Apsauginis viso glikozido poveikis cistanche Salsa eksperimentiniam kepenų pažeidimui

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/AG: 0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

Wang Yanfang, Zhao Jijun, Hai Pengli, Xue Peifeng, Li Hui, Li Minhui

Abstraktus

Šiame eksperimente buvo nustatytas pelių alkoholinio kepenų pažeidimo modelis, o kaip patikrinimo rodikliai buvo naudojami biocheminiai kepenų funkcijos ir kepenų histopatologinių pokyčių rodikliai. Ištirkitecistanche salsa suminio glikozido apsauginis poveikis eksperimentiniam alkoholiniam kepenų pažeidimui. Nurodykite sumącistanche salsa glikozidasdidelė dozė (130 mg/kg) ir vidutinė dozė pagal zondą (100 mg/kg), maža dozė (65 mg/kg) ir bidenatas (150 mg/kg) kaip teigiamas kontrolinis vaistas. Rezultatai parodė, kad ALT ir AST serumas yra žymiai padidėjęs; SOD aktyvumas kepenyse sumažėja, o MDA kiekis padidėja; atsiranda kepenų ląstelių lipidozė. Bendras cistanche salsa didelės dozės grupės glikozidas yra veiksmingas gerinant kepenų funkcijos indeksus ir mažinant kepenų ląstelių lipidų degeneraciją. Tuo remiantis, preliminarus nustatymasežiuolėiracteosidebendras cistanche salsa glikozido kiekis buvo 29,1%. Pirmiau minėti eksperimentai rodo, kad bendras cistanche salsa glikozidas turi apsauginį poveikį pelių alkoholiniam kepenų pažeidimui, taip pat patvirtinama, kad Echinacoside ir acteozidas yra pagrindinės viso cistanche salsa glikozido veikliosios medžiagos.

Raktažodžiai: bendras cistanche salsa glikozidas; efektyvioji skysčių chromatografija; acteoside; ežiuolė; alkoholinis kepenų pažeidimas

Citanche salsayra Cistanche augalas, priklausantis Orobanchaceae šeimai (Orobanchaceae), taip pat žinomas kaip salina, daugiametis žolinis parazitinis augalas, daugiausia paplitęs dykumose, dykumose ir kitose sausose vietose. Pagrindinės gamybos sritys yra Sindziange ir Vidinėje Mongolijoje. 1]. Atsižvelgiant į tai, kad tos pačios šeimos ir tos pačios genties Herba Cistanche buvo iškasta dideliais kiekiais, o parazitinius augalus sunku daugintis, medicinos ištekliai kasdien mažėja, todėl sunku patenkinti rinkos paklausą. Mūsų šalyje liaudies cistanche salsa naudojama kaip cistanche deserticola pakaitalas, tačiau jos tyrimų ataskaitos yra nedaug. Siekiant dar labiau paaiškinti jo gydomąją vertę, buvo farmakologiškai ištirtas bendras cistanche salsa glikozidas (bendras Cistanche salsa glikozidų kiekis), medžiagų, kurių sudėtyje yra feniletanoidinių glikozidų, klasė.Bendras cistanche salsa glikozidas turi apsauginį poveikį nervams[2] ir gali apsaugoti DNR nuo oksidacinių pažeidimų, kuriuos sukelia hidroksilas (OH·) [3]. Cistanche salsa feniletanoidiniai glikozidai gali žymiai padidinti superoksido dismutazės (SOD) aktyvumą pelių širdyje, kepenyse ir smegenų audiniuose [4]. Pirmiau pateikti tyrimai rodo, kadbendras cistanche salsa glikozidasturi antioksidacinį poveikį.

Mano šalyje sergamumas alkoholine kepenų liga (ALD) kasmet didėja. Alkoholis tapo antra pagrindine kepenų pažeidimo priežastimi po virusinio hepatito [5]. Alkoholinio kepenų pažeidimo gydymui trūksta saugių ir veiksmingų vaistų. Tai, kaip naudoti augalų išteklius kuriant antialkoholinius ir kepenis apsaugančius vaistus ir sveikatos produktus, sulaukė didelio dėmesio farmacijos ir maisto pramonėje. Po išsamios literatūros buvo nustatyta, kad alkoholinis kepenų pažeidimas yra susijęs su oksidaciniu stresu irbendras cistanche salsa glikozidas turi įtakos alkoholinių kepenų pažeidimamsy. Apsauginio poveikio tyrimai vis dar yra tušti. Šio eksperimento tyrimai suteikia mokslinį pagrindą viso cistanche salsa glikozido kūrimui ir panaudojimui.

1 Medžiaga ir įranga

1. 1 Vaistai ir reagentai

Cistanche salsajį suteikė Pagrindinė Mongolijos vaistinių medžiagų identifikavimo ir standartizavimo laboratorija, Baotou medicinos koledžas; Bifendato lašinimo tabletės (Zhejiang Wanbang Pharmaceutical Co., Ltd., partijos numeris A02121139); Alanino aminotransferazės (ALT) rinkinys, aspartamo rūgšties aminotransferazės (AST) rinkinys, malondialdehido (MDA) tyrimo rinkinys, superoksido dismutazės (SOD) rinkinys, Coomassie briliantinio mėlynųjų baltymų nustatymo rinkinys (Nanjing Jiancheng bioinžinerijos institutas, partijos numeris 20110422); 56 ° alkoholiniai gėrimai (Beijing Red Star Co., Ltd.); kiti reagentai yra gryni šalies viduje.

1. 2 Gyvūnai

72 Kunmingo rūšies pelių patinai, sveriantys 17–22 g (Vidinės Mongolijos universiteto laboratorinis gyvūnų centras, Gyvūnų kvalifikacijos sertifikatas Nr.:6 (Mongolija 2002-0001)).

1. 3 Priemonės

Ultravioletiškai matomas spektrofotometras [Unico (Shanghai) Instrument Co., Ltd., UV-2000 modelis]; Mikroplokštelių skaitytuvas (Beckman Coulter, JAV, modelis AD340); Greitaeigė centrifuga (Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co., Ltd., TG18-WS modelis); Didelio efektyvumo skysčių chromatografas ("Thermo Fisher Scientific", "Model Ultimate 3000"); Analitinės svarstyklės (METTLER TOLEDO Instruments Co., Ltd. modelis AR153O); Ultragarsinis osciliatorius (Šanchajus Bransonas, modelis SB3200); Šaldymo sausiklis (Beijing Boyikang Experimental Instrument Co., Ltd., modelis FD-1-50).

2 Metodai ir rezultatai

2. 1 Cistanche salsa aktyvumo suminio glikozido tyrimas

2. 1. 1 Bendras cistanche salsa ekstrahuoto glikozido kiekis

2. 1. 1. 1 Neapdoroto ekstrakto ekstrahavimas

Pasveriama 100 g cistanche salsa šiurkščių miltelių, įpilama 600 ml 70% etanolio ir mirkoma 3 val., ultragarsu ekstrahuojama 30 min., filtruojama ir pirmiau minėti veiksmai kartojami du kartus ant filtro likučio, filtratas ir koncentratas sujungiami, kad etanolis būtų regeneruojamas, kol jis neturi alkoholio skonio, surenkamas ekstraktas ir džiovinamas šalčiu, kad gautumėte 19,46 g storio cistanche salsa neapdorotą ekstraktą.

2. 1. 1. 2 Valymo procesas

Į cheminę stiklinę įpilkite 10 g neapdoroto cistanche salsa ekstrakto, įpilkite 20 ml vandens, kad ištirptų ultragarsu, įpilkite 80 ml absoliutaus etanolio, gerai suplakite ir padėkite 12 valandų, tada filtruokite, filtratas buvo koncentruotas etanoliui išgauti, kol nebus alkoholio skonio, ir išdžiovintas šalčiu, kad gautų 8,408 g viso cistanche salsa ekstrakto glikozido.

2. 1. 2 Gyvūnų grupavimas ir skyrimas

72 pelės buvo šeriamos adaptyviai 2 dienas prieš eksperimentą ir atsitiktine tvarka buvo suskirstytos į 6 grupes, kurių kiekvienoje buvo po 12 pelių, t. y. tuščia kontrolinė grupė, alkoholio kepenų pažeidimo modelio grupė ir teigiama kontrolinė grupė (150 mg/kg bidentato), bendras cistanche salsa didelės dozės grupės glikozidas (130 mg/kg), bendras cistanche salsa vidutinės dozės grupės glikozidas (100 mg/kg) ir bendras cistasdas iš maltų salsa mažos dozės grupės (65 mg/kg). Kiekvienos grupės gyvūnams buvo skiriamas intragastrinis vartojimas (ig) du kartus per parą, o ig tūris buvo 0,2 ml/20 g kūno svorio. Tuščiajai kontrolinei grupei ir modelių grupei buvo duodami vienodi fiziologinio tirpalo kiekiai. Praėjus dviem valandoms po kiekvieno suleidimo, išskyrus tuščiąją kontrolinę grupę, kitoms grupėms 10 dienų iš eilės buvo duodama 56° tirpalo po 0,4 ml/20 g kūno masės ig, kad sukeltų ūmaus alkoholinio kepenų pažeidimo modelį. 9-ąją modelio pastato dieną pasninkas nebuvo leidžiamas. 10 dieną 56° baltasis vynas buvo duodamas 3 val. Akių obuoliai buvo paimti iš kraujo ir serumas buvo atskirtas. Po kraujo surinkimo pelės buvo paaukotos. Pasveriama, paimama dešinė kepenų skiltelė ir supilama į 10% formaldehido fiksacinį tirpalą, o likusi kepenų dalis dedama į šaldytuvą -20 °C temperatūroje.

2. 1. 3 Statistinis apdorojimas

Naudokite SPSS 11.5 statistinę programinę įrangą duomenims apdoroti, dispersijos analizei, P<0.05 is="" statistically="">

2. 1. 4 Cistanche salsa bendrojo glikozido poveikis pelių ūminio alkoholinio kepenų pažeidimo kūno svoriui, kepenų svoriui ir kepenų indeksui

Kaip parodyta 1 lentelėje, pelių kepenų svoris ir kepenų indeksas modelio grupėje buvo žymiai didesni nei tuščiosios kontrolinės grupės (P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1. 5 Bendras cistanche salsa glikozido poveikis serumui AST ir ALT

Surinktas kraujas buvo centrifuguojamas 3,5×103 r/min. 10 min. greičiu 10 min. serumui paruošti. Naudojant Lai metodą, ALT ir AST aktyvumui serume nustatyti buvo naudojami UV-Vis spektrofotometro 505 nm rodmenys. Kaip parodyta 2 lentelėje, ALT ir AST serumas modelio grupėje buvo žymiai didesnis nei tuščiojo kontrolinio serumo (P)<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 6 Cistanche salsa suminio glikozido poveikis MDA kiekiui ir SOD aktyvumui kepenyse

Paimkite 0,3 g kepenų audinio, kad paruoštumėte 10% ir 1% homogenatų. 1 % kepenų homogenatas centrifuguojamas 3,5 × 103 r/min 103 kartus per minutę 10 min. ir imamas virš nuosėdų esantis skystis virš nuosėdų. Tirpalas, kepenų homogenate esantis baltymas buvo nustatytas Coomassie Brilliant Blue metodu. Paimkite 1% kepenų homogenato supernatanto, operuokite pagal SOD bandymo dėžutę ir mikroplokštelių skaitytuve nuskaitykite esant 450 nm bangos ilgiui. Paimkite 10 % kepenų homogenato virš nuosėdų, veikite pagal MDA nustatymo rinkinį ir išmatuokite absorbciją (A532) spektrofotometru esant bangos ilgiui 532 nm.

Kaip parodyta 3 lentelėje, MDA kiekis modelio grupės kepenyse buvo žymiai didesnis nei tuščiojo bandymo kontrolinėje grupėje (P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 7 Cistanche salsa viso glikozido poveikis patologiniams kepenų audinio pokyčiams pelėms

Patologinis tyrimas: kepenų audinys, fiksuotas 10% formaldehido, įprastinė parafino įterpta sekcija (pjūvio storis 5 μm), HE dažymas ir kepenų histopatologinių pokyčių stebėjimas šviesos mikroskopu.

Tuščios kontrolinės grupės kepenys yra tamsiai raudonos spalvos ir minkštos tekstūros. Kepenų audinio struktūra yra normali, o kepenų skilčių struktūra yra nepažeista. Jis yra daugiakampis su aiškiomis ribomis, o branduolys yra apvalus ir aiškiai išdėstytas ląstelės centre. Pelių kepenų tūris modelių grupėje ir bendras cistanche salsa vidutinių ir mažų dozių grupių glikozidas padidėjo, o spalva tapo geltona. Patologiniai pokyčiai mikroskopu daugiausia buvo riebalinė hepatocitų degeneracija, o ląstelėse buvo difuziniai lipidų vakuolai ir hepatocitai. Didelis, citoplazma yra užpildyta mažais lipidų lašeliais ir vakuolais, o branduolys vis dar yra centre. Teigiamos kontrolinės grupės ir bendro cistanche salsa didelės dozės grupės glikozido kepenų ląstelių lipidozė pelėms tam tikru mastu sumažėjo, o lipidų lašelių skaičius tam tikru mastu sumažėjo.

2. 2 Cistanche salsa suminio glikozido pagrindinė komponentinė analizė

2. 2. 1 Chromatografinės analizės sąlygos

Chromatografinės sąlygos buvo chromatografinė kolonėlė ZORBAX ODS (250×4,6 mm, 5 μm); judančioji fazė: metanolio 0,2% skruzdžių rūgšties tirpalas (27,5∶72,5), gradientinis eliuavimas; kolonėlės temperatūra 30 °C; srautas 1 ml/min. aptikimo bangos ilgis 334 nm. Esant pirmiau nurodytoms chromatografijos sąlygoms, atskyrimasežiuolėiracteosideyra geras.

2. 2. 2 Etaloninio tirpalo ruošimas

Tiksliai pasveriama 1,3 mg ir 1,2 mgežiuolėiracteosideetaloninė medžiaga 0,13 mg/ml ežiuolės etaloninės medžiagos tirpalui ir 0,12 mg/ml akteozido etaloniniam tirpalui paruošti.

2. 2. 3 Bandomojo tirpalo ruošimas

Tiksliai pasveriama 0,1082 g viso cistanche salsa ekstrakto glikozido ir judančiosios fazės tirpalu praskiedžiama iki 50 ml.

2. 2. 4 Linijinis ryšys

Tiksliai nubrėžkite pamatinį tirpalą 0. 06, 0. 12. 0. 18. 0. 24. 0. 30, 0. 48. 0. 54. 0. 72. 1. Esant 20 mg/ml, į skysčių chromatografiją iš eilės įpurškiama 5 μL ir apskaičiuojama regresijos lygtis su dviejų etaloninių medžiagų įpurškimo tūriu (μg) kaip abscissa ir atitinkamu smailės plotu kaip ordinatė. ežiuolėsidas: Y = 11,868 X-0,0785, R = 0,9997; acteozidas: Y = 18,026X-0,1913, R = 0,9997. Dėl to Echinacoside pamatinė medžiaga turi gerą linijinį ryšį nuo 0, 0635 iki 0, 4445 μg; akceleozido pamatinė medžiaga yra nuo 0,059 iki 1,18 μg Vidinis tiesinis ryšys yra geras.

2. 2. 5 Preciziškasis bandymas

Tiksliai nubrėžkite 10 μL to paties bandomojo tirpalo ir pakartokite injekciją 5 kartus pirmiau nurodytomis chromatografinėmis sąlygomis. Užrašoma chromatograma ir nustatomas smailės plotas. Rezultatas yra Echinacoside RSD 0,89%,RSD išacteoside yra 1, 87%, o tai rodo, kad instrumento tikslumas yra geras.

2. 2. 6 Stabilumo bandymas

Tas pats bandomasis tirpalas atitinkamai 0, 2, 4, 8, 16, 32, 40, 48 h temperatūroje tiksliai nubrėžia 10 L, įpurškiamas į skysčių chromatografą, užrašoma chromatograma ir išmatuojamas jo smailės plotas. Rezultatas yra Echinacoside 1 RSD. 58%, RSDacteosideyra 0. 49 %, nurodant, kad bandomasis tirpalas yra per 48 valandas

Stabilumas yra geras.

2. 2. 7 Pakartojamumo bandymas

Tiksliai pasverkite apie 0,2 mg tos pačios mėginių partijos, iš viso 5 dalis, ir paruoškite 5 dalis tirpalo. Taikant turinio nustatymo metodą, 10 μL tiksliai pipete įpilama į skysčių chromatografą, užrašoma chromatograma ir nustatomas smailės plotas. Rezultatas yra Echinacoside RSD 1,91% ir Verbascum glikozidų RSD buvo 2,08%, o tai rodo, kad nustatymo metodas turi gerą pakartojamumą.

2. 2. 8 Regeneravimo greičio bandymas

Tiksliai pasverkite 0,2 gbendras cistanche salsa glikozidas, pridėti tam tikrą kiekįežiuolė ir acteozidasetaloninės medžiagos atitinkamai paruošiamas bandomasis tirpalas pagal 2.2.3 punkte nurodytą metodą ir nustatomas pagal turinio nustatymo metodą nurodytomis chromatografinėmis sąlygomis. Rezultatas Vidutinis Echinacoside atsigavimo greitis yra 98. 49%, RSD 1. 06%, vidutinis acteozido susigrąžinimo rodiklis yra 97,35%, o RSD - 1,45%.

2. 2. 9 Mėginių nustatymas

Tiksliai nubrėžkite po 10 μL kiekvieno etaloninio tirpalo ir bandomojo tirpalo, įpurškkite mėginį, nustatykite pirmiau nurodytas chromatografijos sąlygas ir apskaičiuokite mėginio kiekį išoriniu etaloniniu metodu. Rezultatai pateikti 4 lentelėje Vidutinis ežiuolių skaičius yra 24,5%, o vidutinisacteosideyra 4, 6%.

3 Diskusija

Alkoholinis kepenų pažeidimas reiškia kepenų pažeidimą ir keletą patologinių pokyčių, kuriuos sukelia ilgalaikis gausus gėrimas. Ilgalaikis nesaikingas alkoholio vartojimas gali sukelti kepenų ląstelių pažeidimą, o tada išsivystyti kepenų fibrozė ir net kepenų cirozė [6]. Palyginti su modelio grupe, bendras cistanche salsa didelės dozės grupės glikozidas šiame eksperimente žymiai sumažino ALT ir AST aktyvumą pelių serume, žymiai sumažino MDA kiekį kepenyse ir žymiai padidino SOD aktyvumą, kuris tam tikru mastu sumažino kepenų ląstelių lipidozę. , Sumažinkite lipidų lašelių skaičių. Reikšmingo skirtumo tarp vidutinės ir mažos dozės grupės ir modelio grupės reikšmingo skirtumo nebuvo. Šio eksperimento rezultatai atitinka p tyrimų rezultatusvisų Cistanche glikozidų rotekcinis poveikis pelių alkoholiniam kepenų pažeidimui[7].

Bendras cistanche salsa glikozidas apsaugo kepenų ląstelių pažeidimusmažinant ląstelių membranos pralaidumą ir didinant ALT ir AST, išsiskiriančių į kraują, kiekį; tai gali padidinti SOD aktyvumą ir pašalinti daugybę laisvųjų radikalų, kuriuos gamina alkoholis organizmo metabolizme. ; Tai gali sumažinti MDA susidarymą ir neleisti jai pažeisti audinių ląstelių membranos struktūros [8-10]. Bendras cistanche salsa glikozidas turi apsauginį poveikį alkoholiniam kepenų pažeidimui ir yra kiekybinis poveikio ryšys. Tikrinant literatūrą, nėra kiekybinės cistanche salsa viso glikozido veikliųjų medžiagų analizės. Šiame dokumente turinysacteosideirežiuolė, pagrindinius cistanche salsa viso glikozido komponentus pirmą kartą kiekybiškai išanalizavo HPLC, kuris sudarė 29,1% visų glikozidų. Pateikite mokslinį pagrindą viso cistanche salsa glikozido kūrimui ir panaudojimui. Šiuolaikiniai farmakologiniai tyrimai parodė, kad Echinacozidas turi apsauginį poveikį PC12 ląstelėms, pažeistoms vandenilio peroksido ir oksidacinio streso pažeidimo kraujagyslinės demencijos žiurkėms [11,12]. Abuežiuolė ir acteozidas slopina hepatocitų citotoksiškumąsukeltas D GalN ir TNF-α [13]. Be to, spėjama, kadbendras cistanche salsa glikozidas apsaugo peles nuo alkoholinio kepenų pažeidimogali būti sustiprintasežiuolė ir acteozidasstiprinti ląstelių antioksidantų fermentų aktyvumą, pagerinti kepenų ląstelių antioksidacinį pajėgumą, taip išlaikant kepenų ląstelių plazmos membranos vientisumą, kad kepenų ląstelės galėtų normaliai veikti Gynybinės ir kompensacinės funkcijos. Mes toliau izoliuosime junginius būsimuose tyrimuose ir naudosime molekulinės biologijos metodus, kad ištirtume monomerinių junginių reguliavimą kepenų ląstelių apoptozėje ir jų ryšį su susijusių tikslinių genų reguliavimu.

Nuorodos

1 Zhang HW. Cheminių sudedamųjų dalių tyrimai ir

Cistanche salsa (C. A. Mey.) G. Beck pirštų atspaudas. Ho karštas: Vidinės Mongolijos medicinos koledžas, MSc. 2008.

2 Tian XF, Pu XP. Feniletanoidiniai glikozidai iš Cistanches salsa slopina apoptozę, kurią neuronuose sukelia metilo fenilpiridino jonai. J Ethnopharmacol, 2005, 97: 59-63.

3 Wang XW, Jiang XY, Wu LY. Cistanche glikozidų poveikis laisviesiems radikalams ir jo apsauga nuo OH·sukelto DNR pažeidimo in vitro China Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 Wu HH. Feniletanoidinių glikozidų iš Cistanche salsos paruošimas ir antioksidacinis aktyvumas. Nandzingas: Nandzingo žemės ūkio universitetas, magistro laipsnis, 2008 m.