Pentraksino{0}}tarpininkaujamas komplemento aktyvinimas kiaulių inkstų išemijos / reperfuzijos pažeidimo modelio atveju

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella ir kt

SANTRAUKA

Pentraksinai yra evoliuciškai konservuotų modelio atpažinimo molekulių šeima, turinti pagrindinį vaidmenį įgimtame imunitete ir uždegimuose, pavyzdžiui, patogenų opsonizacijoje bakterinių ir virusinių infekcijų metu. Visų pirma, įrodyta, kad ilgas Pentraxin 3 (PTX3) reguliuoja keletą kraujagyslių ir audinių uždegimo aspektų per kietųjų organų transplantaciją.

Mūsų tyrimas ištyrė PTX3, kaip galimo komplemento aktyvinimo moduliatoriaus, vaidmenį inkstų išemijos / reperfuzijos (I / R) pažeidimo kiaulių modelyje. Mes parodėme, kad I / R sužalojimų sukeltos ankstyvos PTX3 nuosėdos peritubuliniame ir glomeruliniame kapiliarų lygiuose. Konfokalinė lazerinė skenavimo mikroskopija atskleidė PTX3 nuosėdas, kurios lokalizuojasi kartu su CD31 ir endotelio ląstelėmis. Be to, PTX3 buvo susijęs su infiltruojančiais makrofagais (CD163), dendritinėmis ląstelėmis (SWC3a) ir miofibroblastais (FSP1). Visų pirma, mes parodėme reikšmingą PTX{10}}tarpininkaujantį klasikinio (C1q tarpininkaujamo) ir lektino (MBL tarpininkaujamo) komplemento takų aktyvavimą. Įdomu tai, kad PTX3 nuosėdos buvo lokalizuotos kartu su galinio komplemento komplekso (C5b-9) aktyvavimu endotelio ląstelėse, o tai rodo, kad PTX3-tarpininkaujant komplemento aktyvacija daugiausia įvyko inkstų kraujagyslių lygmenyje. Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad PTX3 gali būti galimas terapinis taikinys, siekiant užkirsti kelią komplemento sukeltam I / R pažeidimui.

Korespondencija:Giuseppe Castellano

Raktiniai žodžiai:išemijos / reperfuzijos pažeidimas, komplemento sistema, pentraksinas 3,inkstas, klasikinis kelias

Cistanche tubulosa apsaugo nuo inkstų ligos, spustelėkite čia, kad gautumėte mėginį

ĮVADAS

Išemijos-reperfuzijos (I/R) pažeidimas yra pagrindinė ūminio susirgimo priežastisinkstassužalojimaspo transplantacijos ir pasižymi reikšmingu komplemento sistemos aktyvavimu [1, 2]. Pagal šį scenarijų endotelio ląstelės (EC) vaidina lemiamą vaidmenį netinkamai prisitaikant po I/R, o tai sukelia ankstyvą fibrozę dėl endotelio į mezenchiminį perėjimą (EndMT) [3]. Reperfuzijos fazės metu komplementas organizuoja imunologinius ir uždegiminius procesus, prisidedant prie įvairių imuninių ir uždegiminių ligų [2–5]. Kiti esminiai įgimtos imuninės sistemos humoralinės rankos komponentai yra pentraksinai, kurie, kaip manoma, atlieka esminį vaidmenį kraujagyslių biologijoje [6].

Pentraksinai yra multimerinių tirpių baltymų šeima [6], kurios pagal struktūrą skirstomos į trumpas ir ilgas šeimas [7]. Šie evoliuciškai konservuoti baltymai yra ūminės fazės efektoriai, kurie tarnauja kaip uždegimo pradžios jutikliai ir greitai didėja plazmoje infekcijos metu [8]. Ilgasis pentraksinas 3 (PTX3) yra tirpi modelio atpažinimo molekulė, kuri yra labai svarbi įgimtai imuninei apsaugai ir gali suaktyvinti komplemento sistemą [9–11].

Visų pirma, PTX3 sukėlė klasikinio ir lektino kelio aktyvavimą, jungdamasis su C1q, MBL, Ficolin-2 ir gali paveikti alternatyvų kelią per CFH [10–12].

Priešingai nei kiti kepenyse gaminami pentraksinai kraujyje (ty CRP), PTX3 gali išskirti uždegimo vietoje esančios ląstelės, pavyzdžiui, iš mononuklearinių fagocitų, dendritinių ląstelių, fibroblastų ir EC [9], veikiančių parakrininiu būdu. [13]. PTX3 taip pat saugomas paruošta forma neutrofiluose, lokalizuotas specifinėse granulėse ir išskiriamas reaguojant į mikrobų fragmentų atpažinimą [14]. EB PTX3 ekspresiją lengvai sukelia TNF ir IL-1, suteikdamas perėjimą nuo ramaus, priešuždegiminio fenotipo prie prokoaguliuojančios ir priešuždegiminės būsenos, taip stipriai reguliuojant mikrovaskulinę funkciją [7, 8 ]. Dėl šios priežasties PTX3 lygiai buvo apibūdinti kaiplėtinisinkstasliga, PTX3 baltymų kiekio padidėjimas buvo koreliuojamas su GFR sumažėjimu ir širdies ir kraujagyslių komplikacijomis, tačiau vis dar mažai žinoma apie PTX3 vaidmenį ankstyvosiose situacijose kaip I/R sukeltas ūminis.inkstassužalojimas [15, 16].

PTX3 vaidmuo sergant inkstų uždegiminėmis ligomis yra dvivalentis, iš šono baltymas gali suaktyvinti klasikinius ir lektino kelius, skatinančius pradinį uždegimą ir sužalojimą [10–12]. Kita vertus, PTX3 moduliuojamo komplemento aktyvacijos N-galinis domenas susilpnino leukocitų prisitraukimą ir slopino intersticinę fibrozę esant ūminiam inkstų pažeidimui, skatindamas audinių taisymą [17–20].

Komplementas vaidina pagrindinį vaidmenį I/R sužalojimo sukelto ūminio patofiziologijojeinkstassužalojimas[21, 22]. Kiaulių inkstų I/R pažeidimo modelyje parodėme pagrindinį Komplemento sistemos aktyvinimo vaidmenį skatinant EndMT ir ankstyvą fibrozę, dalyvaujant tiek klasikiniams, tiek lektino keliams [23]. Be to, parodėme, kad terapinis šių komplemento kelių slopinimas rekombinantiniu C1-INH (rhC1INH) žymiai sumažino komplemento nusėdimą, sumažino infiltruojančių uždegiminių ląstelių prisitraukimą ir kanalėlių intersticinį pažeidimą [23]. Šiuos rezultatus taip pat patvirtino Delpech PO ir kt. [24]; reikšmingas C1q, MASP ir C4d glomerulų ir kanalėlių nusėdimo moduliavimas buvo įvertintas praėjus 30 minučių po reperfuzijos, o tai rodo pagrindinį C1-INH vaidmenį neutralizuojant klasikinius ir lektino kelius.

Šiame tyrime ištyrėme galimą PTX3 dalyvavimą tarpininkaujant ankstyvam komplemento aktyvavimui esant inkstų I / R pažeidimui, apibūdindami skirtingus PTX3 ląstelių šaltinius.

REZULTATAI

PTX3 ekspresuoja endotelio ląstelės ir imuninę sistemą infiltruojančios ląstelės I / R pažeidimo kiaulių modelyje

Pirma, mes ištyrėme PTX3 buvimą šilto I / R sukelto inkstų pažeidimo kiaulių modelyje. Mes stebėjome labai ribotas PTX3 nuosėdas normaliame audinyje (1A pav.). I/R pažeidimas sukėlė difuzinį PTX3 nusėdimą jau po 15 minučių po reperfuzijos (1B pav., 1C) tubulointersticinėje srityje (1E pav.), Peritubuliniuose kapiliaruose (1D pav.; rodyklė) ir glomerulų lygiuose (1D pav.). PTX3 nuosėdos vis dar buvo aptinkamos praėjus 1 valandai po reperfuzijos peritubulinių kapiliarų lygyje (1G pav.). Ankstesniame darbe [23] parodėme, kad pagrindiniai I/R pažeidimo bruožai yra kanalėlių epitelio ląstelių apoptozė ir infiltruojančių uždegiminių ląstelių, tokių kaip monocitai, dendritinės ląstelės ir limfocitai, įdarbinimas. Nepaisant to, atlikdami įprastą histologinį vertinimą (papildomas 1 paveikslas), parodėme, kad 30 minučių šilta išemija, po kurios 15 minučių reperfuzijos sukeltas ankstyvas kanalėlių intersticinis pažeidimas, kuriam būdinga didesnė kapiliarų perkrova ir židininė citoplazminė inkstų kanalėlių epitelio vakuolizacija, palyginti su baziniu. sąlyga.

Norėdami toliau apibūdinti PTX3 nuosėdų lokalizaciją ląstelėse ir įvertinti galimą jo poveikį moduliuojant uždegiminį atsaką ir sužalojimą, atlikome dvigubo imuninio dažymo ir konfokalinės mikroskopijos analizę. PTX3 baltymo ekspresija buvo aptikta daugumoje EB peritubuliniame (2A pav.) ir glomeruliniame (2B pav.) kapiliarų lygiuose, praėjus 15 min. po reperfuzijos.

Gerai žinoma, kad I/R sužalojimui būdingas padidėjęs įgimto ir adaptyvaus imuninio atsako aktyvavimas, įskaitant uždegiminių ląstelių judėjimą į sergantį organą, kuris dar labiau sustiprina sužalojimą per imunines ląsteles ir komplemento sistemą [25]. Mūsų kiaulių modelyje mes taip pat pastebėjome, kad jau praėjus 15 minučių po reperfuzijos, tankus uždegiminis infiltratas, daugiausia sudarytas iš makrofagų ir dendritinių ląstelių kanalėlių-intersticinėje srityje. Mes nustatėme, kad abi šios antigeną pateikiančios ląstelės pasižymėjo padidėjusia PTX3 ekspresija, palyginti su T0, nes pastebėjome padidėjusį CD163 plus /PTX3 plus (2E, 2F, 2K pav.) ir SWC3a plus /PTX3 plus skaičių. (2G, 2H, 2L pav.) ląstelės kanalėlių intersticiniame lygyje esant T15.

PTX3 ekspresija gali prisidėti prie EndMT I / R pažeidimo atveju

Ankstesniuose stebėjimuose parodėme, kad I/R sužalojimas buvo atsakingas už EndMT [26, 27], kuriam būdingas EC įgytas mezenchiminis fenotipas, prarandant specifinius endotelio žymenis ir padidinant mezenchiminius žymenis, pvz., specifinius fibroblastams. baltymas 1 (FSP-1), neuronų kadherinas (N-kadherinas) ir alfa lygiųjų raumenų aktinas (alfa-SMA). Taigi, mes ištyrėme, ar EC PTX3 ekspresija gali paveikti šį procesą. Kaip ir tikėtasi, kai tyrėme alfa-SMA ekspresiją, kaip aktyvuoto miofibroblasto žymenis, neradome jokios bendros lokalizacijos tarp alfa-SMA ir PTX3 (2C, 2D pav.). Priešingai, per visą stebėjimo laikotarpį stebėjome tubulointersticinių FSP1 plius / PTX3 ir miofibroblastų padidėjimą (2K–2M pav.).

PTX3 nuosėdos yra susijusios su komplemento sistemos aktyvavimu

Galiausiai ištyrėme, ar PTX3 indėliai buvo susiję su komplemento aktyvavimu. Iš tiesų, kaip ir kiti pentraksinų šeimos komponentai, PTX3 gali reguliuoti klasikinio komplemento kelio aktyvavimą [7]. Norėdami apibrėžti ryšį tarp PTX3 ir komplemento aktyvacijos, atlikome dvigubo žymėjimo imunofluorescenciją, kad įvertintume PTX3 ir terminalo ekspresiją. Komplemento kompleksas, C5b-9, naudojant antikūną, nukreiptą prieš C9-neoepitopą. Pastebėjome reikšmingą PTX3 ir C5b{12}} nuosėdų lokalizaciją (3A, 3B pav.). Komplemento terminalo kompleksas buvo lokalizuotas peritubuliniame lygyje, taip pat peritubuliniuose kapiliaruose kartu su endotelio ląstelių sluoksniu, kaip mes įrodėme anksčiau [23, 28]. Kadangi PTX3 gali suaktyvinti komplemento sistemą per klasikinius ir lektino kelius, įvertinome C1q ir MBL nusėdimą inkstų parenchimoje. Įdomu tai, kad C1q (3E, 3F pav.) ir MBL (3C pav., 3D) nuosėdos daugiausia buvo aptiktos intersticiniame ir kapiliariniame lygyje (nuo 3C iki 3F pav.), kaip aprašyta anksčiau [23] ir kolokalizuoti su PTX3 nuosėdomis.

C1-inhibitorius trukdo PTX3 prisijungimui prie endotelio ląstelių

Ankstesniame darbe [23] parodėme, kad C1-inhibitorių skyrimas žymiai sumažino komplemento nusėdimą, sumažino infiltruojančių uždegiminių ląstelių prisitraukimą ir kanalėlių intersticinį pažeidimą. Todėl ištyrėme PTX3 ekspresijos lygį rhC1-INH gydytiems gyvūnams. Mes nustatėme, kad C1-inhibitoriaus infuzija sumažino PTX3 nuosėdas peritubiniuose kapiliaruose ir intersticiniame lygyje po 15 minučių po reperfuzijos (4A pav.).

Be to, norėdami paremti hipotezę, kad PTX3 nuosėdų sumažėjimas rhC1-INH gydytiems gyvūnams buvo susijęs su endotelio pažeidimo slopinimu, atlikome eksperimentus in vitro ir įvertinome rhC1-INH ir PTX3 prisijungimą kultivuotas EC normaliomis sąlygomis arba esant ląstelių stresui (4B pav.). FACS analizė parodė, kad normaliomis sąlygomis EC nesurišo nei rhC1-INH, nei PTX3. Remiantis ankstesniu mūsų tyrimu [26], mes pastebėjome, kad rhC1-INH prisijungimas prie H2O2-stimuliuojamo EB padidėja ląstelėse, palyginti su bazinėmis sąlygomis. Be to, nesant rhC{11}}INH, PTX3 gali surišti aktyvuotą EC. Įdomu tai, kad kai H2O2-aktyvuota EC buvo inkubuojama su PTX3 ir rhC1-INH, pastebėjome, kad C1INH galėjo apsaugoti EC blokuodamas PTX3 surišimą.

DISKUSIJA

Šiame tyrime parodėme PTX3 nusėdimą ankstyvoje inkstų I / R pažeidimo fazėje ir galimą jo indėlį į EndMT vystymąsi. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad PTX3-tarpininkaujantis komplemento aktyvinimas vyksta daugiausia kraujagyslių lygmenyje, kartu su C1q ir MBL – komplemento kaskados klasikinių ir lektino kelių atpažinimo molekulėmis.

I/R sužalojimas sukelia ryškią uždegiminę reakciją, kuriai būdinga komplemento aktyvacija, laisvieji radikalai be deguonies ir priešuždegiminių citokinų gamyba, todėl suaktyvėja kraujagyslių endotelis ir periferiniai leukocitai [29, 30]. I/R pažeidimo metu komplemento aktyvinimas lemia komplemento komponentų nusėdimą ant pažeistos ir disfunkcinės EB paviršiaus membranos, tuo pačiu metu generuojantis anafilatoksinų ir sustiprėjant uždegiminiam procesui [31]. Uždegimo metu PTX3 greitai didėja ir gali atlikti pagrindinį vaidmenį moduliuojant endotelio atsaką. Iš tiesų, PTX3 buvo nurodytas kaip galimas kraujagyslių endotelio disfunkcijos biomarkeris sergant keliomis ligomis, įskaitant lėtines.inkstasliga, preeklampsija ir kelios kraujagyslių ligos [7, 16, 17, 32]. Taip pat parodėme, kad PTX3 yra susijęs su kitomis kraujagyslių komplikacijomis, tokiomis kaip arterioveninės fistulės nesėkmė hemodializuojamiems pacientams [33]. Šie stebėjimai rodo, kad PTX3 gali būti tiltas tarp uždegiminio atsako ir endotelio disfunkcijos [34]. Remiantis šiais tyrimais, mes stebėjome PTX3 nuosėdas endotelio lygyje jau po 15 minučių po reperfuzijos (2A, 2B pav.). Mūsų rezultatai taip pat parodė, kad ankstyvoje I/R pažeidimo fazėje PTX3 buvo kolokalizuotas su miofibroblastų žymekliu FSP-1 (2I pav., 2J), bet ne su alfa-SMA, žymekliu, išreikštu aktyvuoto miofibroblasto (2C pav., 2D). Apibendrinant, šie duomenys gali reikšti, kad endotelio disfunkcija ir EndMT procesas [35], pastebėtas I/R gyvūnams [26], pirmiausia pasireiškė EC, ekspresuojančiame PTX3.

Ryšys tarp PTX3 ir uždegiminių ląstelių yra plačiai pripažintas. Šiame darbe mes konkrečiai sutelkėme dėmesį į būdingą PTX3 poveikį intersticinei leukocitų, kurie yra pagrindinis PTX3 šaltinis, infiltracijai [36]. Visų pirma, po 15 minučių po reperfuzijos nustatėme makrofagus ir dendritines ląsteles, išreiškiančias didesnį PTX3 kiekį (2E–2H pav.). Šie duomenys atitinka vis daugiau įrodymų, rodančių, kad įgimtas imunitetas yra svarbus tarpininkaujant ankstyvam I/R pažeidimui [23]. Ankstyvas komplemento aktyvavimas inkstų audinyje po I / R pažeidimo sukelia kelių uždegiminių mediatorių, kurie padidina imuninių ląstelių įdarbinimą, generavimą [21, 23, 37, 38]. Naujausi tyrimai parodė, kad PTX3 yra vienas iš pagrindinių tinklo komponentų, organizuojančių uždegiminį atsaką, kurį sukelia I/R sužalojimas [39]. Skirtinguose eksperimentiniuose I/R sužalojimo modeliuose PTX3 gali atlikti du priešingus vaidmenis tam tikriems audiniams [40, 41]. Ankstyva PTX3 gamyba yra susijusi su inkstų pažeidimu, nes tai sukelia ankstyvą endotelio adhezijos molekulių ir chemokinų ekspresiją, kurie pagreitina vietinį netinkamą uždegiminį atsaką.

Priešingai, užsitęsusi vietinė PTX3 gamyba užkerta kelią per dideliam organų uždegimui ir disfunkcijai [41].

PTX3 yra papildinio kaskados moduliatorius [9, 42]; tai atitinka pleiotropines PTX3 savybes, rodančias dvigubą PTX3, kaip įgimto imuninio atsako moduliatoriaus arba stiprintuvo, vaidmenį [39]. Iš pradžių PTX3 aktyvuoja Komplementą surišdamas C1q ir MBL [43]; tačiau anksti padidėjusį uždegimą reikia apriboti tikslinėje srityje. Todėl PTX3, pritraukdamas H faktorių arba slopindamas angiogenezę, taip pat gali sumažinti uždegiminį atsaką ir komplemento aktyvaciją, išsaugodamas inkstų parenchimą nuo uždegiminių pažeidimų [43]. Nors graužikų I/R komplemento aktyvacija daugiausia lokalizuota kanalėlių lygyje [44], reperfuzijos fazės metu endotelis yra pagrindinis įvairių priešuždegiminių agentų, įskaitant komplemento mediatorius, taikinys [2]. Anksčiau įrodėme, kad kiaulių I/R sužalojimo modelyje, taip pat pacientams, sergantiems DGF, Komplemento sistema suaktyvėja ankstyvoje fazėje, peritubiniuose kapiliaruose, intersticijoje ir glomerulų endotelyje [23]. Mūsų duomenys parodė aiškų C5b-9 nuosėdų lokalizaciją ant PTX3 ir EC praėjus 15 minučių po reperfuzijos (3A, 3B pav.). Todėl atrodo, kad inkstų endotelis yra vyraujanti PTX3-tarpininkaujamo komplemento aktyvinimo vieta ankstyvoje I/R pažeidimo fazėje tiek ikiklinikinėje, tiek klinikinėje aplinkoje.

Pentraksinų sąveika su C1q ir jo vaidmuo aktyvuojant klasikinį komplemento kelią yra gerai aprašyti [45–47]. Įgimto imuninio atsako kontekste PTX3 gali susieti skirtingus komplemento komponentus ir moduliuoti komplemento aktyvavimą [43, 48]. PTX3 suaktyvina komplementą surišdamas C1q [49]. Mūsų gyvūnų modelio rezultatai aiškiai parodė, kad PTX3 gali tarpininkauti klasikinio kelio aktyvavimui, sąveikaudamas su C1q (3E, 3F pav.). Be to, PTX3 taip pat moduliuoja komplemento lektino kelią, kaip parodyta 3C paveiksle, 3D. MBL suriša PTX3 per savo į kolageną panašų domeną [45], o MBL/PTX3 kompleksai įdarbina C1q ir sukelia C3 ir C4 nusėdimą ant tikslinių ląstelių paviršių.

Apskritai šie rezultatai rodo pagrindinį PTX3 vaidmenį tarpininkaujantinkstasžala dėl I/R sužalojimo, kuri gali turėti svarbių pasekmių į komplementą nukreiptai terapijai esant inkstų I/R pažeidimui.

Ankstesniame tyrime [26] tyrėme komplemento dalyvavimą tarpininkaujant EB aktyvacijai, naudodami rekombinantinę C1-INH formą, stiprų klasikinio ir lektino komplemento kelių proteazių inhibitorių (C1r, C1s, ir MASP2). Tame pačiame gyvūnų modelyje parodėme (4A pav.), kad terapinis abiejų takų slopinimas rhC1INH sumažino PTX3 nuosėdas peritubuliniuose kapiliaruose ir intersticiniame lygyje po 15 minučių po reperfuzijos. Šie duomenys, patvirtinti in vitro EB rezultatais (4B pav.), leido mums daryti prielaidą, kad rhC1INH gali apsaugoti pažeistą EC, blokuodamas PTX3 surišimą. Literatūroje yra duomenų apie C1-INH prisijungimą prie endotelio adhezijos molekulių, išreikštų aktyvuotame endotelyje, vadinamų selektinais, ypač P ir E-selektinais [50, 51]. Šis prisijungimas prie EB gali trukdyti endotelio ir leukocitų sąveikai uždegimo metu ir yra dar vienas svarbus priešuždegiminis mechanizmas [50, 51]. Todėl iškėlėme hipotezę, kad rh-C1INH gali surišti aktyvuotą EC ir tarpininkauti vietiniam komplemento aktyvacijos ir uždegiminio proceso reguliavimui. Ankstesniuose tyrimuose mes įrodėme, kad komplementas yra susijęs su I/R pažeidimu ir kitomis imuninės sistemos sukeltas inkstų ligas [38, 52–54]. Komplemento aktyvavimo mechanizmai šiame gyvūnų modelyje gali turėti svarbių pasekmių interpretuojant duomenis, kurių tikimasi žmogaus aplinkoje. Norint sėkmingai plėtoti terapines intervencijas, nukreiptas į komplemento aktyvavimą [36, 54], būtina nustatyti kiaulių duomenų pagrįstumą, palyginti su tuo, kas vyksta klinikinėmis aplinkybėmis. Kadangi šis tyrimas apsiriboja stebėjimo tyrimais, reikia atlikti tolesnius eksperimentus, kad būtų galima apibūdinti tarpusavyje susijusius PTX3 ir komplemento mechanizmus, kurie galėtų pabrėžti naujas terapines strategijas. Remiantis aukščiau pateiktais rezultatais, mūsų duomenys patvirtina hipotezę, kad PTX3 gali reguliuoti kelis komplemento sukeltos I / R sužalojimo aspektus ir taip būti potencialus terapinis taikinys.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Inkstų I/R traumos kiaulių modelis

Inkstų I/R pažeidimo gyvūnų modelis buvo sukurtas taip, kaip aprašyta anksčiau [23]. Sveikatos apsaugos ministerijos etikos komitetui pritarus, 4-mėnesių amžiaus didelių baltųjų kiaulių patelės (n=8, n=4 grupei, 20 kg) buvo apdorotos. eksperimentinė atvira chirurginė procedūra taikant bendrąją nejautrą. Prieš anestezijos sukėlimą gyvūnai nevalgė 24 valandas. Elektrokardiograma, širdies susitraukimų dažnis, hemoglobino prisotinimas deguonimi, kvėpavimo dujų sudėtis, kvėpavimo dažnis, kvėpavimo tūris, kvėpavimo takų slėgis, sistolinis arterinis kraujospūdis ir centrinės venos slėgis buvo nuolat stebimi ir registruojami automatiškai (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinkis, Suomija) . Kairioji inkstų arterija ir vena buvo izoliuotos, o kraujagyslės kilpa buvo išdėstyta aplink inkstų arteriją su stačiakampiu spaustuku. Inkstų biopsija buvo atlikta prieš išemiją (T0). Tada išeminė fazė buvo sukelta (30 min.), traukiant kraujagyslės kilpą. Po 15, 30 ir 60 minučių po reperfuzijos buvo atliktos kelios biopsijos; gyvūnai buvo numarinti praėjus 24 valandoms po chirurginės procedūros. Dalis kiekvieno biopsijos mėginio buvo nedelsiant užšaldyta optimalioje pjovimo temperatūroje (Tissuetek, Pittsburgh, PA) ir laikoma skystame azote. Kita dalis buvo fiksuota buferiniame formaline (4 procentai) 12 valandų ir standartinėmis procedūromis įterpta į parafiną.

Mikroskopinis tyrimas

Parafinu įterpti inkstų mėginiai iš inkstų biopsijų buvo naudojami įprastiniam histologiniam dažymui (H&E, periodinė rūgštis-Schiff). Vaizdai buvo gauti naudojant „Aperio ScanScope CS2“ įrenginį („Aperio Technologies“, Vista, CA, JAV). Kanalėlių-intersticiniai ir glomerulų pažeidimai buvo įvertinti naudojant kokybinę analizę, kurią atliko du stebėtojai (CD, MR), kurie nežinojo apie jų kilmę.

Antikūnai

Šiame tyrime naudojami pirminiai antikūnai atpažino šiuos antigenus: PTX3 (MNB4: tiesiogiai prieš PTX3 N-galo domeną, Exira Life Sciences In., Larsen, Šveicarija); CD163 (monocitai/makrofagai, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritinės ląstelės, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (specifinis fibroblastų baltymas 1, Abcam, Kembridžas, JK);alfa lygiųjų raumenų aktinas (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, JAV); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Jungtinė Karalystė); MBL (3E7: tiesiogiai prieš MBL angliavandenių atpažinimo domeną, Hycult biotechnology, Uden, Nyderlandai) ir C9 neoantigeną (aE11, Hycult biotechnology). Kryžminis reaktyvumas buvo patvirtintas iš anksto inkubuojant specifinius antikūnus prieš juos naudojant su žmogaus peptidais, naudojamais jiems auginti. Išankstinis inkubavimas panaikino specifinį kiaulių audinių dažymą.

Audinių imunofluorescencija ir konfokalinė lazerinė skenavimo mikroskopija

PTX3 signalo apibūdinimas ir lokalizavimas buvo tiriamas sušaldytame audinyje, įtrauktame į OCT terpę (Tissue-Tek). Objektyvai buvo inkubuojami su 5 procentų triušio serumu 1 valandą 37 °C temperatūroje. Tada stikleliai buvo inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje su specifiniais antikūnais. Po trijų plovimų PBS, stikleliai buvo inkubuojami su atitinkamais antriniais antikūnais (Alexa Flour 488 ir 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Visos sekcijos buvo nudažytos TO-PRO-3 (molekuliniais zondais). Neigiamos kontrolės buvo paruoštos su nereikšmingais antikūnais. Pjūviai buvo analizuojami naudojant Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Vokietija) konfokalinį lazerinį skenavimo mikroskopą. Infiltruojančių ląstelių skaičius buvo išmatuotas mažiausiai 10 didelės galios (x630) laukų per pjūvį dviejų nepriklausomų stebėtojų, apakusių nuo stiklelių kilmės. Galutinis skaičius buvo dviejų matavimų vidurkis. Jokiu būdu stebėtojų kintamumas nebuvo didesnis nei 20 procentų.

Ląstelių kultūros ir srauto citometrijos analizė

Žmogaus bambos venų endotelio ląstelės (HUVEC, EC) buvo įsigytos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC-LGC standartai, Sesto San Giovanni, Italija). EB buvo auginamas jų rekomenduojamoje terpėje EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Vokietija). EC buvo padengtas 1{{10}},000ląstelių/cm2 tankiu ir buvo stimuliuojamas apdorojimu H2O2 (3 proc. , 1 valanda). Tada bazinis ir stimuliuojamas EK buvo du kartus plaunamas PBS ir pašalintas naudojant PBS-EDTA 2 mM ir tripsiną 0,001 ×. Tada ląstelės buvo resuspenduojamos PBS ir atitinkamai inkubuojamos su PTX3 (rekombinantinis žmogaus PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Vokietija) (1 ug/ml) ir (arba) rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug). /ml) 60 min. Tris kartus nuplovus PBS 1X, ląstelės buvo resuspenduojamos srauto citometrijos (FACS) buferyje (fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH 7,2, 0,2 proc. galvijų serumo albumino ir 0,02 proc. natrio azido) ir inkubuojamos su FCR blokuojančiu reagentu (Miltenyi Biotec). 10 min kambario temperatūroje. Po blokavimo EC buvo inkubuojamos su triušio anti-žmogaus C1-INH (pateikia prof. M. Daha, Leideno universitetas, skiedimas 1//100) ir (arba) su žiurkės anti-PTX3 (MNB4, Exira Life). Sciences In., 1/20 praskiedimas) kambario temperatūroje 30 min. ir plaunamas FACS buferiu. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su ožkų anti-triušio IgG PE (Molecular Probes, 1/100 praskiedimas) arba (su anti-žiurkės IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 praskiedimas) kambario temperatūroje 30 minučių ir plaunamos tris kartus. Ląstelės buvo analizuojamos naudojant FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, JAV) ir Kaluza programinę įrangą. Teigiamumo sritis buvo nustatyta naudojant izotipą suderintą mAb, ir iš viso buvo gauti 104 kiekvieno mėginio įvykiai. Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD) ir lyginami atitinkamai naudojant dispersijos analizę arba suporuotą Stjudento t testą. Skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingais, kai p reikšmės buvo mažesnės nei 0.05. Duomenys buvo analizuojami naudojant Statview programinės įrangos paketą (5.0 versija) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Grafikai buvo rodomi naudojant GraphPad Prism Software 5.

Santrumpos

I/R: išemija/reperfuzija; EC: endotelio ląstelės; PTX3: pentraksinas 3; FSP-1: fibroblastams specifinis baltymas 1; N-kadherinas: neuronų kadherinas; alfa-SMA: alfa lygiųjų raumenų aktinas.

AUTORIŲ INSTRUKCIJA

CD koordinavo tyrimą, dalyvavo imuninio ženklinimo ir konfokalinės inkstų sekcijų mikroskopijos procese bei parengė rankraštį. AS ir RF dalyvavo kuriant tyrimą, prisidėjo prie duomenų analizės, atliko in vitro eksperimentus ir kritiškai peržiūrėjo rankraštį. MR ir GSN atliko histopatologinę vaizdo analizę. LL, FS, AMC atliko išemijos-reperfuzijos sužalojimo gyvūnų modelį ir padėjo peržiūrėti rankraštį. GL, PD ir MB atliko visas chirurgines procedūras kiaulių modeliui ir padėjo peržiūrėti rankraštį. MRD, P.vdP., C.vK. ir FS peržiūrėjo rankraštį.

PP, ER, GG, GS ir LG kritiškai peržiūrėjo rankraštį. GC suteikė naujų analitinių priemonių, suprojektavo ir prižiūrėjo tyrimą. CD, AS ir RF vienodai prisidėjo prie šio tyrimo. Visi autoriai prisidėjo prie straipsnio ir patvirtino pateiktą versiją.

PADĖKA

Dėkojame Claudia Curci iš Inkstų, dializės ir transplantacijos skyriaus, Skubios pagalbos ir organų transplantacijos skyriaus,

Bario universitetas už puikią techninę pagalbą.

INTERESŲ KONFLIKTAI

Autoriai pareiškia, kad neturi interesų konfliktų.

FINANSAVIMAS

Šį tyrimą palaikė Bario universitetas „Aldo Moro“, Italijos sveikatos ministerija (GR 2016- 02362239 „Transkriptomika pagrįstas metodas, skirtas nustatyti nuspėjamus veiksnius ir terapinius tikslus, susijusius su uždelsto transplantato funkcijainkstastransplantacijos gavėjai“, Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD gavo šio projekto stipendiją) ir Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 „Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori“ – AIM-1810057-2 veikla suteikta AS

NUORODOS

1. Bonventre JV, Yang L. Išeminės ūminės ligos ląstelių patofiziologijainkstassužalojimas. J Clin Invest. 2011 m.; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Įgimtas imuninis atsakas sergant išeminiu ūminiuinkstassužalojimas. Clin Immunol. 2009 m.; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Papildymas: pagrindinė imuninės sistemos stebėjimo ir homeostazės sistema. Nat Immunol. 2010 m.; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Pagrindinis alternatyvaus komplemento kelio vaidmuo žmogaus ligoje. J Immunol. 2006 m.; 176:1305–10. PMID:16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Inflammaging and Complement System: A Link Between AcuteInkstasTraumos ir lėtinė transplantato žala. Priekinis imunolis.

2020 m.; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraksinai įgimtame imunitete: pamokos iš PTX3. Cell Tissue Res. 2011 m.; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Ilgasis pentraksinas 3 (PTX3), atsižvelgiant į jo struktūrą, veikimo mechanizmą ir klinikines pasekmes. Autoimunitetas. 2012 m.; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraksinas 3 (PTX 3): endogeninis uždegiminio atsako moduliatorius. Tarpininkai Inflamm. 2012 m.; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraksinai kryžkelėje tarp įgimto imuniteto, uždegimo, matricos nusėdimo ir moterų vaisingumo. Annu Rev Immunol. 2005 m.; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Ilgas pentraksinas PTX3 kaip prototipinis humoralinio modelio atpažinimo receptorius: sąveika su ląstelių įgimtu imunitetu. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Fikolino-2 ir pentraksino 3 sinergija skatina įgimtą imuninės sistemos atpažinimą ir komplemento nusėdimą. J Biol Chem. 2009 m.; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 moduliuoja naviko imunoflogozę mikroaplinką ir yra prognostinis veiksnys pacientams, sergantiems aiškia ląstelių inkstų ląstelių karcinoma. Senėjimas (Albanis, NY). 2020 m.; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Ilgas pentraksinas PTX3 yra labai svarbus audinių uždegimui po

žarnyno išemija ir reperfuzija pelėms. Esu J Patholas. 2009 m.; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Humoralinis modelio atpažinimo receptorius PTX3 yra saugomas neutrofilų granulėse ir lokalizuojasi tarpląsteliniuose spąstuose. J Exp Med. 2007 m.; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Pentraksinas 3 plazmoje pacientams, sergantiems lėtiniuinkstasliga: ryšys su inkstų funkcija, baltymų energija, išsekimu, širdies ir kraujagyslių ligomis ir mirtingumu. Clin J Am Soc Nephrol. 2007 m.; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Padidėjęs cirkuliacinis pentraksino 3 lygis ir audinių ekspresija uremijoje: endotelio disfunkcijos atspindys. PLoS One. 2013 m.; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Soluble modelio atpažinimo receptoriaus PTX3 vaidmuo kraujagyslių biologijoje. J Cell Mol Med. 2007 m.; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraksinai PTX3 ir SAP įgimtame imunitete, uždegimo reguliavime ir audinių remodeliavime. J Hepatol. 2016 m.; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraksinas 3 slopina ūminę inkstų pažeidimo sukeltą intersticinę fibrozę slopindamas IL-6/Stat3 kelią. Uždegimas. 2014 m.; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. „Saldi“ ilgo pentraksino pusė: kaip glikozilinimas veikia PTX3 funkcijas esant įgimtam imunitetui ir uždegimams. Priekinis imunolis. 2013 m.; 3:407. PMID: 23316195