PIRMA DALIS Feniletanolio glikozidai apsaugo nuo miokardo hipertrofijos, kurią sukelia pilvo aortos susiaurėjimas, naudojant ECE{0}} demetilinimo slopinimą ir PI3K/PKB/eNOS kelio stiprinimą

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Qiong-Ling Fan, 1 Jia-Wei Wang, 1 Shi-Lei Zhang ir kt.

Feniletanolio glikozidai (CPhG)yra pagrindinis materialus farmakologinės veiklos pagrindasCistanche tubulosair turi įvairų farmakologinį poveikį. Tačiau neaišku, ar CPhG(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) turi gerinantį poveikį slėgio perkrovos sukeltai miokardo hipertrofijai. Šiame tyrime SD žiurkių patinams, sveriantiems (200 ± 20) g, buvo nustatyti širdies hipertrofijos modeliai pilvo aortos koarktacijos (AAC) būdu. Po operacijos žiurkės 6 savaites buvo maitinamos atitinkamu vaistu (CPhG(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) 125, 250 ir 500 mg/kg/d. ir valsartano 8,3 mg/kg/d.). Buvo aptikta echokardiografija, širdies svorio indeksas (HWI), kardiomiocitų (CSCA) skerspjūvio plotas, fibrozės sritis, plazmos endotelinas 1 (ET-1) ir priešuždegiminių veiksnių lygis. Mūsų rezultatai parodė, kad skirtingi CPhG(Feniletanolio glikozidai) sumažintas dozės kairiojo skilvelio užpakalinės sienelės storis (LVPWT), kairiojo skilvelio galutinis diastolinis skersmuo (LVED), HWI, CSCA, fibrozės sritis, ET-1, priešuždegiminiai veiksniai, arterinis natriuretinis peptidas (ANP), smegenų natriuretinis peptidas (BNP) ), endoteliną konvertuojančio fermento 1 (ECE-1) mRNR lygiai, ciklooksigenazės 2 (COX-2), didelio mobilumo grupės 1 dėžutės (HMGB-1) baltymų lygiai ir ECE{{8} } demetilinimo lygis kartu padidinant kairiojo skilvelio išstūmimo frakcijas (KSEF), kairiojo skilvelio frakcijų sutrumpėjimą (LVFS), fosforilinto fosfatidilinozitolio 3- kinazę (p-PI3K), fosforilinto baltymo kinazę B (p-PKB) ir fosforilintą endotelį. sintetazė (p-eNOS). -e CPhG indeksai(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) 250 ir 500 mg/kg grupė reikšmingai skyrėsi nuo AAC grupės; lyginant su valsartano grupe (AV), CPhG 500 mg/kg grupėje rodikliai reikšmingai nesiskyrė. Apibendrinant, CPhG(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) AAC pagerino žiurkių miokardo hipertrofiją, kuri gali būti susijusi su ECE{0}} demetilinimo slopinimu ir PI3K/PKB/eNOS padidėjimu.

2. Medžiagos ir metodai

2.1.Gyvūnai.

70 SPF SD žiurkių patinų, sveriančių 200 ± 20 g (10 vienoje grupėje), pateikė Sindziango medicinos universiteto (Urumčis, Kinija) eksperimentinis gyvūnų centras. Gyvūnų auginimo licencijos numeris buvo SYXK(XIN)2016-0003, o sertifikato numeris – SCXK(XIN)2016-002. Tyrimą patvirtino Sindziango medicinos universiteto pirmosios dukterinės ligoninės gyvūnų etikos komitetas (patvirtinimo numeris 20180223-183). Mūsų eksperimentinių gyvūnų centre jie buvo laikomi su laisva prieiga prie vandens ir maisto plastikiniuose narvuose ir laikomi 12 valandų šviesos / tamsos cikle 22 ± 2 laipsnių temperatūroje ir 45–55 proc.

2.2. Medžiagos.

CPhGs(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) , kuriame ežiuolės buvo daugiau nei 40 proc., o akteozido – daugiau nei 16 proc., pirktas iš Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartanas pirktas iš Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Karboksimetilceliuliozės natrio druska (CMC-Na) pateikė Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. Ir CPhG buvo ištirpinti 0,5 procento CMC-Na.

Feniletanolio glikozidai iš cistanche

2.3. Pilvo aortos koarktacija (AAC).

Po anestezijos 2,5 procento natrio pentobarbitalio (2,5 ml/kg) (Merck, Darmstadt City, Hesenas, Vokietija), žiurkės buvo nuskustos ir laikomos šiltai ant kaitinimo pagalvėlių. -lt sterilioje aplinkoje žiurkės pilvo ertmė buvo atidaryta 2 cm pilvo viduryje, pilvo vidaus organai buvo nustumti į dešinę pusę, o pilvo aorta buvo visiškai atidengta ties 0,5 cm virš dešiniosios inkstų arterijos. 8 numerio adata buvo perrišta 2 numerio viela lygiagrečiai susiuvamai pilvo ertmei [18]. Apgaulingos grupės žiurkių pilvo aortos buvo atskirtos be perrišimo, o operacijos kontrolinės grupės nebuvo. - kitą dieną po operacijos CPhG buvo šeriami AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg ir AC 500 mg/kg.(Feniletanolio glikozidai iš cistanche)zondu; AV grupė buvo maitinama valsartanu per zondą; ir kontrolinė grupė, AAC grupė ir fiktyvi grupė nebuvo šeriami CPhG ar valsartanu kartą per dieną 42 dienas iš eilės. Vaistų dozė buvo nustatyta remiantis ankstesnėmis nuorodomis ir preliminariais eksperimentais [8].

2.4. Echokardiografija.

Praėjus šešioms savaitėms po AAC, žiurkės buvo anestezuotos 2,5 procento natrio pentobarbitalio ir atlikta echokardiografija (Philips HD11 XE, Amsterdamas, Nyderlandai). LVPWT, LVED, LVEF ir LVFS buvo išmatuoti keturis kartus, siekiant apskaičiuoti vidurkius kaip galutinius rodiklius.

2.5. Širdies svorio indeksas (HWI).

Po echokardiografijos žiurkėms buvo atliktas kraujas paimant kraują iš pilvo aortos. - Žiurkių širdys buvo ištrauktos iš krūtinės ir pasvertos po to, kai 3 kartus nuplaunamos įprastu fiziologiniu tirpalu (4 laipsnių) ir nusausinamos švariu filtravimo popieriumi. -e HWI buvo apskaičiuotas pagal šią formulę: HWI � širdies svoris kūno svoris. (1)

2.6. Hematoksilino-eozino ir Massono dažymas.

- Miokardas iš kairiojo skilvelio buvo fiksuotas 4 procentų paraformaldehidu, įterptu į parafiną, perpjautu 4 μm pjūvio storiu, 2 valandas džiovintas orkaitėje 60 laipsnių temperatūroje, o po to nudažytas hematoksilino eozinu arba Masson (Solaibio, Pekinas, Kinija). Miokardo struktūra buvo stebima apversto fazinio kontrasto mikroskopu (Leica, Frankfurtas, Vokietija). „Image J“ programinė įranga buvo naudojama CSAC ir fibrozės plotui apskaičiuoti.

2.7. Su fermentais susieto imuninio sorbento tyrimas (ELISA).

Pilvo aortos kraujas buvo paimtas iš žiurkių ir įdėtas į antikoaguliacinį mėgintuvėlį 2 valandoms kambario temperatūroje, o po to centrifuguojamas 3000 aps./min. greičiu. - Supernatantas buvo absorbuojamas pipetėmis (Eppendorf, Hamburgas, Vokietija) ir laikomas 80 laipsnių temperatūroje bandymui. E

(TNF-) (Bioss, Pekinas, Kinija) ir ciklooksigenazės 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, Kinija) lygiai buvo nustatyti pagal ELISA rinkinio instrukcijas.

2.8. Metilinimui specifinis PGR.

DNR buvo išskirta iš žiurkių kairiojo skilvelio miokardo audinio naudojant DNR ekstrahavimo rinkinį (Tiangen Biotech, Pekinas, Kinija). -e sugerties vertė (A vertė) buvo lygi OD260/OD280 (1,8–1,9). 20 ul genominės DNR (500 pg{9}} ug) buvo modifikuota sieros rūgštimi Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, JAV). -e MSP reakcijos sistema buvo 25 μL, įskaitant 3,0 μL sulfitu modifikuoto DNR šablono, 2,5 μL 10 × buferio, 2,5 μL 2,5 mm dNTP, 1,0 μl 10 μm pradmenų, 0,1 μl DNR HotstartaqRA (Biotechnologazė) (Biotechnology TaqRA) , ir 14,9 μL ddH2O. Iš viso buvo 45 ciklai: denatūravimas 95 laipsniais, atkaitinimas 55 laipsniais ir pratęsimas 72 laipsnių 30 s. Po PGR 5 μL produkto buvo atskirta 2 procentų agarozės gelio elektroforeze. -e DNR buvo apdorota M. Sssl metiltransferaze (New England Biolabs, Ipswich, MA, JAV) buvo naudojama kaip teigiama metilinimo kontrolė, o normalios kontrolinės grupės DNR buvo naudojama kaip teigiama demetilinimo kontrolė. Galiausiai agarozės gelis buvo nufotografuotas ir analizuojamas Bio-Rad gelio vaizdavimo sistema. -e demetilinimo lygis buvo apskaičiuotas pagal šią formulę:

Visi „Methprimer“ („Applied Biosystems“, MA, JAV) sukurti ir „Sangon Biotech“ (Šanchajus, Kinija) susintetinti gruntai yra išvardyti 1 lentelėje.

2.10. Western Blot.

Baltymai buvo ekstrahuoti iš kairiojo skilvelio miokardo naudojant Ripa Buffffer (mokslinį) ir pridėta proteazės inhibitorių. Baltymų koncentracija buvo nustatyta BCA metodu (Solarbio, Pekinas, Kinija). Baltymai buvo paimti 50 ug ir denatūruoti 100 ° C temperatūroje 5 minutes. Baltymai buvo atskirti natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS-PAGE, Beyotime, Šanchajus, Kinija), o po to elektroforezės įranga (Bio-Rad, CA, JAV) perkelti į polivinilidenfluorido (PVDF) membraną. 2 valandas kambario temperatūroje užblokavus 3 procentų BSA, membranos buvo inkubuojamos su anti-PI3K antikūnu, antifosfo-PI3K antikūnu, anti-eNOS antikūnu, anti-fosfo-eNOS (1:1000, Bioss, Pekinas, Kinija). anti-COX-2 antikūnas, anti-HMGB-1 antikūnas (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, JAV) ir anti-ECE-1 antikūnas (1: 2000, Signalway Antibody) , College Park, MD, JAV), pirminiai antikūnai per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Kitą dieną, 3 kartus nuplovus TBST, membranos kambario temperatūroje buvo inkubuojamos su HRP pažymėtu ožkos anti-triušio IgG (1: 25000, 1 val., Zhongshanjinqiao, Šanchajus, Kinija). Po 3 kartų plovimo TBST membranos buvo vizualizuotos Pierce ™ ECL Western Blotting Substrate ir vaizduojamos naudojant FluorChem E Imaging System (Protein Simple, JAV), kurios buvo normalizuotos į -aktiną kaip vidinę kontrolę.

Feniletanolio glikozidų iš cistanche nauda

cistanche nauda

3. Rezultatai

3.1. CPhGs(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) Pagerėjusi žiurkių širdies funkcija po AAC.

- e žiurkėms buvo zonduojama kitą dieną po AAC. -Teigiamai kontrolinei grupei (AV) buvo duota zondų valsartano 8,3 mg/kg/d, o CPhGs grupei (AC) buvo duota atitinkamai 125, 250 ir 500 mg/kg/d CPhG. Po šešių savaičių nepertraukiamo dozavimo žiurkėms buvo atlikta echokardiografija taikant 2,5 procento natrio pentobarbitalio anesteziją. Dvi žiurkės mirė po AAC: viena modelių grupėje mirė trečią dieną po AAC nuo plaučių edemos; dar vienas iš AC 500 mg/kg mirė kitą dieną po operacijos, kurią, kaip įtariama, sukėlė chirurginis stresas. Kaip parodyta 2 paveiksle, lyginant su netikra grupe, LVED, KSEF ir LVFS AAC grupėje žymiai sumažėjo, tačiau LVPWT AAC grupėje žymiai padidėjo. Palyginti su AAC grupe, KSĮD, KSIF ir KSFS padidėjo, o LVPWT sumažėjo įvairiais laipsniais kiekvienoje AC dozių grupėje; LVPWT reikšmingas pokytis nebuvo nustatytas AC 125 mg/kg grupėje, bet buvo nustatytas AC 250 ir 500 mg/kg grupėse. Lyginant su AV grupe, LVPWT ir LVED AC 125 mg/kg grupėje buvo pastebėtas reikšmingas skirtumas, o LVPWT, LVED, LVFS ir LVFS AC 250 ir 500 mg/kg grupėse nebuvo.

3.2. CPhGs(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) Sumažėjęs HWI, CSAC ir fibrozės plotas žiurkėms po AAC.

-lt pasvėrėme kiekvienos žiurkės širdį, kad apskaičiuotume HWI, ir paėmėme miokardo audinį HE ir Masson dažymui, kad stebėtume skerspjūvio ploto (CSAC) ir fibrozės srities pokyčius kardiomiocituose. Kaip parodyta 3(a), 3(d) ir 3(e) paveiksluose, palyginti su fiktyviąja grupe, širdies svoris (HW) ir HWI AAC grupėje žymiai sumažėjo; lyginant su AAC grupe, HW ir HWI AC250 ir 500 mg/kg grupėse žymiai sumažėjo; Palyginti su AV grupe, HW ir HWI žymiai padidėjo AC 125 mg/kg grupėje, bet nebuvo AC 250 ir 500 mg/kg grupėse. 3(b) ir 3(f) paveiksluose, lyginant su netikra grupe, Massono dažymo rezultatai parodė, kad fibrozės plotas AAC grupėje žymiai padidėjo. Fibrozės srityje nustatytas reikšmingas sumažėjimas AC 125, 250 ir 500 mg/kg grupėse, palyginti su AAC grupe, o reikšmingas padidėjimas AC 125 ir 250 mg/kg grupėse ir reikšmingas AC 500 mg/kg sumažėjimas. kg grupėje, palyginti su AV grupe. 3 (c) ir 3 (g) paveiksluose HE dažymo rezultatai parodė, kad CSAC AAC grupėje buvo žymiai padidėjęs, palyginti su fiktyviąja grupe; lyginant su AAC grupe, CSAC 250 ir 500 mg/kg grupėse buvo žymiai sumažintas; Tačiau, palyginti su AV grupėje, CSAC reikšmingai padidėjo AC 125 ir 250 mg/kg grupėse, o AC 500 mg/kg grupėje reikšmingo skirtumo nenustatyta.

3.3. CPhGs(Feniletanolio glikozidai iš cistanche) Sumažėjęs miokardo hipertrofijos genų mRNR lygis žiurkių miokardo audiniuose po AAC.

ANP, BNP ir miozino sunkioji grandinė (-MHC) yra svarbūs širdies hipertrofijos veiksniai [19, 20]. Mes nustatėme santykinius šių trijų širdies hipertrofijos genų ekspresijos lygius miokardo audiniuose. Kaip parodyta 4 paveiksle, palyginti su netikra grupe, santykinis ANP, BNP ir -MHC mRNR ekspresijos lygis AAC grupėje buvo žymiai padidėjęs; tačiau, palyginti su AAC grupe, santykiniai trijų miokardo hipertrofijos genų ekspresijos lygiai AC 250 įrodymais pagrįstoje papildomoje ir alternatyvioje medicinoje 5.

Feniletanolio glikozidų iš cistanche nauda