Anotacija
Pagrindiniai faktai AKI yra dažnas užsikrėtimo SARS-CoV-2 pasekmė ir prisideda prie COVID-19 sunkumo ir mirtingumo. Čia mes patikrinome hipotezę, kadinkstų pakitimaisu COVID-19 susijusio AKI gali būti aptiktos ląstelėse, surinktose iš šlapimo. Metodai Atlikome vienos ląstelės RNR seką (scRNAseq) aštuonių hospitalizuotų pacientų, sergančių COVID-19 su (n55) arba be AKI (n53), taip pat keturių pacientų, sergančių ne COVID-19 AKI, šlapimo. (n54), kad įvertintų ląstelių sudėties ir genų ekspresijos skirtumus AKI metu. Rezultatai 30 076 ląstelių analizė atskleidė įvairius ląstelių tipus, kurių dauguma buvoinkstų, urotelinės ir imuninės ląstelės. Pacientų, sergančių AKI, kanalėlių ląstelių analizė parodė, kad nuorašai, susiję su su pažeidimais susijusiais keliais, praturtėjo, palyginti su tais, kurie neturi AKI. Tarp atkurtų ląstelių tipų ACE2 ir TMPRSS2 ekspresija buvo didžiausia urotelio ląstelėse. Pažymėtina, kad vienam pacientui urotelio ląstelėse aptikome SARS-CoV-2 viruso RNR. Tos pačios ląstelės buvo praturtintos nuorašais, susijusiais su antivirusiniais ir priešuždegiminiais keliais. Išvados Sėkmingai atlikome scRNAseq tyrimą su šlapimo nuosėdomis iš hospitalizuotų pacientų, sergančių COVID-19, kad neinvaziškai ištirtume su AKI susijusius ląstelių pokyčius, ir sukūrėme duomenų rinkinį, apimantį ir sužeistas, ir nepažeistas inkstų ląsteles. Be to, pateikiame preliminarius įrodymus, kad šlapimo pūslės ląstelės užsikrėtė SARS-CoV-2. Šlapimo nuosėdose yra daug informacijos ir jos yra naudingas šaltinis tiriant patofiziologiją ir ląstelių pakitimus, vykstančiusinkstų ligos.
EKOLOGIŠKAS SVEIKATOS MAISTO PRODUKTAS INKSTU SVEIKATAI
Įvadas
Sunki ūminio respiracinio sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) infekcija sukelia patologiją keliose sistemose, įskaitant inkstus, o AKI yra susijusi su dideliu sergamumu ir mirtingumu nuo 2019 m. koronavirusinės ligos (COVID{4}}) (1) –5). Keli tyrimai parodė didelį AKI skaičių tarp hospitalizuotų pacientų, sergančių COVID-19 (6), o kai kurie praneša, kad iki 50 % užsikrėtusių asmenų serga AKI (7–9). Pirminis SARS-CoV-2 receptorius ACE2 ekspresuojamas epitelio ląstelėse visoje šlapimo sistemoje, įskaitant proksimalines kanalėlių ląsteles ir urotelio ląsteles (10–13), nors neaišku, ar AKI pacientams, sergantiems COVID{17}} yra dėl tiesioginės virusinės proksimalinių kanalėlių infekcijos arba dėl sisteminio atsako į SARS-CoV-2 (14–22). Taip pat neaišku, ar SARS-CoV-2 gali sukelti virusinį cistitą tiesiogiai užkrėsdamas urotelio ląsteles, nors tokia galimybė buvo pasiūlyta (23–26). Nepaisant didelio su COVID-19 susijusio AKI paplitimo, pagrindiniai ląstelių pokyčiai, atsirandantys AKI aplinkoje, išlieka menkai suprantami.
Su COVID-19 susijęs AKI išliko iš esmės nepakankamai ištirtas, nes norint pasiekti inkstų audinį reikia biopsijos arba pomirtinės analizės (27). Naujausi tyrimai parodė, kad šlapime yra įvairių inkstų, šlapimo pūslės ir imuninių ląstelių (28–30). Taigi šlapimas gali suteikti vertingos informacijos apie neinvazinį inkstų pokyčių tyrimą su COVID-19 susijusio AKI metu. Čia atlikome vienos ląstelės RNR sekos nustatymą (RNA-Seq), kad apibūdintume ląstelių įvairovę hospitalizuotų pacientų, sergančių COVID-19 su AKI ir be jo, šlapime. Išbandėme hipotezę, kad su COVID-19 susijusio AKI inkstų pakitimai gali būti aptikti ląstelėse, surinktose iš šlapimo. Taip pat rinkome mėginius iš pacientų, nesergančių COVID{9}} ir AKI (ne COVID-19 AKI). Su COVID-19 susijusioje AKI aptikome keletą uždegiminių imuninių ląstelių populiacijų ir skirtingai aktyvuotų būdų, taip pat preliminarių įrodymų.tiesioginei urotelio ląstelių infekcijai SARS-CoV-2.
Medžiagos ir metodai
Dalyviai ir kintamieji 18 metų ir vyresni suaugusieji buvo tikrinami priimant arba pervežant į Alabamos universitetą Birmingamo (UAB) ligoninėje 2021 m. kovo–gegužės mėn. AKI atvejai buvo nustatyti naudojantInkstų ligaGeresnis visuotinių rezultatų apibrėžimas kaip kreatinino (sCr) padidėjimas serume.{0}}.3 mg/dl per 48 valandas arba .1,53 pradinis kreatinino kiekis. Kontrolės be kreatinino kiekio buvo atrinktos pagal amžių ir lytį, jei įmanoma, ir apdorotos su kiekvienu atitinkamu AKI mėginiu. Pradinis sCr buvo nustatytas naudojant naujausią sCr vertę 7–365 dienas prieš hospitalizavimą. Papildomi klinikiniai duomenys apie demografinius duomenis, ligos istoriją, klinikines charakteristikas ir laboratorines vertes buvo paimti iš pacientų diagramų per UAB „Clinical and Translational Sciences“ i2b2 komanda. Buvo įtraukti aštuoni hospitalizuoti pacientai, sergantys COVID{9}}, penki sergantys AKI ir trys be AKI. Šį tyrimą ir pavyzdžių rinkinį patvirtino UAB Institucinė peržiūros taryba. UAB „Acute Nephrology Consult Team“ taip pat rinko mėginius iš pacientų, sergančių ne COVID-19 AKI (n54), kad palygintų ląstelių pokyčius su su COVID-19 susijusiais AKI. Jie buvo surinkti pagal kitą institucinės peržiūros tarybos protokolą, leidžiantį paimti likusius šlapimo mėginius ir todėl yra anonimiški.
Mėginių paėmimas ir apdorojimas
Visi žingsniai buvo atlikti ant ledo. Šlapimas buvo paimtas kaip tuščias mėginys arba iš šlapimo kateterio. Mėginiai buvo nedelsiant perkelti į 21 biologinio saugumo lygio laboratoriją apdoroti. Šlapimo mėginiai buvo perkelti į 50- ml kūginį mėgintuvėlį ir centrifuguoti esant 10003 g 10 minučių 4 C temperatūroje. Ląstelių nuosėdos buvo plaunamos lediniu PBS, filtruojamos per 40- mm filtrą ir vėl centrifuguojamos. Gyvos ląstelės buvo išgrynintos naudojant MACS šiukšlių šalinimo rinkinį (Miltenyi Biotec), po to EasySep Annexin V negyvų ląstelių pašalinimo rinkinį (StemCell). Trumpai tariant, ląstelės buvo resuspenduotos lediniame PBS ir sumaišytos su šiukšlių pašalinimo tirpalu. Šaltas PBS buvo padengtas ant mišinio ir centrifuguojamas 3003 g 10 minučių 4 °C temperatūroje. Viršutinės dvi fazės buvo išsiurbtos, o likusios ląstelės plaunamos PBS. Ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos ir sumaišytos su negyvų ląstelių pašalinimo kokteiliu, biotino atrankos kokteiliu ir tada su RapidSpheres prieš atskiriant EasySep magnetu. Ląstelės buvo plaunamos ir resuspenduojamos 52 ml PBS (be kalcio ar magnio) 10,04% BSA (Fisher Scientific), kad būtų galima apdoroti scRNAseq
scRNRseq
Išgrynintos ląstelės buvo perkeltos į UAB „Flow Cytometry“ ir „Single Cell Core“ ir nedelsiant apdorotos naudojant Chromium 39 Single-Cell RNA Sequencing Kit (103).Genomika) pagal gamintoją's instrukcijas.Ląstelių suspensija buvo suskaičiuota, kartu su 103 Chromo reagentų mišinys ir įpilamas į mikroFluidinisvieno langelio skaidymo įtaisas, kuriame vyksta lizė ir atvirkštinis procesastranskripcija vyksta mikrolašeliuose. Gauta cDNRbuvo amplifiPGR metodu ir vėliau apdorojamas, kad gautųsi
brūkšniniu kodu pažymėtos sekos bibliotekos. Suporuotas galas buvo atliktas naudojant Illumina NovaSeq6000 arba NextSeq500 sekos platformą (Illumina). Skaitymai buvo apdorotinaudojant 103 Genomics Cell Ranger vienos ląstelės programinė įranga6 komplekto versija.{1}} UAB „Cheaha High-Performance“.Skaičiavimo klasteris. BCLfiles buvo konvertuoti į FASTQfiNaudodami CellRanger greitąją funkciją. CellRangerGreitas buvo naudojamas FASTQ suderintifiles prie pasirinkto genomosusidedantis iš hg38 žmogaus genomo (GRCh38.p13) su
SARS-CoV-2 genomas (NC_045512.2), įterptas kaip egzonas (31). Analizei buvo sukurta genų lentelė, brūkšninių kodų lentelė ir transkripcijos išraiškos matricosnurodyta toliau.
Duomenų analizės
Analizės buvo atliktos naudojant R statistinės analizės aplinkai (4.06 versija) sukurtus paketus. Duomenys pirmiausia buvo analizuojami Seurat 3.2.3 versijoje (32,33) ir jossusijusios priklausomybės. Kiekvieno paciento duomenysbuvo importuoti naudojant Read103 funkcija ir tada struktūrapaverstas Seurat objektu naudojant CreateSeuratObject. Užkokybės kontrolė, unikaliomis savybėmis pasižyminčių ląstelių skaičius viršija 2500arba mažiau nei 200 ir ląstelės, turinčios mitochondrijų proporcijas.buvo 15 procfiišfiltruotas. Duomenys buvo normalizuoti naudojant žurnaląNormalizuokite ir pakeiskite mastelį, kad pasiruoštumėte linijiniam matmeniuisumažinimas. Atskirų pacientų objektai buvo pažymėtisu unikalia grupės identifikacijafikatijonus, o po to susiliejo į avienas objektas naudojant Seurat sujungimo funkciją. Pacientas sambuvo integruoti su RunHarmony funkcija naudojantHarmony R paketą (34). Pagrindinių komponentų analizėbuvo atliktas, o tada ląstelės buvo sugrupuotos remiantisdiferencinė genų ekspresija, kaip nustatyta SeuratFunkcija FindAllMarkers nustatyta į vienos skiriamąją gebą. Dimenaszoninis redukcija buvo atlikta naudojant vienodą kolektoriųaproksimacija ir projekcija. Ląstelių tipai buvo identifikuotifiredlyginant skirtingai išreikštus nuorašus užkiekvienas klasteris su žinomais transkriptais, susijusiais su specfic ląstelių tipai (29,35,36). Paleisti buvo naudojamas Escape R paketasGenų rinkinio praturtinimo analizė (GSEA) (37). WebGestaltRbuvo naudojamas genų ontologijos analizei, siekiant nustatyti keliusnaudojant Biologinį procesą ir Kioto enciklopedijąGenų ir genomų duomenų bazės (38).
