1 dalis: Akteozidas slopina RANKL sukeltą osteooklastogenezę, slopindamas C-Fos indukciją ir NF-KB kelią bei silpnindamas ROS gamybą
Mar 05, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Abstraktus
Daugybė tyrimų parodė, kad uždegiminiai citokinai yra svarbūs osteoklastogenezės tarpininkai, todėl sukelia pernelyg didelę kaulų rezorbciją ir osteoporozę.Akteozidas iš cistanche žolės, pagrindinis aktyvus Rehmannia glutinosa junginys, plačiai naudojamas tradicinėje Rytų medicinoje, turi priešuždegiminių ir antioksidacinių savybių. Šiame tyrime mes nustatėme, kadakteozidožymiai slopino osteoklastų diferenciaciją ir susidarymą iš kaulų čiulpų makrofagų (BMM) ir RAW264.7 makrofagų, stimuliuojamų branduolinio faktoriaus-kappaB (NF-kB) ligando (RANKL) receptorių aktyvatoriaus.AkteozidasIšankstinis gydymas taip pat užkirto kelią kaulų rezorbcijai subrendusiems osteoklastams, priklausomai nuo dozės. Akteozidas (10 mM) susilpnino RANKL stimuliuojamą p38 kinazės, tarpląstelinio signalo reguliuojamų kinazių ir c-Jun N-galinės kinazės aktyvavimą, taip pat slopino NF-kB aktyvaciją, slopindamas p65 subvieneto ir inhibitoriaus kBa fosforilinimą. Be to, dėl RANKL padidėja c-Fos ekspresija ir aktyvuotų T ląstelių branduolinis faktorius, citoplazminis 1 (NFATc1) ir auglio nekrozės faktoriaus-a, interleukino (IL)-1b gamyba. , ir IL-6 buvo akivaizdžiai slopinami dėl išankstinio apdorojimo akteozidu. Be to, oralinisakteozidosumažino ovariektomijos sukeltą kaulų retėjimą ir uždegiminių citokinų gamybą iki kontrolinio lygio. Mūsų duomenys rodo, kad akteozidas slopina osteoklastų diferenciaciją ir brendimą nuo osteoklastinių pirmtakų, slopindamas RANKL sukeltą mitogeno aktyvuotų baltymų kinazių ir transkripcijos faktorių, tokių kaip NF-kB, c-Fos ir NFATc1, aktyvaciją. Visi šie rezultatai rodo, kad akteozidas gali veikti kaip antirezorbcinis agentas, mažinantis kaulų retėjimą blokuodamas osteoklastų aktyvaciją.
Įvadas
Kaulas nuolat remodeliuojamas dėl subalansuoto osteoklastų ir osteoblastų aktyvumo [1]. Osteoklastai atsiranda iš monocitų / makrofagų linijos kraujodaros pirmtakų ląstelių, o osteoblastai yra mezenchiminės linijos [2]. Nenormalus osteoklastų aktyvavimas arba sumažėjusi osteoblastogenezė gali sutrikdyti kaulų homeostazę, galiausiai sukelti ligas, tokias kaip osteoporozė, artritas ir kaulų vėžys [3,4]. Osteoporozė yra dažna kaulų liga, dėl kurios padidėja lūžių rizika. Dažniausia osteoporozės forma atsiranda dėl estrogenų trūkumo moterims menopauzės metu. Tokie vaistai kaip kortikosteroidai ir vaistai nuo epilepsijos taip pat gali sutrikdyti kaulų rezorbcijos ir formavimosi pusiausvyrą, o tai gali sukelti osteoporozę [5].
Daugelis antirezorbcinių inhibitorių, įskaitant bisfosfonatus, kalcitoniną, estrogeną ir selektyvius estrogenų receptorių moduliatorius, buvo naudojami osteoporozei gydyti. Šie inhibitoriai palaiko kaulų masę slopindami osteoklastų funkciją [6]. Pakaitinė estrogenų terapija yra populiariausias pomenopauzinės osteoporozės profilaktikos ir gydymo būdas. Tačiau ilgalaikė pakaitinė estrogenų terapija gali padidinti endometriumo ir krūties vėžio riziką. Todėl daugelis tyrėjų sutelkė savo pastangas kurdami naują antirezorbcinį agentą, kuris neturėtų šalutinio poveikio [7–10]. Kadangi osteoklastai veikia rezorbuojant kaulus, daugelyje tyrimų pagrindinis tikslas buvo specifiškai slopinti osteoklastus.
Osteoklastai yra daugiabranduolės milžiniškos ląstelės, kurias sudaro monocitų/makrofagų šeimos mononukleariniai pirmtakai, nuosekliai proliferuojant, diferencijuojant ir susiliejant kraujodaros pirmtakų ląstelėms [11]. Makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (M-CSF) ir branduolinio faktoriaus (NF)-kB (RANK) ligando (RANK) receptorių aktyvatorius (RANKL) yra esminiai veiksniai osteoklastų diferenciacijai [12]. Be to, keli uždegiminiai citokinai, tokie kaip naviko nekrozės faktorius (TNF) ir interleukinas (IL)-1b, prisideda prie osteoklastogenezės, moduliuodami RANKL, osteoprotegerino ir M-CSF indukciją [7,13]. RANKL prisijungimas prie ląstelės paviršiaus RANK receptoriaus sukelia RANKL/RANK/TNFR susijusių faktorių (TRAF) kompleksus, kurie nuosekliai aktyvuoja NF-kB ir mitogenu aktyvuotas proteinkinazes (MAPK), įskaitant c-Jun N-galinę kinazę (JNK), p38. kinazė ir su ekstraląsteliniu signalu susijusi kinaze (ERK) [14]. Šis aktyvinimas atlieka pagrindinį vaidmenį tarpininkaujant osteoklastų diferenciacijai, aktyvacijai ir išgyvenimui. RANKL taip pat suaktyvina transkripcijos faktorių, tokių kaip aktyvuotų T ląstelių branduolinis faktorius, citoplazminis 1 (NFATc1) ir c-Fos, ekspresiją, kurie yra būtini osteoklastų vystymuisi [7,9]. Todėl RANKL signalizacija laikoma pagrindiniu antirezorbcinių medžiagų, slopinančių osteoklastų aktyvaciją ir kaulų retėjimą, taikiniu.
Akteozidasyra pagrindinis aktyvus Rehmannia glutinosa junginys, plačiai naudojamas tradicinėje Rytų medicinoje [15,16]. Akteozidas yra stiprus antioksidantas ir turi antihepatotoksinį, priešuždegiminį ir antinociceptinį poveikį [17–20]. Anksčiau mes nustatėme, kad akteozidas mažina tirozinazės aktyvumą ir melanino biosintezę reguliuodamas ERK signalizaciją [21], apsaugo nuo reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) sukeliamo dantenų pažeidimo [22] ir slopina mikotoksinų sukeltą ląstelių pažeidimą [23]. Šie poveikiai yra glaudžiai susiję su nukleozidų gebėjimu pašalinti ROS ir reguliuoti MAPK sukeltą signalizaciją. Visų pirma, ROS siūloma tarpininkauti RANKL sukeltuose signalizacijos keliuose ir ląstelių įvykiuose osteoklastuose. Išankstinis gydymas antioksidantais slopino RANKL sukeltą NF-kB, ERK ir IkBa aktyvaciją, taip slopindamas osteoklastogenezę [24]. Šie radiniai tvirtai rodo, kad, be priešuždegiminio aktyvumo, antioksidacinis aktyvumas yra labai svarbus antirezorbciniam agentui, todėl akteozidas gali slopinti RANKL sukeltą osteoklastogenezę.
Šiame tyrime ištyrėme, ar akteozidas turi gydomąjį poveikį kaulų retėjimui. Mes ištyrėme akteozido poveikį osteoklastų diferenciacijai ir kaulų rezorbcijai bei susijusius ląstelių mechanizmus, naudodami in vitro ir in vivo eksperimentines sistemas.
Cistanche akteozidas slopina RANKL sukeltą osteoklastogenezę
Medžiagos ir metodai
Etikos pareiškimas
Gyvūnų priežiūros ir naudojimo praktikas patvirtino Chonbuk nacionalinio universiteto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo etikos komitetas (leidimo Nr. CBU 2010-0007). Visi šio tyrimo eksperimentai buvo atlikti pagal universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto gaires.
Pelės, chemikalai ir laboratoriniai reikmenys
Keturių savaičių amžiaus ICR pelių patelės buvo įsigytos iš Orient Bio Inc. (Seulas, Korėja) ir laikomos 2261 uC temperatūroje ir 5565 procentų drėgnumo 12 valandų šviesos/tamsos cikle su laisva prieiga prie maisto ir vandens. Akteozidas (3,4-dihidroksi-bfenetil-Oa-ramnopiranozil-(1R3)-4-O-kofeoil-bD-gliukopiranozidas; C29H36O15) (S1 pav.) buvo išskirtas iš Rehmannia glutinosa lapų. Prieš naudojimą akteozidas buvo ištirpintas fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ir M-CSF buvo įsigyti iš R & D Systems (Mineapolis, MN, JAV). Antikūnai, specifiniai c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa ir b-aktinui buvo gauti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). ). Antikūnai p-p38 ir p38 buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology (Danvers, MA, JAV). Serumo biocheminiams parametrams nustatyti kalcio tyrimo ir osteokalcino (OC) EIA rinkiniai buvo įsigyti atitinkamai iš BioAssay Systems (Hayward, CA, JAV) ir Biomedical Technologies (Stoughton, MA, JAV). Pelės tartratui atsparios rūgštinės fosfatazės (TRAP) tyrimo rinkinys (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, JAV) taip pat buvo naudojamas TRAP5b lygiui serume matuoti. Jei nenurodyta kitaip, papildomos cheminės medžiagos buvo gautos iš Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, JAV), o laboratorijos reikmenys buvo iš SPL Life Sciences (Pochun, Pietų Korėja).
Ląstelių kultūros
Kaulų čiulpų ląstelės buvo gautos iš 6 savaičių amžiaus ICR pelių patelių blauzdikaulio ir šlaunikaulio pagal anksčiau aprašytus metodus [25]. Kaulų čiulpų suspensija buvo inkubuojama 100- mm kultūros lėkštelėje, esant 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dienų prilipusios ląstelės buvo naudojamos kaip kaulų čiulpų makrofagai (BMM), kad sukeltų osteoklastinę diferenciaciją. Kai kurios kaulų čiulpų ląstelės taip pat buvo inkubuojamos 48 valandas be M-CSF, o prilipusios ląstelės buvo kultivuojamos osteoblastų diferencijavimo terpėje, kaip aprašyta kitur [25]. RAW264.7 makrofagų ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM), papildytoje 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS), 2 mM L-glutamino ir antibiotikais. Šios ląstelės buvo naudojamos kaip BMM ląstelių linija, siekiant ištirti akteozido poveikį osteoklastogenezei.
Osteoklastinė diferenciacija ir TRAP dažymas
KMM buvo iš anksto apdoroti įvairiomis koncentracijomis (0–50 mM).akteozido2 valandas prieš stimuliuojant 100 ng/ml RANKL. 2 ir 5 dienomis auginimo terpė buvo pakeista šviežia terpe. Po 7 dienų inkubacijos kultūros buvo fiksuotos 4 % PBS buferiniame paraformaldehide ir nudažytos TRAP naudojant Sigma Aldrich rinkinį pagal gamintojo instrukcijas. TRAP teigiamos ląstelės buvo skaičiuojamos naudojant optinę mikroskopiją, o ląstelės, turinčios 3 ar daugiau branduolių, buvo laikomos osteoklastais. RAW 264.7 ląstelės taip pat buvo veikiamos 100 ng / ml RANKL po išankstinio apdorojimo akteozidu 2 valandas, o po 7 dienų inkubacijos ląstelės buvo apdorotos dažymui TRAP.
Ląstelių gyvybingumo matavimas
Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant vandenyje tirpios tetrazolio druskos (WST) -8 reagentą. Trumpai tariant, BMM arba RAW264.7 ląstelės, kultivuotos auginimo terpėje, kurioje yra 10 procentų FBS ir antibiotikų, buvo apdorotos 10 mM akteozidu arba fenolio junginiu, pvz., kvercetinu, liuteolinu, apigeninu arba epigallocatechin-3- galatu (EGCG). WST-8 reagentas buvo įdėtas į kultūras po 48 valandų inkubacijos. Po papildomų 4 valandų inkubavimo, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, JAV), WST{10}} specifinė absorbcija buvo išmatuota esant 450 nm.
Kaulų rezorbcijos tyrimas
BMM (16105 ląstelės/ml) buvo suspenduoti a-MEM, turinčiame 50 ng/ml M-CSF ir 100 ng/ml RANKL, tada padalinti į 24-šulinėlių plokštelę, padengtą kalcio fosfato nanokristalais (OAAS{{6}). }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Pietų Korėja), esant 26104 ląstelių/cm2 tankiui su akteozidu ir be jo. Po 7 dienų inkubacijos ląstelės buvo pašalintos iš plokštelių su 5 procentų natrio hipochloritu ir optiniu mikroskopu buvo stebimas duobės susidarymas. Rezorbuota sritis taip pat buvo išmatuota vaizdo analizatoriumi ir išreikšta kontrolinės vertės procentais.
Western blot analizė
Visi baltymų lizatai buvo paruošti lizės buferyje, kaip aprašyta kitur [26]. Citozoliniai ir branduoliniai baltymai buvo paruošti, kaip aprašyta anksčiau [25]. Lygiai baltymo ekstrakto kiekiai buvo atskirti 12–15 procentų SDS-PAGE ir užpilami ant polivinildifluorido membranų. Blotai buvo tiriami pirminiais antikūnais per naktį 4 uC temperatūroje, prieš inkubuojant su antriniu antikūnu blokuojančiame buferyje 1 valandą. Dėmės buvo
sukurta naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Bekingemšyras, JK) ir veikiama rentgeno juosta (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, JAV).
MAPK aktyvumo tyrimas
Ląstelės buvo iš anksto apdorotosakteozido2 val., o po to stimuliuojama RANKL papildomai-30 min. MAPK aktyvumas buvo nustatytas naudojant imunometrinių tyrimų rinkinius, tokius kaip p-p38 kinazės tyrimo rinkinys (Assay Designs, Inc., MI, JAV), p-ERK fermento tyrimo rinkinys (Assay Designs) ir p-SAPK/JNK sumuštinis ELISA rinkinys. (Cell Signaling Technology, MA, JAV). Visos procedūros buvo vykdomos pagal gamintojo instrukcijas, o absorbcija buvo matuojama mikroplokštelių skaitytuvu.
Elektroforetinio judumo poslinkio tyrimas (EMSA)
DNR ir baltymų prisijungimo reakcijos buvo atliekamos 3{6}} min. kambario temperatūroje, 10–15 mg baltymo 20 ml buferyje, kuriame yra 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 procentai glicerolio. , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30, 000 cpm [a-32P] dCTP pažymėtų oligonukleotidų ir Klenow fragmento DNR polimerazės. Mėginiai buvo atskirti 6 procentų poliakrilamido geliais, kurie buvo išdžiovinti ir 12–24 valandas veikiami rentgeno plėvele (Eastman Kodak Co.) 270 uC temperatūroje. NF-kB specifinės oligonukleotidų pradmenų sekos buvo 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 ir 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
NF-kB liuciferazės tyrimas
RAW264.7 makrofagai 24-šulinėlių plokštelėse buvo transfekuoti 0,8 mg kB-luciferazės reporterio vektoriumi, naudojant 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo stimuliuojamos RANKL, esant akteozidui ir be jo 24 valandas. Ląstelės buvo resuspenduotos 100 ml reporterio lizės buferyje
(Promega, Madisonas, WI, JAV). Vienodas kiekis baltymų mėginių buvo dedamas į 96-šulinėlių mikroplokštes ir sumaišytas su luciferazės substratu. Liuminescencija buvo matuojama naudojant mikroplokštelės luminometrą (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Vokietija). Šiame eksperimente kaip teigiamas kB inhibitorius buvo naudojamas pralaidus NF-kB inhibitoriaus peptidas (BIOMOL, Butler Pike, PA, JAV).
Citokinų matavimas
BMM arba RAW264.7 ląstelės buvo stimuliuojamos RANKL, esant akteozidui 24-šulinėlių kultūros plokštelėse. Po 48 valandų inkubacijos kultūros supernatantai buvo surinkti ir įvertinti ELISA metodu, naudojant TNF-a-, IL-1b- ir IL-6- specifinius OptEIATM rinkinius pagal gamintojo instrukcijas.
Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (RT-PCR)
Osteoklastinių žymenų, tokių kaip c-Fos, NFATc1 ir TNF-a, mRNR ekspresija buvo nustatyta realaus laiko RT-PGR. Trumpai tariant, visa RNR buvo išgauta iš makrofagų su Trizol reagentu pagal gamintojo instrukcijas (Invitrogen). cDNR buvo susintetinta su 1 mg visos RNR, naudojant SuperScript atvirkštinę transkriptazę II ir pradmenis (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) buvo naudojamas aptikti PGR produkto kaupimąsi važiuojant dviračiu su ABI 7500 sekos aptikimo sistema (Applied Biosystems). Po 10 minučių denatūravimo 95 uC temperatūroje buvo atlikta PGR
atlikta naudojant keturiasdešimt 3-pakopinių denatūravimo ciklų 95 uC temperatūroje 15 sek., atkaitinimą 60 uC temperatūroje 1 sek. ir pratęsimą 72 uC temperatūroje 30 sek. Visos PGR reakcijos buvo atliktos bent trimis egzemplioriais, o ekspresijos lygiai buvo normalizuoti pagal namų ruošos geną HPRT toje pačioje reakcijoje. Šiame tyrime buvo naudojamos tos pačios pradmenų sekos, aprašytos kitur [7].
Intraląstelinės ROS matavimas
Pradinis 29,79-dichlordihidrofluoresceino diacetato (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmštatas, Vokietija) tirpalas buvo paruoštas DMSO ir laikomas 220 uC temperatūroje tamsoje. Trumpai tariant, BMM (106 ląstelės/ml 6-šulinėlių plokštelėse) buvo kultivuojami su 50 ng/ml M-CSF 24 valandas ir tada apdorojami įvairiomis koncentracijomis (0–10 mM)akteozido2 val. prieš stimuliavimą 100 ng/ml RANKL. Po 1 valandos bendro inkubavimo šios ląstelės vėliau buvo inkubuojamos su 25 mM DCFH-DA 30 minučių. Žalia 29,79-dichlorfluoresceino (DCF) fluorescencija buvo užfiksuota esant 515 nm (FL 1), naudojant FACS VantageH sistemą (Becton-Dickinson, San Chosė, CA, JAV), ir 10,000 įvykiai buvo skaičiuojami vienam mėginiui.
Kiaušidžių pašalinimo sukeltos osteoporozės sukėlimas
Šiam tyrimui buvo naudojamos ICR pelių patelės (6 savaičių amžiaus). Pelėms buvo atlikta fiktyvi operacija (Sham, n =10) arba chirurginė kiaušidžių pašalinimas (OVX, n=20) taikant anesteziją. Praėjus savaitei po operacijos, OVX pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į 2 grupes po 10 pelių: dvišalis OVX ir dvišalis OVX, papildytas 200 ml.
PBS, turintis 1 mM akteozido per burną (AC grupė). Geriamasis akteozidas buvo vartojamas kartą per 3 dienas 8 savaites po operacijos ir
toks pat kiekis PBS buvo skiriamas „Sham“ ir „OVX“ grupėms. Praėjus 1 dienai po paskutinio vartojimo, pelės buvo numarintos, o po to buvo analizuojami biocheminiai serumo parametrai ir 3-dimensinė kaulų struktūra.
Serumo biocheminių parametrų nustatymas
Kraujo mėginiai buvo paimti per širdies punkciją, o serumas buvo paimtas centrifuguojant. Biocheminių parametrų analizei serumo mėginiai buvo laikomi 280 uC temperatūroje. IL-1b ir IL-6 koncentracija serume buvo apskaičiuota naudojant ELISA rinkinį, kaip aprašyta aukščiau, o šarminės fosfatazės (ALP) aktyvumas buvo nustatytas naudojant biocheminį kolorimetrinį tyrimą, kuris matuoja p kiekį. -nitrofenolis, pagamintas iš p-nitrofenolio fosfato substrato, kaip aprašyta kitur [27]. Norint įvertinti kaulų formavimosi ir rezorbcijos biomarkerius, pagal gamintojų instrukcijas taip pat buvo nustatytas OC, kalcio ir TRAP5b kiekis serume.
Kaulų sandaros ir morfometrinių parametrų analizė
Pelių (Sham, OVX ir AC grupių) šlaunikaulis buvo išpjaustytas ir užpildytas fiziologiniu tirpalu mechaniniam tyrimui. Šlaunikaulio mechaninis stiprumas buvo matuojamas taip, kaip aprašyta kitur [28]. Lūžio apkrova buvo užfiksuota kaip didžiausia jėga niutonais toje vietoje, kur lūžta dešiniojo šlaunikaulio veleno vidurys. Be to, kiekvieno gyvūno šviesus šlaunikaulis buvo histomorfometriškai ištirtas naudojant mikrokompiuterinės tomografijos (mikro-CT) sistemą (SkyScan 1076 mikrofokuso rentgeno sistema, Kontich, Belgija). Trumpai tariant, 4 procentų formaldehido saugykloje esantys kaulai buvo paviršutiniškai išdžiovinti ant popierinio audinio, prieš suvyniojant į plastikinę „klijuojančią plėvelę“ arba parafilmą, kad nuskaitymo metu neišdžiūtų. Kiekvienas plastiku apvyniotas kaulas buvo patalpintas į plastiko/polistireno putplasčio vamzdelius, kurie buvo sumontuoti vertikaliai horizontaliai 1076 skaitytuvo mėginių kameroje.
mikro-CT vaizdavimas. Skenavimas buvo atliktas naudojant 100 kV šaltinio įtampą ir 140 mA šaltinio srovę su 35 mm skiriamąja geba.
Trimačiai šlaunikaulio trabekulinių kaulų modeliai buvo rekonstruoti naudojant SkyScan CT Analyzer 1.11 versiją. Struktūriniai parametrai, tokie kaip trabekulinio kaulo mineralinis tankis (KMT, g/cm3), kaulo tūrio procentas (kaulo tūris (BV)/audinio tūris (TV), proc.), storis (Tb.Th, mm), atsiskyrimas (Tb.Sp). , mm) ir skaičius (Tb.N, 1/mm) buvo išmatuotas.
Osteogeninės diferenciacijos ir mineralizacijos tyrimas Kaulų čiulpų ląstelės, kultivuotos {{{{10}}}} šulinių auginimo plokštelėse, buvo apdorotos DAG (10 nM deksametazono, 50 mM askorbo rūgšties ir 20 mM b-glicerofosfato). 10 mM akteozido. Po 2 savaičių diferenciacijos ląstelės buvo fiksuotos lediniu 70 procentų (tūrio / tūrio) etanoliu 1 valandą ir 30 minučių kambario temperatūroje dažytos 0, 2 procento alizarino raudonuoju S distiliuotame vandenyje. Po to, kai ląstelės buvo pašalintos ir išdžiovintos ore, ląstelių kultūros plokštelės buvo įvertintos šviesos mikroskopu, naudojant apverstą mikroskopą (Nikon TS100, Japonija). Norint kiekybiškai įvertinti raudonų dažų kiekį, dėmė buvo eliuuojama 10 procentų acetilpiridinio chloridu, kratant 20 minučių, o absorbcija buvo matuojama esant 560 nm. Ląstelių sluoksniuose nusėdusio kalcio kiekis taip pat buvo matuojamas naudojant Calcium C rinkinį (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Be to, kaulams specifinių mRNR žymenų, pvz., su bėgimu susijusio transkripcijos faktoriaus -2 (Runx2), osterikso, kaulo sialoproteino (BSP) ir OC, ekspresija buvo nustatyta realiojo laiko RT-PGR. Šių žymenų oligonukleotidiniai pradmenys buvo sukurti su mažesniais nei 200 bp gaminiais, naudojant Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems), kaip aprašyta kitur [27].
cistanche akteozidas skatina kaulų formavimąsi
Rezultatai
Akteozidas, priklausomai nuo dozės, slopina makrofagų sukeliamą osteoklastų susidarymą
Siekiant patikrinti akteozido poveikį BMM diferenciacijai į osteoklastus, ląstelės buvo kultivuojamos su įvairių koncentracijų (0–20 mM) akteozidu 7 dienas, esant 50 ng/ml M-CSF ir 100 ng/ml. RANKL. Akteozidas sumažino osteoklastų skaičių priklausomai nuo dozės. Kai ląstelės buvo iš anksto apdorotos 10 mM akteozidu 2 valandas, osteoklastų skaičius sumažėjo 43 procentais, palyginti su ląstelėmis, papildytomis M-CSF ir RANKL (1A pav.). 1B pav. parodyta RANKL sąlygota osteoklastų diferenciacija ir jos slopinimas kombinuoto gydymo akteozidu. Atsižvelgiant į šį rezultatą, išankstinis gydymas akteozidu sumažino RANKL stimuliuojamą RAW264.7 ląstelių diferenciaciją ir osteoklastų susidarymą (1C ir D pav.). Palyginus antiosteoklastinį akteozido potencialą ant KMM su kelių fenolio junginių antiosteoklastiniais potencialais esant tokiai pačiai koncentracijai (10 mM), liuteolinas pasižymėjo didžiausiu aktyvumu (2A pav.). Tačiau pats liuteolinas, kvercetinas ar apigeninas sumažino ląstelių gyvybingumą (2B pav.). Visi junginiai slopino osteoklastinę diferenciaciją RAW264.7 makrofagais su tokia santykine veikla: liuteolinas. kvercetinas=apigeninas .
Cistanche akteozidas slopina Osteoklastą
