RNA-Seq pagrįstas de Novo transkripto surinkimas ir Cistanche Deserticola mėsingo stiebo genų atradimas-Ⅱ

Visų išreikštų nuorašų funkcinė klasifikacija, pagrįsta genų ontologija ir KEGG duomenų bazėmis

Genų ontologijos (GO) anotacija buvo gauta iš UniProt anotacijos ir tapatybių asociacijos failo. Iš viso 20 907 nuorašai, sudarantys 32, 69% visų išreikštų sekų, buvo priskirti 1 745 funkciniams terminams. Iš visų funkcinių GO terminų daugumą sudarė priskyrimai biologiniam procesui (1 116, 63, 95%), po to - ląstelių komponentas (329, 18, 85%) ir molekulinė funkcija (300, 17, 20%). Priskirtos išreikštų nuorašų funkcijos apėmė platų GO kategorijų spektrą, o 10 geriausių GO terminų su daugiausiai komentarų turinčių nuorašų buvo išvardyti 3 lentelėje. Pateikiame visų išreikštų transkriptų pasiskirstymą trijose genų ontologijos kategorijose (molekulinė funkcija, ląstelių komponentas ir biologinis procesas) papildomame faile (S3 duomenų rinkinys). GO terminai, susiję su surišimo funkcijomis ir transferazės aktyvumu, daugiausia buvo pateikti molekulinės funkcijos kategorijoje. Kalbant apie surišimo funkcijas, daugiausiai buvo surišti katijonai (4 394 nuorašai), po to seka nukleotidų / nukleozidų surišimas (vidutiniškai 3 404 nuorašai) ir jungimasis su baltymais (2 422 nuorašai). Nors transferazės aktyvumo grupėje daugiausia yra pernešančių fosforo grupių (2256 nuorašai, 65,77%). Ląstelinių komponentų kategorijoje nuorašai buvo labiau išdėstyti tarpląstelėje (vidutiniškai 10 581 nuorašas), o biologinių procesų kategorijoje nuorašai buvo labiau susiję su biopolimero metabolizmo procese (vidutiniškai 6 683 nuorašai), o po to sekė ląstelių proceso reguliavimas (4 841 nuorašas). ), genų ekspresija (4 678 nuorašai) ir transportavimas (3 512 transkriptai).

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA ALZHEIMERIO LIGOS PREVENCIJAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Norint išgauti genus, dalyvaujančius lignino ir PhG biosintezėje, KEGG duomenų bazėje buvo ieškoma 21 358 nereikalingų potencialių baltymų sekų, palyginti su 13 augalų organizmų genų sekomis, ir jos buvo priskirtos 275 KEGG keliams su mažiausiai 5 rezultatais. 10 geriausių kelių, kurių sekos yra labiausiai suderintos, yra išvardyti 4 lentelėje. Dauguma kelių buvo susiję su pirminiais metaboliniais procesais, tokiais kaip aminorūgščių arba baltymų metabolizmas (ko01230, ko04141 ir ko04120), angliavandenių metabolizmas (ko01200 ir ko00500) ir nukleotidų arba nukleozidų metabolizmas (ko03018, ko00230 ir ko00240). Be to, yra 27 antriniai su metabolizmu susiję keliai (2 pav.), tokie kaip terpenoidų stuburo biosintezė, fenilpropanoidų biosintezė, karotinoidų biosintezė, izochinolino alkaloidų biosintezė ir tropano, piperidino ir piridino alkaloidų biosintezė. Šie rezultatai rodo, kad organizme vyko aktyvūs medžiagų apykaitos procesaiC. deserticolastiebo audinys. Visi išreikšti nuorašai, susiję su KEGG keliais, buvo išvardyti papildomame faile (S4 duomenų rinkinys). Nors tarp C. deserticola ir kitų augalų, tokių kaip ryžiai (S5 duomenų rinkinys), yra keletas reikšmingų pokyčių, mūsų pagrindinis šio tyrimo tikslas yra atskleisti visą C. deserticola stiebo transkripto profilį ir pavaizduoti susijusius PhG biosintezės kelius. kurie gali būti naudingi vadovaujant auginimui.

Kandidatų genai, koduojantys fermentus, dalyvaujančius lignino biosintezėje

Ligninas yra antras pagal gausumą natūralus antžeminis polimeras augalų karalystėje, sudarantis iki trečdalio medžiagos, esančios augalų ląstelių sienelėse. Ligninai, kaip svarbi ląstelių sienelių sudedamoji dalis, padeda transportuoti vandenį, suteikia mechaninę atramą ir struktūrinį vientisumą bei apsaugo nuo patogenų ir žolėdžių. Šie lignino vaidmenys yra labai vertingi palaikant požeminį C. deserticola erekcijos augimą dykumoje. Šiame tyrime pateikėme visą vaizdą apie C. deserticola lignino biosintezės kelius (3 pav.), kai lignino monomerai yra biosintetinami iš fenilalanino per daugybę fermentinių reakcijų, įskaitant hidroksilinimą, metilinimą, redukciją ir oksidacinį polimerizacijos procesą. Su lignino biosinteze susiję fermentai buvo aptikti trijų formų, daugiausia sintezuotų kraujagyslių audinyje (p-hidroksil-fenilo (H), guajacilo (G) ir siringilo (S) lignino) ir 5-hidroksil-guajacillignino, kuris buvo tik identifikuotas. COMT (kofeino rūgšties 3-O-metiltransferazė, EC 2.1.1.68) turintiems trūkumą (pvz., numušamiems) augalams.

Fenilalanino amoniako liazė (PAL, EC 4.3.1.24) yra pirmasis pagrindinis fermentas lignino biosintezės kelyje (3 pav.), kuris neoksidaciniu deamininimu fenilalaniną paverčia cinamono rūgštimi. Iš viso C. deserticola buvo sekvenuoti 6 297 PAL skaitymai ir surinkti 7 PAL nuorašai (5 lentelė). Palyginus sekų panašumus, nustatėme, kad 4 iš jų (komp28550_c1_seq1/2/3/5) turėjo daugiau nei 95 % panašumo su žinoma C. deserticola (gi|) mRNR seka. 289595227|gb|ADD12041.1|), o comp3}c1_seq4 ir comp25940_c0_seq1 turėjo atitinkamai 77 % ir 82 % panašumų. ORF prognozė atskleidė, kad 5 nuorašai turėjo potencialą koduoti baltymus ir buvo pernešti su aromatinės aminorūgšties liazės domenu (PF00221.14). Iš jų tik comp1}c1_seq4 transkriptas galėjo koduoti visą baltymų seką, susidedančią iš 718 aminorūgščių liekanų. Buvo pranešta, kad daugumoje augalų rūšių PAL kodavo maža daugiagenių šeima, pvz., 4 Arabidopsis thaliana, 5 Populus trichocarpa, 3 Scutellaria baicalensis ir 7 Cucumis sativus ir kt. Mūsų filogenetinė analizė parodė, kad buvo 4 PAL koduojantys genai C.

deserticola ir pavadinome juos atitinkamai CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 ir CdPAL4 (S2 pav.). 4-kumarato-CoA ligazė (4CL, EC 6.2.1.12) ir trans-cinnamato 4-monooksigenazė (CYP73A, EC 1.14.13.11) yra du fermentai, atsakingi už cinamono rūgšties pavertimą dikumarolio-CoA dviem atvirkštiniais būdais. įsakymus. Jie taip pat yra stuburuose, o jų išraiškos FPKM reikšmės yra atitinkamai 39,57 ir 51,93.

Keturių tipų ligninai buvo biosintezuoti skirtingais būdais, kuriuos valdė trys pagrindiniai fermentai: cinamoil-CoA reduktazė (CCR, EC 1.2.1.44), šikimato o-hidroksicinamoiltransferazė (HCT, EC 2.3.1.133) ir ferulatas{{1{1} {56}}}}hidroksilazė (F5H, EC 1,14.-.-). Buvo pranešta, kad CCR yra ligninų kelio kontrolinis taškas [50, 51], kuris katalizuoja X-CoA (X įskaitant dikumarolį, kafeoilą, feruloilą, 5-hidroksil-feruloilą ir sinapoilą) į Y-aldehidą (Y įskaitant p -puma, kafeoilas, koniferilas, 5-hidroksilkoniferilas ir snapas), o HCT katalizavo p-kumaroil-CoA į p-kumaroilšikimo rūgštį / p-kumaroilchino rūgštį. Du fermentai, kaip ir jungiklis, reguliavo P-hidroksil-fenilo ligninų arba kitų trijų tipų ligninų biosintezę. F5H buvo dar vienas šakos jungiklis, reguliuojantis siringilo ligniną ir 5-hidroksil-guajacilligniną. Kiti svarbūs fermentai, įskaitant kavos rūgšties 3-O-metiltransferazę (COMT, EC 2.1.1.68), kofeoil-CoA O-metiltransferazę (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) ir cinamilo alkoholio dehidrogenazę (CAD, EC 1.1.1.1.1. ) taip pat buvo aptikti išreikšti. Išsami informacija apie ekspresiją pateikta 6 lentelėje. Šie šiame tyrime nustatyti fermentų genai bus vertingas šaltinis atliekant šio svarbaus vaistinio augalo funkcinius genominius tyrimus. 10 genų, susijusių su ligninų biosintezės keliu, pateiktu 6 lentelėje, buvo atrinkti RT-qPCR patikrinimui, siekiant patvirtinti mūsų RNAseq rezultatus (4 pav.), o jų didelės koreliacijos (Pearson koreliacijos koeficientas: 0, 90343) parodė didelį mūsų transkripto analizės tikslumą ir atkuriamumą. S1 duomenų rinkinyje pateikiamos šioje analizėje naudojamos pradmenų sekos.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidatų genai, koduojantys fermentus, dalyvaujančius PhG biosintezėje

Yra žinoma, kad feniletanoidiniai glikozidai (PhG) yra pagrindinės C. deserticola veikliosios medžiagos, gerinančios lytinę potenciją, šalinančios laisvuosius radikalus ir stabdančios senėjimą. Trys cheminiai PhG komponentai yra organinė rūgštis, sacharidas ir feniletanolio aglikonas (3 pav.). Organinės rūgštys, įskaitant kavos rūgštį, ferulo rūgštį ir kumalio rūgštį, yra fenilpropanoido biosintezės kelio produktai. Sacharido komponentai, įskaitant gliukozę ir ramnozę, yra angliavandenių apykaitos takų produktai, tokie kaip krakmolo ir sacharozės metabolizmas, aminocukraus ir nukleotidų apykaitos, fruktozės ir manozės metabolizmas ir kt. Tačiau feniletanolio dalies biosintezės kelias dar nėra aiškus. Čia, remiantis mūsų sekos duomenimis, pasiūlėme du galimus feniletanolio biosintezės būdus. Vienas iš jų yra kavos rūgšties arba ferulo rūgšties kelias, taip pat žinomas kaip cinamono rūgšties kelias, panašus į lignino biosintezės pagrindinį kelią. Kitas yra pagrįstas fenilalanino metabolizmo keliu (3 pav.), kuriame fenilalaninas į feniletanolį buvo pasiektas žinomu „Enrlich keliu“, kuris pirmą kartą buvo aptiktas mielėse prieš šimtmetį ir patvirtintas petunijos žieduose, pomidoruose ir rožėse. C. deserticola stiebe buvo aptikti keturi fermentų genai, koduojantys aspartato/tirozino aminotransferazę, histidino-fosfato aminotransferazę ir pirminę aminooksidazę, kurie yra atsakingi už fenilalanino pavertimą feniletanoliu. Feniletanolio produktas gali būti toliau oksiduojamas monooksigenaze arba metilintas metiltransferaze į jo darinius (feniletanolio aglikoną), kurie dalyvauja PhG biosintezėje. Apibendrinant, buvo pasiūlyti du galimi feniletanolio aglikono biosintezės keliai.C. deserticolabet vis tiek reikia daugiau mokytis.

Diskusijos

Pastaraisiais metais augalų genomika sparčiai vystėsi taikant naujos kartos sekos nustatymo technologiją, o dykumų vaistinių augalų genomika buvo sutelkta tik nedaugeliu tyrimų. Būtina skubiai atlikti genominius ar transkriptominius tyrimus, kad suprastume jo prisitaikymą prie sausros ir druskingumo aplinkos ir pagrindinių bioaktyvių komponentų biosintezės kelią. Kai kurių medicinos augalų de novo transkripto atradimas,

Tokie kaip Panax ženšenis, Ginkgo biloba ir Glycyrrhiza uralensis pirmą kartą buvo panaudoti naudojant Roche 454 platformą dėl ilgo skaitymo ilgio. Dėl veiksmingų surinkimo galimybių naudojant trumpus skaitymus, ypač pranašesnius suporuotus nuskaitymus, „Illumina“ pagrįstas transkriptų sekos nustatymas ir surinkimas taip pat buvo plačiai naudojami modeliiniams ir nemodiniams organizmams. Šiame tyrime mes sukūrėme apie 8 G 101 bp porinio galo skaitymo ir sukūrėme ilgesnes unigenines sekas, kurių vidutinis ilgis yra 725 bp. Didelio masto specifiniai kamieno transkripto duomenys galėtų suteikti naudingų pamatinių duomenų ir būti naudojami C. deserticola bioaktyvių komponentų antriniam metabolizmui išgauti. Prieš surinkimą 81,62 % visų neapdorotų nuskaitymų buvo praėję griežtos kokybės filtrus (įskaitant adapterio apipjaustymą ir prastos kokybės nuskaitymų išmetimą), o tai rodo aukštą mūsų sekos duomenų kokybę, o 82,08 % aukštos kokybės nuskaitymų buvo naudingi surinkimui. Kiti skaitymai, kurių nepavyko panaudoti surinkimui, gali atsirasti dėl sekos klaidų, surinkimo parametrų ir kt. Tie nepanaudoti aukštos kokybės skaitymai išliko naudingi tobulinant de novo surinkimą kartu su ilgesniais skaitymais iš kitos platformos (pvz., Roche 454).

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Daugybė surinktų nuorašų (30 098) parodė didelius sekų panašumus į žinomus genus viešose duomenų bazėse, o tai rodo, kad mūsų Illumina pagrindu pagrįsti porinio galo duomenys apėmė didelę C. deserticola nuorašų dalį. Nuorašai be BLAST smūgių gali atsirasti dėl 3' arba 5' neišverstų sričių, nekoduojančios RNR arba naujų C. deserticola genų sekų. Išreikšti nuorašai buvo pažymėti įvairioms GO kategorijoms ir KEGG takams (3 ir 4 lentelės), kuriuose daugelis nuorašų buvo priskirti antriniams su metabolizmu susijusiems keliams. Kaip žinome, fenilpropanoidas gali veikti kaip indukuojamas antimikrobinis junginys, labai naudingas požeminiam gyvenimo būdui [1], taip pat veikti kaip signalinė molekulė augalų ir mikrobų sąveikoje, be medicininio naudingumo [68, 69]. Terpenoidas naudojamas biologiškai aktyvių komponentų (tokių kaip 6- deoksikatalpolo) biosintezei [70]. Mes nustatėme, kad C. deserticola genų, dalyvaujančių fenilpropanoido ir terpenoidų stuburo biosintezės kelyje, yra labai daug. Dar svarbiau, kad gerai atstovaujamų lignino biosintezės būdų atradimas (3 pav.) parodė aktyvų lignino metabolinį procesą C. deserticola stiebe. Visi žinomi fermentų genai, dalyvaujantys lignino biosintezėje (3 pav.), buvo aptikti išreikšti, o keturi pagrindiniai fermentai, įskaitant PAL, CCR, HCT ir F5H, turėjo mažesnį ekspresijos gausą (atitinkamai FPKM 26,47, 3,89, 3,4 ir 3,83), palyginti su kitų fermentų genų (6 lentelė). Verta toliau tirti, ar šių trijų genų ekspresijos pokytis gali turėti įtakos lignino gamybai C. deserticola. PAL yra pagrindinis fermentas lignino biosintezėje, taip pat dalyvauja fenilpropanoido, resveratrolio, flavonoido ir kumarino biosintezėje [71–74]. C. deserticola genome (S2 pav.) aptikome keturis skirtingus PAL genus, kurie sutapo su tuo, kad PAL kodavo maža daugiagenių šeima [39, 43, 45–49] ir toliau įrodėme, kad jis gali vaidinti svarbų vaidmenį metaboliniame anglies sraute. .

PhG yra pagrindinė C. deserticola veiklioji medžiaga. C. deserticola kokybei svarbūs genai, dalyvaujantys feniletanolio biosintezėje. Mes nustatėme du skirtingus fenilo etanolio ir 17 fermentų genų, dalyvaujančių PhG biosintezėje C. deserticola kamiene, biosintezės kelius. Galimi procesai po kavos / ferulo rūgšties (3 pav.) taip pat pirmą kartą buvo išvesti remiantis struktūrine tarpinių produktų ir atitinkamų fermentų katalizinių savybių formule, kurioje kavos / ferulo rūgštis pirmiausia būtų oksiduojama į fenilpiruvato darinį; tada karboksilo grupę atėmė dekarboksilazės; galiausiai aldehido grupė buvo paversta atgal į alkoholio grupę dehidrogenazės pagalba. Tai pirmasis Illumina suporuoto galo sekos nustatymo technologijos pritaikymas, skirtas ištirti visą C. deserticola transkriptą ir surinkti RNR seką be etaloninio genomo. Šis tyrimas suteiks naudingų išteklių ir genų sekos C. deserticola funkcinės genomikos ir proteomikos tyrimams ateityje.

Išvados

Šiame tyrime mes profiliavome C. deserticola stiebo transkriptą, remdamiesi didelio našumo sekos nustatymo duomenimis, nustatėme genus, dalyvaujančius lignino biosintezės keliuose, ir taip pat pirmą kartą padarėme išvadą apie galimą PhG biosintezės kelią, o tai tikrai paspartins supratimą. dviprasmiškų fiziologinių procesų ir didelės medicininės vertės molekuliniu lygmeniu. Iki šiol tai yra pirmasis bandymas de novo surinkti visą C. deserticola stiebo transkriptą ir aptikti vaistinių komponentų biosintezės kelią naudojant Illumina pagrįstus sekos duomenų rinkinius. Mūsų tyrimas gali paskatinti natūralių vaistų kūrimą ir vaistinių savybių turinčių veislių atranką.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%