Ankstesnis baimės mokymasis leidžia greitai įsisavinti naujus baimės prisiminimus tiesiai į žievės tinklus 3 dalis

Eksperimentinis dizainas

Duomenų atkuriamumas buvo įvertintas naudojant skirtingus pakartojimus (S1 lentelė). Pirmieji CNQX inaktyvavimo eksperimentai Te2 (1A–1C pav.) buvo atlikti didesniu pakartojimų skaičiumi, nes tai buvo pirmieji eksperimentai, kuriuos atlikome ir padėjome patikrinti pagrindinę mūsų tyrimo hipotezę. Gyvūnai a priori buvo priskirti skirtingoms elgesio grupėms pagal svorį. Į kiekvieną eksperimentinę grupę atsitiktine tvarka buvo priskirti to paties perų patinai. Pirmiausia išnagrinėjome pagrindinę savo tyrimo hipotezę, ty žievės inaktyvacija gali skirtingai paveikti naujos baimės atminties konsolidavimą eksperimentiškai nenaudotoms žiurkėms ir gyvūnams, kurie anksčiau sužinojo apie baimės įvykį.

Patinai turi itin stiprią atmintį, nes turi stipresnį išgyvenimo instinktą ir norą daugintis. Gamtoje išgyvenantys gyvūnai turi atsiminti daug geografinės informacijos, maisto rūšių, plėšrūnų pėdsakų ir grupės narių buvimo vietos, kad geriau prisitaikytų prie aplinkos ir apsaugotų gyvybę.

Pavyzdžiui, liūtai patinai turi atsiminti visos teritorijos statusą, narystės santykius ir konkurentų vietas, kad apsaugotų teritoriją ir jų statusą. Norėdami išgyventi ir daugintis, zebrų patinai turi atsiminti vandens šaltinių ir maisto vietą pievoje. Kartą gaiviųjų gėrimų įmonė paskelbė reklamą, rodančią, kad baltojo lokio patinas gali prisiminti narą ir jo unikalų kvapą, kad galėtų jį atpažinti kitą kartą, kai jį pamatys.

Todėl gyvūnų patinai turi turėti stiprią atmintį apie savo teritorijos apsaugą, aprūpinimą pakankamai maisto ir palikuonių reprodukcijos. Dėl to jie taip pat yra svarbūs žmogaus tyrimų objektai, pavyzdžiui, tiriant tokias ligas kaip atminties sutrikimas ir Alzheimerio liga.

Žmonių pasaulyje taip pat galime pasisemti įkvėpimo iš gyvūnų patinų atminties. Nuolatinis naujų dalykų pažinimas, nuolatinis mokymasis ir mąstymas gali pagerinti mūsų atmintį ir gebėjimą prisitaikyti, pagerinti gyvenimo lygį ir darbo efektyvumą. Todėl mokykimės iš patinų, toliau kaupkime žinias ir patirtį, turėkime stiprius išlikimo instinktus ir dauginimosi troškimus bei kurkime geresnę ateitį. Matyti, kad reikia pagerinti atmintį. Cistanche deserticola gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche deserticola yra tradicinė kinų vaistinė medžiaga, turinti daug unikalių poveikių, iš kurių vienas yra pagerinti atmintį. Maltos mėsos veiksmingumą lemia įvairios joje esančios veikliosios medžiagos, įskaitant rūgštį, polisacharidus, flavonoidus ir kt. Šie ingredientai gali įvairiais būdais skatinti smegenų sveikatą.

Spustelėkite žinokite būdus, kaip pagerinti smegenų veiklą

Esant statistiniams skirtumams tarp šių grupių, galiausiai atlikome papildomas kontrolines grupes, švirkščiant fiziologinį tirpalą. Panašus metodas buvo taikomas optogenetiniams eksperimentams, kai AAV kontrolinė grupė buvo atlikta tik po to, kai buvo nustatyti statistiniai skirtumai tarp naivių ir anksčiau dresuotų žiurkių. Šie eksperimentų tvarkaraščiai leido išvengti nereikalingų kontrolinių grupių ir nereikalingų gyvūnų naudojimo – tai pagrindinė problema Europos ir Italijos teisės aktuose dėl eksperimentų su gyvūnais (3 Rs principas).

Elgesio procedūros

Visi eksperimentai buvo atlikti šviesioje dienos fazėje (8–16 val.). Gyvūnai buvo vežami atskirai iš patalpos į eksperimentines patalpas skirtinguose mažuose skaidriuose kibiruose, atsižvelgiant į eksperimentinius poreikius.

Klausos mokymas: pirmoji elgesio sesija. Klausos baimės sąlygojami gyvūnai (CS1-CS2). Šioje grupėje žiurkės buvo švelniai paimtos iš namų narvo ir pernešamos iš laikymo kambario į garsui nepralaidų kambarį. Ten gyvūnai buvo patalpinti į kondicionavimo aparatą, sudarytą iš stačiakampio juodo narvo (35 × 40 cm) su nerūdijančio plieno strypų tinkleliu (1 cm skersmens, 1,5 cm atstumu vienas nuo kito), prijungtą prie smūgio įtaiso.

Žiurkės buvo paliktos netrukdomos 1 minutę. Po šio laiko buvo skirti 7 sąlyginiai dirgikliai (CS), susidedantys iš gryno 15 kHz dažnio tono (kiekvieno 15 s trukmės, 80 dB, 36 s bandymų intervalas). Paskutinė 1 s kiekvieno tono buvo susieta su skausmingu US (0,5 mA, 1 s). Kondicionavimo seanso pabaigoje žiurkės buvo grąžintos į savo namų narvą.

Tik šoko gyvūnai (shock-CS2). Šioje grupėje žiurkės buvo panašiai patalpintos į tą patį kondicionavimo aparatą. Iškart po to kiekviena žiurkė buvo paveikta 7-kojų smūgių (1 s, 0,5 mA) vienas po kito. Pasibaigus stimuliacijai, gyvūnai buvo grąžinti į savo namų narvą. Laiko pastovumas kondicionavimo narvelyje buvo mažesnis nei 9 sekundės. Ankstesni tyrimai parodė, kad ši procedūra leidžia išvengti asociatyvinių procesų tarp skausmingų dirgiklių ir jutimo dirgiklių [29,30].

Kvapo baimės sąlygoti gyvūnai (odor-CS2). Šioje grupėje žiurkės buvo patalpintos į tą patį stačiakampį juodą narvą, naudojamą aukščiau nurodytose eksperimentinėse grupėse, ir prijungtos prie šoko įvedimo įrenginio. Žiurkės buvo paliktos netrukdomos 2 min. Po šio laiko buvo suleisti 7 CS, susidedantys iš vanilės kvapų (kiekvienas po 1 0 s, 24 s bandymo intervalas). Paskutinė 1 s kiekvieno kvapo buvo susieta su skausmingu US (0,5 mA, 1 s). Kondicionavimo modulis buvo pastatytas šalia ventiliacijos šaltinio, kad būtų išvengta tiekiamų dirgiklių išlikimo po jų poslinkio. Narvas buvo apsaugotas viršutine tinkleliu. Kvapai buvo pateikti naudojant srauto praskiedimo olfaktometrą. Švarus oras (1,5 l/min.) buvo nukreiptas į solenoidinį vožtuvą, kurį veikiant, oras perėjo į 15 ml buteliuką su 10 ml vanilės kvapo.

Tik tonas gyvūnai (Tone-CS2). Šios grupės žiurkės buvo patalpintos į tą patį juodą narvą ir joms buvo parodytas 15- kHz tonas (7 dirgikliai, 15 s trukmės, 36 s ITI), kuris buvo pristatytas be JAV.

Iš anksto apšviesti gyvūnai (Tone-CS1-CS2). Žiurkės buvo patalpintos į kondicionavimo narvą ir po 1 minutės joms 20 kartų buvo parodytas vien tik 15- kHz tonas, o po 24 valandų tas pats tonas buvo suporuotas su JAV tapimu CS1.

Baltojo triukšmo baimės sąlygoti gyvūnai (WN-CS2). Šioje grupėje žiurkės buvo patalpintos į stačiakampį juodą narvą ir paliktos netrukdomos 1 minutę. Po šio laiko buvo suleisti 7 CS, susidedantys iš WN (kiekvienas 15 s trukmės, 75 dB, 36 s tarp bandymų). Paskutinė kiekvieno tono 1 sek. buvo susieta su skausmingu US (0.5 mA, 1 s). Kondicionavimo seanso pabaigoje žiurkės buvo grąžintos į savo namų narvą.

Klausos baimės mokymasis: antrasis elgesio mokymas. Praėjus dviem savaitėms po pirmesnėje pastraipoje aprašytų procedūrų, gyvūnai buvo mokomi atlikti kitą skirtingą klausos baimės kondicionavimo užduotį. Žiurkės buvo įdėtos į standartinę lupimo dėžę, kaip ir ankstesniame mūsų darbe [10], ir netrukdomos 2 min. Po šio laiko buvo pristatytos 7 CS, sudarytos iš grynų 3 kHz dažnio tonų (kiekvienas 8 s trukmės, 80 dB, 22 s tarpbandinis intervalas). Paskutinė 1 s kiekvieno tono buvo susieta su skausmingu US (0,5 mA, 1 s). Kondicionavimo seanso pabaigoje žiurkės buvo grąžintos į savo namų narvą.

Baimė išsaugoti atmintį. Klausos baimės atminties išlaikymas, neseniai įgytas CS2 (3 kHz), buvo patikrintas po 4 dienų. Atliekant optogenetikos eksperimentus, naujausios atminties testas buvo atliktas naudojant lazerį, praėjus 24 valandoms po CS2-US mokymosi, analogiškai laiko intervalui, per kurį atlikome žievės inaktyvavimą naudojant CNQX (ty 24 val. mokymas). Žiurkės buvo pripratintos prie aparato, kuris skiriasi nuo to, kuris naudojamas kondicionavimui, ir buvo patalpintos į kitą patalpą, kad būtų išvengta sąlyginio baimės elgesio su kontekstiniais ženklais [10,62].

Naujasis aparatas sudarytas iš skaidraus plastikinio narvelio su juodai nudažyta puse, įtaisyto garsą slopinančioje dėžutėje su išmetimo ventiliatoriumi, kuris pašalino nemalonų orą iš gaubto ir sukūrė 60 dB foninį triukšmą. Gyvūnams buvo leista narvą tyrinėti 5 minutes per dieną pripratimo sesijos metu. Baimės atminties išsaugojimo testo dieną, po 2 min. laisvo tyrinėjimo, mes pristatėme 4 CS2 3 kHz (8 s–22 ITI), po to jokia JAV.

Jei to reikalauja eksperimentinis poreikis, žiurkėms buvo atliktas nuotolinės baimės atminties išsaugojimas, įgytas likus 2 savaitėms iki antrojo klausos baimės kondicionavimo bandymo. Šiuo tikslu praėjus 7 dienoms po baimės atminties išlaikymo testo iki 3- kHz tono, gyvūnai buvo patalpinti į naują aplinką (juodai baltai dryžuotą narvą), o po to jiems buvo pateiktas 15- kHz tonas. Keturi tonai buvo pateikti 36 s intervalais.

Kontekstinis mokymas: pirmoji elgesio sesija. Kontekstinės baimės sąlygojimo grupė (CtxA-CtxB). Šioje grupėje žiurkės buvo švelniai paimtos iš namų narvo, įdėtos į kibirą ir pernešamos iš laikymo kambario į garsui nepralaidų kambarį. Ten gyvūnai buvo patalpinti į kondicionavimo aparatą, sudarytą iš pirmiau minėto stačiakampio juodo narvelio su nerūdijančio plieno strypų tinkleliu, prijungtu prie smūgio tiekimo įrenginio. Žiurkės buvo paliktos netrukdomos 1 minutę. Po šio laiko buvo suleisti 5 US (0.5 mA, 1 s) su 51 s laiko intervalais. Užsiėmimo pabaigoje gyvūnai buvo grąžinti į savo namų narvą.

Tik šoko grupė (shock-CtxB). Žiurkės, patekusios į kondicionavimo aparatą, iš karto gavo 5-kojų smūgius (1 s, 0,5 mA) vienas po kito. Laiko pastovumas kondicionavimo narve buvo mažesnis nei 7 sekundės. Ankstesni tyrimai parodė, kad ši procedūra leidžia išvengti asociatyvinių procesų tarp skausmingų dirgiklių ir jutimo dirgiklių [29,30].

Tik šoko grupė (shock-CtxB). Žiurkės, patekusios į kondicionavimo aparatą, iš karto gavo 5-kojų smūgius (1 s, 0,5 mA) vienas po kito. Laiko pastovumas kondicionavimo narve buvo mažesnis nei 7 sekundės. Ankstesni tyrimai parodė, kad ši procedūra leidžia išvengti asociatyvinių procesų tarp skausmingų dirgiklių ir jutimo dirgiklių [29,30].

Naujas kontekstinis baimės sąlygojimas ir pastarojo meto baimės atminties išsaugojimas. Praėjus dviem savaitėms po ankstesnėje pastraipoje aprašytų procedūrų, visos grupės buvo apmokytos susieti naują kontekstinę aplinką (skinner box modulį, patalpintą kitoje patalpoje) su skausmingu US (0.5 mA, 1 s) . Kiekvienas gyvūnas buvo patalpintas į naują kamerą ir netrukdomas 2 minutes. Tada jis buvo veikiamas 5 JAV spinduliais, atskirtais 30 s intervalais.

Kontekstinės baimės atminties išlaikymas buvo išbandytas praėjus 4 dienoms po baimės kondicionavimo procedūros, žiurkes vėl įdedant į Skinnerio dėžės kamerą 3 minutėms. Atliekant optogenetikos eksperimentus, naujausios atminties testas buvo atliktas naudojant lazerį, praėjus 24 valandoms po CtxB-US mokymosi, analogiškai laiko intervalui, per kurį atlikome žievės inaktyvavimą, naudojant CNQX (ty 24 valandas po treniruotės). Jei to reikalauja eksperimentinis poreikis, žiurkės buvo išbandytos, ar išlaiko nuotolinę baimę, gyvūnus įtraukiant į kontekstą, susietą su JAV, likus 2 savaitėms iki naujos asociacijos.

Gyvūnai buvo vežami 2 skirtinguose kibiruose į kondicionavimo kameras pagal skirtingas kontekstines procedūras.

Užšaldymo priemonė. Visose eksperimentinėse procedūrose baimės atminties išsaugojimo vertinimas buvo nustatytas kaip užšalimo atsakas [10], analizuojamas kaip visiškas somatinio mobilumo nebuvimas, išskyrus kvėpavimo judesius. Kiekvienam gyvūnui laiką (sekundėmis), praleistą šaldant, matavo 2 nepriklausomi stebėtojai, kurie buvo apakinti gyvūnų grupėmis.

Chirurginės procedūros

Kad pasirinktos medžiagos būtų įvedamos į tikslines vietas, žiurkės buvo anestezuojamos izofluranu: Indukcija buvo atlikta 4 % [tūrio/tūrio] 2 l/min medicininiame ore ir tęsiama iki nuolatinio poveikio 2 % [tūrio/tūrio]. kai žiurkės buvo sumontuotos stereotaksiniame aparate.

Buvo padarytas kaukolės pjūvis ir išgręžtos mažos skylutės, kad būtų galima prasiskverbti 28-materio infuzijos adata. Medžiagoms tiekti buvo naudojamas 10-ul Hamiltono švirkštas, sumontuotas ant infuzijos pompos. Po infuzijos adata paliekama dar 3 min. Tada pjūvis buvo uždarytas nerūdijančio plieno žaizdos spaustukais ir gyvūnui po oda buvo sušvirkštas analgetikas / priešuždegiminis ketoprofenas (2 mg / kg kūno svorio), o gyvūnas buvo šiltas ir stebimas, kol pasveiks po anestezijos.

Kaip ir ankstesniuose tyrimuose [10, 32–34], gyvūnų kaniuliuoti nebūtina, o aktyvūs junginiai buvo tiesiogiai įvedami stereotaksiniu būdu. Ši procedūra yra naudinga, nes išvengiama chirurginės traumos, būdingos nuolatinei kaniuliavimo procedūrai, todėl trauma apsiribojama iki vienos adatos įsiskverbimo [10,32–34]. Iš tiesų, bendroji anestezija neturi reikšmingos įtakos atminties konsolidacijai [10,32–34]. Siekiant užtikrinti, kad junginių skyrimo laikas, susijęs su mokymosi bandymu, būtų tikslus, kad žiurkės gautų pasirinktus junginius maždaug po 1 valandos ir maždaug 1 dieną po treniruotės, izoflurano anestezija buvo sukelta likus 5 minutėms iki planuojamos injekcijos laiko, pvz., 55 val. min žiurkėms, gydytoms 60 min. po treniruotės, ir 23 val. bei 55 min. gyvūnams, sušvirkštiems 24 val. po treniruotės. Kiekviena žiurkė buvo kondicionuojama, o po to operuojama atskirai. Gyvūnai, priklausantys skirtingoms elgesio grupėms, buvo manipuliuojami persipynusiu būdu.

Selektyvus AMPA/kainato glutamato receptorių inhibitorius CNQX ({{0}}ciano-7-nitrochinoksalinas-2, 3-dionas) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] buvo ištirpintas steriliame fiziologiniame tirpale (NaCl, 0,9%) ir sureguliuotas pH iki 7,4 su HCl. Baltymų sintezės inhibitorius anisomicinas (Merck, 125 ug/ul) buvo ištirpintas ekvimoliniame HCl, praskiestas steriliu fiziologiniu tirpalu ir sureguliuotas iki pH 7,4 NaOH. Sterilus fiziologinis tirpalas (0,9 % NaCl) buvo naudojamas kaip nešiklio kontrolė. Šios medžiagos buvo abipusiai švirkščiamos 0,1 ul/min greičiu ir 0,5 ul tūriu į vieną vietą pagal šias stereotaksines koordinates, paimtas iš Paxinos ir Watson atlaso [26], o Te2 žievės laukas nurodytas Zilio atlase [25]:

Antrinė klausos žievė (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: –6.

Priekinė cingulinė žievė (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: –2,2.

Injekcijos tūris (0,5 ul vienoje vietoje) buvo parinktas remiantis ankstesniais tyrimais, kai suaugusioms žiurkėms aktyvūs junginiai buvo švirkščiami į Te2 [10,34] ir ACC [55,63].

Norint inaktyvuoti nugarinį hipokampą, veikliųjų junginių buvo švirkščiama 0,6 ul tūrio vienai vietai šiomis stereotaksinėmis koordinatėmis:

Nugarinis hipokampas: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Negrįžtami nugaros hipokampo pažeidimai buvo sukelti skiriant NMDA (Tocris, 18 ug/ul, ištirpintas steriliame druskos tirpale, 0,4 ul vienoje vietoje) greičiu 0,1 ul/ min taškuose, esančiuose anksčiau minėtose koordinatėse. Tos pačios koordinatės buvo naudojamos fiziologiniu tirpalu sušvirkštiems kontroliniams gyvūnams ir fiktyviai operuotiems gyvūnams.

Raudoni Retrobeads (Lumafluor, 1:2 praskiedimas fiziologiniu tirpalu, 0,6 ul) buvo suleisti BLA pagal šias koordinates: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8.3.

Eksperimentų pabaigoje buvo histologiškai patikrintos adatos pėdsakai CNQX, anizomicino ar fiziologinio tirpalo injekcijų atveju arba pažeidimų išplėtimas NMDA injekcijų atveju. Žiurkės buvo giliai anestezuotos ir intrakardiniu būdu perfuzuotos 4% formaldehidu. Jų smegenys buvo perpjautos 30 μm ant kriostato. Nissl dažytos serijos pjūviai buvo paruošti naudojant įprastą procedūrą, o pjūviai buvo histologiškai patikrinti mikroskopu, padidintu 2, 5 ×.

Optogenetiniai eksperimentai

Viruso injekcija. Su adeno susijęs virusas AAV5:CaMKII ::eNpHR3.{3}}vyšnia ir kontrolinis vektorius AAV5:CaMKII -vyšnia buvo gauti iš Šiaurės Karolinos universiteto Vector Core (Chapel Hill, Šiaurės Karolina, Jungtinės Amerikos Valstijos). Šis viruso titras buvo 5:8 abiejų virusų viruso titras buvo 5,8 × 10^12 vg/ml. CaMKII promotoriaus naudojimas įgalina transgeno ekspresiją, palankią piramidiniams neuronams. Virusai buvo laikomi –80˚C šaldiklyje. Virusinės infuzijos, nukreiptos į Te2 arba ACC, buvo atliktos aukščiau nurodytomis stereotaksinėmis koordinatėmis, kai kiekvienos skylės tūris buvo 0, 5 ul. Virusas buvo švirkščiamas 0,1 ul/min greičiu, o adata buvo palikta dar 5 min. Virusinės injekcijos buvo atliktos likus 4 savaitėms iki optogenetikos eksperimentų.

Apšvietimas.

Optinės skaidulos (Plexon, 200/230 μm šerdis; 10 mm ilgio) buvo implantuotos abipusiai į BLA (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm iš bregmos). Optogenetinis Te2 projekcijų į BLA arba ACC projekcijų į BLA slopinimas buvo gautas naudojant PlexBright optogenetinę stimuliavimo sistemą, sujungtą su lazeriniu diodu (Laserglow Technologies). Sukuriama geltona šviesa (589 nm), kuri praleidžiama per optinį pluoštą. Apskaičiuotas galios tankis optinio pluošto gale buvo 10–15 mW projekcijos vietoms apšviesti. Baimės atminties išsaugojimo metu šviesos spinduliavimas buvo pradėtas likus 4 s iki tono pradžios, išliko viso tono metu ir buvo sustabdytas praėjus 4 s po tono poslinkio. Gyvūnai, priklausantys kontekstinės baimės sąlygojamoms grupėms, viso konteksto tyrinėjimo metu (3 min.) gavo šviesos stimuliaciją. Žiurkės buvo supažindintos su pleistro laidu 2 dienas prieš atminties išsaugojimo bandymą.

Imunohistochemija. Baigus optogenetikos eksperimentus, žiurkės buvo giliai anestezuotos ir perfuzuotos intrakardiniu būdu 4% PAF, kad būtų ištirta viruso difuzija. Smegenys buvo išpjaustytos, per naktį laikomos 4 °C temperatūroje ir galiausiai perkeltos į 30% sacharozės. Koroninės sekcijos (30 μm) buvo supjaustytos ant kriostato ir surinktos į PBS. Laisvai plūduriuojančios sekcijos buvo inkubuojamos blokuojančiame tirpale 1 valandą kambario temperatūroje. Tada jie buvo inkubuojami pirminiame monokloniniame pelės antikūne prieš mCherry (1:500 praskiedimas, Abcam) blokuojančiame tirpale per naktį kambario temperatūroje. Vėliau sekcijos buvo plaunamos PBS ir 1 valandą inkubuojamos kambario temperatūroje su antriniu fluorescenciniu AlexaFluor -568 anti-pelės antikūnu (1:600, Invitrogen), praskiestu PBS. Pjūviai buvo plaunami PBS, sumontuoti su montavimo terpėmis, kuriose yra DAPI (vektoriaus), ir uždengtas dangtelis.

Panašiai buvo surinktos žiurkių, kurioms buvo atlikta NMDA injekcija, smegenys. Laisvai plūduriuojančios sekcijos po kelių skalavimų buvo inkubuojamos su pirminiu monokloniniu pelės anti-Neun (1:1, 000 skiedimo, Merck) antikūnu blokuojančiame tirpale per naktį kambario temperatūroje. Vėliau sekcijos buvo plaunamos PBS ir 1 valandą inkubuojamos kambario temperatūroje su biotiniluotu arklio anti-pelės antikūnu (1:200 praskiedimas, vektorius). Avidino-biotino kompleksas (ABC kompleksas 1:100, vektorius, 2 valandos ir pusė inkubacijos) buvo sujungtas su diaminobenzidinu (0, 03%, Merck), kad nudažytų Neun. Tada sekcijos buvo nuplaunamos PBS ir perkeltos į želatina padengtas stiklelius, dehidratuotos ir padengtos dangteliu.

Retro granulėmis sušvirkštų žiurkių Te2 sekcijos buvo inkubuojamos su pirminiu polikloniniu triušio anti-Fos antikūnu (1:2, 000, ląstelių signalizacija) blokuojančiame tirpale per naktį kambario temperatūroje. Vėliau griežinėliai buvo plaunami PBS ir 1 valandą inkubuojami kambario temperatūroje su antitriušine Alexa 488 (1:1, 000, Invitrogen, PBS). Galiausiai, imuniniu būdu pažymėtos sekcijos buvo plaunamos PBS, pritvirtintos ant želatina padengtų stiklelių ir padengtos DAPI papildyta tvirtinimo terpe.

Mikroskopija

mCherry ženklinimas buvo ištirtas naudojant Zeiss Airyscan konfokalinį mikroskopą: buvo naudojami du lazeriai (405 ir 561 nm), kurių kiekvienas atitinka didžiausią emisijos spektrą DAPI (Nissl dėmė ląstelių branduoliams) ir Alexa 568 (mCherry). ), atitinkamai. Norint išanalizuoti viruso difuziją injekcijos vietose, Te2 ir ACC mikrografijos buvo gautos kaip mozaikiniai vaizdai (kiekvienas buvo gautas naudojant 10 × objektyvą). „Axon“ gnybtai į BLA buvo analizuojami naudojant 40 × objektyvą kaip 10 sekcijų, išdėstytų 1 μm atstumu (159 μm kvadratas; mastelio keitimo frakcija, 1,0), z-stack.

Retrokaroliukais sušvirkštų gyvūnų, kuriems buvo atliktas cFos imuninis žymėjimas, vaizdai buvo gauti 40 × padidinimu (159 μm kvadratas; priartinimo frakcija, 1.0) naudojant 3 skirtingus lazerius, atitinkančius didžiausią emisijos spektrą. atitinkamai DAPI (Nissl dėmė ląstelių branduoliams), AlexaFluor 488 (cFos) ir Texas Red (Retrobeads). 0,7 μm pjūviai buvo paimti išilgai 10- μm z-sriegio. Branduolių, ekspresuojančių cFos, pažymėtų granulėmis ir dvigubai teigiamų (pažymėtų cFos+ granulėmis), skaičius buvo kiekybiškai įvertintas kiekvienam gyvūnui Te2 regione, esant anteroposteriorinėms koordinatėms nuo 6,7 iki 7,3 mm nuo bregmos [10]. Tada duomenys buvo suvidurkinami, kad būtų gautas kiekvieno gyvūno vidurkis, o rezultatai buvo statistiškai palyginti. Pjūvių su Neuno DAB dažymu vaizdai buvo analizuojami naudojant Neurolucida programinę įrangą, prijungtą prie mikroskopo per spalvotą CCD kamerą [10].

Duomenų analizė ir atmetimo kriterijai

Kiekvienos grupės n buvo nustatytas a priori pagal mūsų ankstesnius tyrimus [10, 16, 17], anksčiau paskelbtus šios srities darbus (žr. ACC [6, 22, 55] ir Te2 [10, 59] nuorodas), ir pagal G galios įvertinimus pagal šią lentelę (1 lentelė):

Kiekvienai analizei mes įvertinome galutinį vidutinį kiekvienos grupės gyvūnų skaičių nuo 8 iki 10 gyvūnų. Grupės buvo vykdomos su vidine kontrole toje pačioje eksperimentinėje sesijoje (S1 lentelė). Atsižvelgdami į chirurginių ir elgesio procedūrų kintamumą, a priori įtraukėme daugiau eksperimentinių subjektų (iki 15% daugiau), kurie kai kuriais atvejais atitiko eksperimentinius kriterijus ir buvo įtraukti, taip išvengdami savavališko pašalinimo. Hipokampo tyrimų atveju, norėdami įvertinti NMDA ir CNQX injekcijų poveikį skirtingais laiko intervalais, subalansavome bendrą kontrolinių gyvūnų skaičių tarp nešiklio ir fiktyviai operuotų žiurkių įvairiose grupėse.

Elgesio analizė, histologiniai patikrinimai ir ląstelių skaičius buvo atlikti aklai. Gyvūnai, kurių adatos pėdsakas arba pažeidimas buvo netinkamai lokalizuotas NMDA negrįžtamų pažeidimų atveju, nebuvo įtraukti į duomenų analizę (S1 lentelė). Farmakologinių tyrimų metu mes neįtraukėme 57 gyvūnų, iš viso 465 gyvūnų, dėl netinkamo adatos įdėjimo (22/255 Te2, 31/179 ACC ir 4/31 hipokampo). Atsekimo tyrimuose, kuriuose dalyvavo 21 gyvūnas, pašalinome 3 tiriamuosius, kuriems sušvirkštus retro granulių BLA nebuvo. Te2 optogenetikos tyrimuose, kuriuose iš viso dalyvavo 30 gyvūnų, neįtraukėme 1 žiurkės, nes optinių skaidulų vieta nebuvo aukščiau tikslinės srities, 1 žiurkės. Galų gale, viruso nebuvo Te2 ir 2 žiurkėse, nes viruso difuzija buvo atitinkamai mažesnė nei 4,7% ir 5,3% Te2 ploto injekcijos vietose. Žiurkių, įtrauktų į statistinę analizę, minimali viruso difuzija buvo 39,6 % labiau priekinėje stereotaksinėje koordinatėje ir 50,2 % užpakalinėje stereotaksinėje koordinatėje.

Panašiai, atliekant ACC optogenetikos eksperimentus, iš viso 32 gyvūnai, 2 žiurkės buvo pašalintos, nes optinių skaidulų vieta nebuvo aukščiau tikslinės srities. Dvi žiurkės buvo neįtrauktos, nes viruso ACC nebuvo, 1 gyvūnas, nes virusas pateko į gretimą antrinę motorinę žievę, ir 1 žiurkės, nes viruso difuzija injekcijos vietose buvo mažesnė nei 2,3 % ACC ploto. Likusiose žiurkėse minimali viruso difuzija buvo 33,3% labiau priekinėje stereotaksinėje koordinatėje ir 42,2% užpakalinėje koordinatėje.

NMDA pažeidimų tyrimuose pažeidimai daugiausia buvo nukreipti į nugaros hipokampo CA1 regioną. Minimalus (raudonas) ir maksimalus (rožinis) hipokampo pažeidimų išplėtimas visoje nugaros hipokampo srityje buvo atitinkamai 23,2% ir 53,5% labiau priekinėje stereotaksinėje koordinatėje ir 28,3% ir 62,3% užpakalinėje koordinatėje. Iš viso iš 73 gyvūnų 4 žiurkės buvo pašalintos, nes pažeidimo nebuvo, o dar 3 gyvūnai buvo išmesti, nes pažeidimai išsiplėtė mažiau nei 5.{13}} % (būtent 4,8%, 4,3%, 3,1). %) dėl hipokampo srities 2 koordinatėse.

Ploto kontūrų analizė buvo atlikta vizualiai apžiūrint ir rankiniu būdu kiekybiškai, naudojant ZEN 3.0 programinės įrangos regiono kontūro įrankį. Tada ploto vertės buvo normalizuotos pagal bendrą regiono plotą. Stereotaksinės Te2, ACC ir hipokampo koordinatės buvo pagrįstos Paxinos atlasu [26], o Te2 atveju – su žievės lauku, pateiktu Zilles atlase [25].

Statistinė analizė

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Visi duomenys atlaikė Levene'o dispersijų lygybės testą. Taigi visuose eksperimentuose buvo naudojama parametrinė statistika. Dviejų grupių duomenys buvo lyginami naudojant 2-tailed nesuporuotą Studento t-testą. Kelių grupių palyginimai buvo įvertinti naudojant 1-būdo ANOVA testą su Tukey post hoc testu. Norėdami pašalinti skirtumus tarp grupių ir jų viduje, apskaičiavome 3 × 2 mišraus dizaino ANOVA modelį, kuriame grupė (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) yra tarp tiriamųjų kintamasis ir būklė (prieš ir po paskutinio kondicionavimo + injekcijos) kaip tiriamųjų kintamasis. Kai grupės × sąlygų sąveika buvo reikšminga, atlikome paprastą pagrindinių efektų analizę ir kiekvieną p reikšmę pakoregavome Bonferroni korekcija. Kiekvienam mišriam ANOVA modeliui įvertinome sferiškumo prielaidą naudodami Mauchly sferiškumo testą.

Statistiniai parametrai (ty tiksli n reikšmė kiekvienai grupei, SEM, statistinis testas, poveikio dydis ir tiksli p reikšmė) pateikiami legendose. Esant vienodam imties dydžiui, nesuporuotų t testų efektų dydžiai buvo nustatyti apskaičiuojant Coheno d arba Glasso d pagal SD panašumą, o skirtingų imčių dydžių atveju - Hedges'g. Koreliacijos tarp ląstelių skaičiaus ir užšalimo buvo apskaičiuotos naudojant Pearsono koeficientą. Norėdami nustatyti, ar duomenys atitinka statistinio metodo prielaidas, atmetėme nulinę hipotezę, kai P < 0.05 lygis. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS Statistics 22 (IBM).

Pagalbinė informacija

S1 pav. Te2 (A) ir ACC žievės (B), sušvirkštos CNQX, adatos pėdsakų padidinimas, pasirinktas kaip pavyzdžiai. (C) Kai tik šoką patyrę gyvūnai vaizduojami tame pačiame kontekste praėjus 2 savaitėms po procedūros, jų baimė buvo nedidelė, o tai rodo, kad procedūra nesukėlė sąlyginio sušalimo kontekste, kuriame buvo atliktas šokas. (D) Panašūs rezultatai, kaip ir 1 pav., buvo gauti subalansavus 2 tonus, naudojamus kaip CS (CS1, 3 kHz ir CS2, 15 kHz) (Studento t testas, t(14)=3.44, p {{ 13}}.{20}}040, Glass's d=4.14). (E) Kvapo CS kondicionuotų žiurkių kvapas nušalo iki kvapo praėjus 2 savaitėms po kondicionavimo, net jei buvo išbandytas kitoje aplinkoje, atsižvelgiant į kondicionavimo kontekstą, ir taip parodyta, kad baimė buvo konkrečiai susijusi su šiuo užuominos pateikimu. Mastelio strypai, 300 μm. ��P < 0,01. Visi duomenys yra vidutiniai ir SEM. Suvestinius S1 pav. duomenis galima rasti pagalbinėje informacijoje faile pavadinimu S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 pav. CNQX injekcija sumažino naujausių klausos baimės prisiminimų išsaugojimą žiurkėms, kai baimės apibendrinimas buvo sumažintas vien tonu prieš ekspoziciją arba baltojo triukšmo toną kaip CS1. 3 × 2 mišraus dizaino ANOVA (pagrindinis grupės poveikis: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, pagrindinis sąlygos poveikis: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupė × sąlygų sąveika F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) parodė, kad užšalimas iki 3 kHz tono prieš susiejimą su JAV buvo mažesnis gyvūnams, kuriems prieš 15 kHz ir JAV poravimą buvo atliktas 15 kHz tonas (n=10, p=0.001), arba žiurkėms, kurioms būdingas baltas triukšmas (n=13 , p=0.008), palyginti su CS1-CS2 gyvūnais (n=22), kurie parodė kintamą baimės apibendrinimo atsaką. Tačiau po CS-US mokymosi ir cnqx injekcijų į Te2 žievę neseniai baimės atmintis buvo sutrikusi visose grupėse (p > 0,05). Paprastas pagrindinis efektas grupėse (prieš ir po CS-US mokymosi ir cnqx injekcijos): CS1-CS2, p=0.025; Tonas-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Visi duomenys yra vidutiniai ir SEM. Suvestinius S2 pav. duomenis galite rasti pagalbinėje informacijoje, esančiame faile pavadinimu S1 Pagalbiniai paveikslo duomenys. (TIF)

S3 pav. (A) Atsitiktinis retrobeads injekcijos, nukreiptos į BLA, pavyzdys. (B ir C) Optinio pluošto išdėstymo virš BLA pavyzdžiai gyvūnams, kuriems buvo sušvirkšti AAV vektoriai Te2 (B) ir ACC žievėje (C). Mastelio strypai, 500 μm.

Padėkos

Dėkojame dr. E. Manassero už nuolatinę paramą ir patarimus.

Autoriaus indėlis

Konceptualizacija: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Duomenų kuravimas: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formali analizė: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Finansavimo įsigijimas: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Tyrimas: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodika: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Vadovas: Benedetto Sacchetti.

Patvirtinimas: Benedetto Sacchetti.

Rašymas – originalus juodraštis: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Rašymas – apžvalga ir redagavimas: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Nuorodos
1. Frankland PW, Bontempi B. Naujausių ir tolimų prisiminimų organizavimas. Nat Rev Neurosci. 2005 m.; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Konsolidacijų neurobiologija, ar kiek stabili yra engrama? Annu Rev Psychol. 2004 m.; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Atminties konsolidavimas. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015 m.; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarezas P, Squire LR. Atminties konsolidavimas ir medialinė laikinoji skiltis: paprastas tinklo modelis. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Kodėl hipokampe ir neokortekse yra papildomos mokymosi sistemos: įžvalgos iš konnekcionistinių mokymosi ir atminties modelių sėkmės ir nesėkmės. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com