra pradinėje fazėje, šiuo tyrimu reikia ištirti serumo ir šlapimo mėginių NGAL su COVID{12}} pacientais, kurių gydymą ateityje bus galima pagerinti. .

Išvados

Tyrimo metu sėkmingai gavome du pelių anti-NGAL MAb (2F4, 1G1) ir buvo paženklinti EU-NPS, kad būtų nustatyta šoninio srauto imuninė technika. Nustatyta, kad EU-NPSLFIA per 15 minučių aptiko NGAL plačiame diapazone 1- 3000 ng/mL, aptikimo jautrumas pasiekė 0,36 ng/mL. Šie anti-NGAL MAb gali būti patikimai panaudoti fluorescencinėje LFIA NGAL aptikimui šlapimo mėginiuose, todėl jie turėtų būti taikomi AKI diagnozei.

Cistanche tubulosa

Cistanche ekstrakto veiksmingumas ūminiam inkstų pažeidimui

Ūminis inkstų pažeidimas (AKI), taip pat žinomas kaip ūminis inkstų nepakankamumas, yra dažna sveikatos būklė, susijusi su staigiu inkstų funkcijos pablogėjimu. AKI gali sukelti didelį sergamumą ir mirtingumą, ypač jei jis negydomas. Todėl ankstyva diagnozė ir greitas gydymas yra būtini siekiant pagerinti paciento rezultatus.

Cistanche ekstraktas, gautas iš augalo Cistanche deserticola, buvo naudojamas tradicinėje kinų medicinoje įvairioms sveikatos būklėms gydyti. Naujausi tyrimai parodė, kad Cistanche ekstraktas gali būti pažadas gydant AKI.

Tyrimai nustatė galimus mechanizmus, kuriais Cistanche ekstraktas daro gydomąjį poveikį AKI. Tai apima uždegimo slopinimą, oksidacinio streso mažinimą, apoptotinių takų reguliavimą ir audinių regeneracijos skatinimą. Be to, buvo įrodyta, kad Cistanche ekstraktas apsaugo nuo inkstų fibrozės, kuri gali atsirasti dėl AKI, progresavimo.

Tyrimai su gyvūnais rodo, kad Cistanche ekstrakto skyrimas turi apsauginį poveikį inkstų funkcijai AKI modeliuose, todėl pagerėja glomerulų filtracijos greitis, sumažėja kanalėlių ląstelių pažeidimas ir sumažėja šlapalo azoto bei kreatinino kiekis serume. Tolesni klinikinės praktikos tyrimai su žmonėmis rodo padidėjusį šlapimo išsiskyrimą ir glomerulų filtravimo greitį (GFR), tuo pačiu užkertant kelią tolesniam karbamido azoto ir kreatino koncentracijos serume padidėjimui pacientams, sergantiems su širdies operacija susijusiu AKI.

Tačiau lieka keletas klausimų dėl idealių dozių, ilgalaikio saugumo profilių ir preparatų standartizavimo. Norint įvertinti optimalią Cistanche ekstrahavimo dozę ir vartojimo režimą, reikia atlikti papildomus aukštos kokybės atsitiktinių imčių kontroliuojamus tyrimus.

Apskritai, įrodymai rodo, kad Cistanche ekstraktas gali būti veiksmingas AKI gydymas, nors norint gauti tikslesnių rekomendacijų, reikia atlikti tolesnius išsamius tyrimus ir bandymus. Apibendrinant, nepaisant kai kurių apribojimų, Cistanche ekstraktas rodo potencialą sumažinti AKI sunkumą. Ankstyvas aptikimas ir greitas gydymas gali pagerinti paciento rezultatus ir gyvenimo kokybę. Prieš pradėdami alternatyvias gydymo priemones, pacientai turi pasitarti su sveikatos priežiūros paslaugų teikėjais, kad užtikrintų saugumą ir išvengtų neigiamo poveikio.

Cistanche poveikis

Nuorodos

15. Huang X, Aguilar Z, Xu H, Lai W, Xiong Y: Membraninė šoninio srauto imunochromatografinė juostelė su nanodalelėmis kaip reporteriai aptikimui: apžvalga. Biosensors bioelectronics 2016, 75:166–180.

16. Weeratna R, Comanita L, Davis H: CPG ODN leidžia naudoti mažesnę antigeno dozę prieš hepatito B paviršiaus antigeną BALB/c pelėms. Immunology cell Biology, 2003, 81(1):59–62.

17. Tong Q, Chen B, Zhang R, Zuo C: Klinikinių fermentų analizės standartizavimas naudojant užšaldytus žmogaus serumo telkinius, kurių vertės priskirtos Tarptautinės klinikinės chemijos ir laboratorinės medicinos federacijos etaloninių matavimo procedūrų. Skandinavijos klinikinių laboratorinių tyrimų žurnalas 2018, 78:74–80.

18. Huang D, Ying H, Jiang D, Liu F, Tian Y, Du C, Zhang L, Pu X: Greitas ir jautrus interleukino -6 aptikimas serume taikant laiko skiriamąjį šoninio srauto imuninį tyrimą. Analitinė biochemija 2020, 588:113468.

19. Shapiro N, Trzeciak S, Hollander J, Birkhahn R, Otero R, Osborn T, Moretti E, Nguyen H, Gunnerson K, Milzman D ir kt.: Su plazmos neutrofilų želatinaze susijusio lipokalino diagnostinis tikslumas prognozuojant ūminį inkstų ligą sužalojimas skubios pagalbos skyriaus pacientams, kuriems įtariamas sepsis. Greitosios medicinos pagalbos metraštis 2010, 56(1):52–59.e51.

20. Lutheris T, Bülow-Anderberg S, Larsson A, Rubertsson S, Lipcsey M, Frithiof R, Hultström M: COVID-19 pacientams, gydomiems intensyvioje terapijoje, dažniausiai pasireiškia oligurinis ūminis inkstų pažeidimas. Acta anesthesiologist Scandinavica 2021, 65(3): 364–372.

21. Abers M, Delmonte O, Ricotta E, Fintzi J, Fink D, de Jesus A, Zarember K, Alehashemi S, Oikonomou V, Desai J: Imuninis biomarkerio parašas yra susijęs su mirtingumu nuo COVID-19 pacientai. JCI insight 2021, 6(1).

22. Wagener G, Jan M, Kim M, Mori K, Barasch J, Sladen R, Lee H: Ryšys tarp šlapimo neutrofilų želatinazės sukeliamo lipokalino padidėjimo ir ūminio inkstų funkcijos sutrikimo po suaugusiųjų širdies operacijos. Anesthesiology 2006, 105(3):485–491.

23. Kannan P, Tiong H, Kim D: Labai jautrus elektrocheminis su neutrofilų želatinaze susijusio lipokalino nustatymas ūminiam inkstų pažeidimui. Biosensors bioelectronics 2012, 31(1):32–36.

24. Zhang F, Zhong H, Lin Y, Chen M, Wang Q, Lin Y, Huang: nanohibridas, sudarytas iš Prūsijos mėlynos spalvos ir grafitinių CN nanosluoksnių kaip signalą generuojanti žyma befermentiniame elektrocheminiame neutrofilų želatinazės imuniniame tyrime. susijęs lipokalinas. Mikrochimica acta 2018, 185(7):327.

25. Yukird J, Wongtangprasert T, Rangkupan R, Chailapakul O, Pisitkun T, Rodthongkum N: grafeno/polianilino nanokompozito pagrindu sukurtas imunosensorius be etiketės, skirtas su neutrofilų želatinaze susijusiam lipokalinui aptikti. Biosensors bioelectronics 2017, 87:249–255.

26. Gong Y, Li M, Wang Y: Anglies nitridas energijos konvertavimo ir saugojimo srityje: naujausi pažanga ir perspektyvos. ChemSusChem 2015, 8(6):931–946.

27. Chen A, Yang S: Antikūnų pakeitimas aptamerais šoninio srauto imunologiniame tyrime. Biosensors bioelectronics 2015, 71:230–242.

28. Li H, Mu Y, Yan J, Cui D, Ou W, Wan Y, Liu S: Fotoelektrocheminis imunosensorius be etiketės, skirtas su neutrofilų želatinaze susijusiam lipokalinui, pagrįstas nanokūnų naudojimu. Analitinė chemija 2015, 87(3): 2007–2015.

29. Lei L, Zhu J, Xia G, Feng H, Zhang H, Han Y: Greitas ir patogus vartotojui tyrimas, skirtas aptikti su neutrofilų želatinaze susijusį lipokaliną (NGAL), naudojant aukštyn konvertuojančias nanodaleles. Talanta 2017, 162:339–344.

30. Yeo S, Bao D, Seo G, Bui C, Kim D, Anh N, Tien T, Linh N, Sohn H, Chong C ir kt.: Monokloninių antikūnų prieš paukščių gripo H7 potipio viruso greito diagnostikos taikymo tobulinimas naudojant Europio nanodalelės. Scientific Reports 2017, 7(1):7933.

31. Chen E, Xu Y, Ma B, Cui H, Sun C, Zhang M: MonascusCarboxylFunctionalized, Europium nanodalelių pagrindu sukurtas fluorescencinis imunochromatografinis tyrimas jautriam citrinino aptikimui fermentuotame maiste. Toksinai 2019, 11(10).

32. Bolignano D, Coppolino G, Campo S, Aloisi C, Nicocia G, Frisina N, Buemi M: Su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas pacientams, sergantiems autosomine dominuojančia policistine inkstų liga. American Journal of Nephrology, 2007, 27(4):373–378.

Moli Yin 1 , Yuanwang Nie 2 , Hao Liu 2 , Lei Liu 1 , Lu Tang 1 , Yuan Dong 2 , Chuanmin Hu 1 ir Huiyan Wang 1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR China.

2 Laboratorijos akademija, Jilin medicinos universitetas, 132013 Jilin, PR, Kinija.