Natrio tiosulfatu papildytas UW tirpalas apsaugo inkstų transplantatus nuo užsitęsusio peršalimo išemijos ir reperfuzijos sužalojimo, naudojant pelių singeninės inkstų transplantacijos modelį

Susisiekite: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang ir kt

Cistanche tubulosa neleidžiainkstasliga, spustelėkite čia, kad gautumėteproduktai ir Cistanche Nz

SANTRAUKA

Įvadas:Šaltasis išemijos-reperfuzijos pažeidimas (IRI) yra neišvengiamas įvykis, dėl kurio padaugėja komplikacijų po transplantacijos. Anksčiau mes įrodėme, kad Viskonsino universiteto (UW) tirpalo papildymas FDA nepatvirtintomis vandenilio sulfido (H2S) donoro molekulėmis sumažina šaltą IRI ir pagerina inkstų transplantato funkciją po transplantacijos. Šiame tyrime tiriama, ar FDA patvirtinta H2S donoro molekulė, natrio tiosulfatas (STS), turės tokį patį arba geresnį poveikį kliniškai svarbiame singeninio ortotopinio žiurkių modelyje.inkstastransplantacija.

Metodas:Trisdešimčiai Lewis žiurkių buvo atlikta dvišalė nefrektomija, po kurios buvo persodinta singeninė ortotopinė kairiojiinkstaspo 24-val. laikymo UW arba UW plus STS tirpale 4 ◦C temperatūroje. Žiurkės buvo stebimos iki 14 dienos po transplantacijos ir nužudytos, kad įvertintų inkstų funkciją (šlapimo išsiskyrimą, kreatinino kiekį serume ir kraujo šlapalo azotą).Inkstassekcijos buvo nudažytos H&E, TUNEL, CD68 ir mieloperoksidaze (MPO), kad būtų galima nustatyti ūminę kanalėlių nekrozę (ATN), apoptozę, makrofagų infiltraciją ir neutrofilų infiltraciją.

Rezultatas:UW ir STS transplantatai parodė reikšmingai pagerėjusią transplantato funkciją iškart po transplantacijos, o recipiento išgyvenamumas pagerėjo, palyginti su UW transplantatais (p < {0}},05).="" histopatologinis="" tyrimas="" atskleidė="" reikšmingai="" sumažintą="" atn,="" apoptozę,="" makrofagų="" ir="" neutrofilų="" infiltraciją="" bei="" priešuždegiminių="" ir="" proapoptotinių="" genų="" reguliavimą="" uw="" ir="" sts="" transplantatuose,="" palyginti="" su="" uw="" transplantatais="" (p=""><>

Išvada:Pirmą kartą parodome, kad inkstų transplantatų išsaugojimas STS papildytame UW tirpale apsaugo nuo užsitęsusio šalto IRI, slopindamas apoptotinius ir uždegiminius kelius ir taip pagerindamas transplantato funkciją bei pailgindamas recipiento išgyvenamumą. Tai gali būti nauja kliniškai taikoma terapinė strategija, siekiant sumažinti žalingą klinikinį ilgalaikio šalto IRI rezultatą.inkstastransplantacija.

Raktiniai žodžiai:Natrio tiosulfatas (STS) Išemijos ir reperfuzijos pažeidimas (IRI) Statinis šaldymas (SCS)Inkstastransplantacija Transplantato ir recipiento išgyvenimas

1. Įvadas

Inkstastransplantacija yra optimalus gydymas galutinėje stadijojeinkstasinkstųliga (ESRD). Palyginti su dialize,inkstastransplantacija yra pranašesnė, nes užtikrina geresnę gyvenimo kokybę ir reikšmingą išgyvenimo pranašumą bei ekonomiškumą [1–3]. Tačiau donoro inkstų paėmimas iš prigimties yra susijęs su išemijos-reperfuzijos pažeidimu (IRI), neišvengiama kraujo tėkmės nutraukimo ir vėlesnio atkūrimo per transplantaciją pasekmė [4]. Dabartinė transplantacijos sukeltos IRI mažinimo strategija yra inkstų transplantatų statinis šaldymas (SCS) standartiniuose konservavimo tirpaluose, tokiuose kaip Viskonsino universiteto (UW) tirpalas ant ledo 4 ◦C temperatūroje prieš transplantaciją [5]. Tačiau buvo įrodyta, kad užsitęsęs SCS yra susijęs su padidėjusia ląstelių mirtimi, uždegimu ir kitais žalingais ląsteliniais ir molekuliniais įvykiais, dėl kurių galiausiai padidėja uždelsta transplantato funkcija (DGF), ūminė kanalėlių nekrozės (ATN) ir sumažėjęs transplantatas. išgyvenimas [6–10]. Be to, siekiant neatsilikti nuo visame pasaulyje didėjančio ESRD dažnio ir vis didėjančio pacientų, patenkančių į transplantacijos laukiančiųjų sąrašus, skaičiaus, daugelis transplantacijos centrų priima inkstų transplantatus su ilgais šaltais išeminiais laikotarpiais, o tai dar labiau prisideda prie bendro audinių pažeidimo. Po SCS vyksta reperfuzija, kai šiltas deguonies prisotintas kraujas atstatomas į šaltą išeminį transplantatą. Reperfuzija, kuri yra išeminio pažeidimo efektorinė fazė, pasižymi padidėjusiu audinių pažeidimu [11–13].

Galima terapinė strategija, skirta apriboti šaltą IRI perinkstastransplantacija apima standartinio konservavimo tirpalo papildymą vandenilio sulfidu (H2S), endogeniniu būdu gaminamu dujų siųstuvu, kuris, kaip įrodyta, atlieka svarbų fiziologinį vaidmenį plečiant kraujagysles ir perduodant ląstelinius signalus [14–16]. Anksčiau mes parodėme, kad užsitęsęs SCS H2S papildytame UW tirpale sumažina transplantacijos sukeltą šaltą IRI ir pagerina transplantato išgyvenamumą pelių modeliuose su singenine ir alogenine inkstų transplantacija [17–19, 41, 42]. Tačiau šiuose tyrimuose naudotos H2S donorų molekulės nėra kliniškai gyvybingos. Tai paskatino svarstyti galimybę naudoti natrio tiosulfatą (STS), H2S donoro vaistą, kurį patvirtino Maisto ir vaistų administracija (FDA), gydyti NSRD sergančių pacientų kalcifilaksiją, cisplatinos sukeltą toksiškumą gydant vėžį ir kaip priešnuodį apsinuodijimas cianidu [20–23]. Naujausi tyrimai parodė, kad STS turi apsauginį poveikį IRI gyvūnų modeliuose [24–26]. Tačiau jo poveikis transplantacijos sukeltam šaltam inkstų IRI nežinomas. Todėl šiame tyrime tiriamas renoprotekcinis STS poveikis inkstų IRI ir žiurkių singeninės ortotopinės inkstų transplantacijos modelio in vitro modelyje.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Eksperimentinis in vitro protokolas

Apsauginiam STS poveikiui inkstų IRI metu įvertinti buvo naudojamas šalto hipoksijos ir šilto reoksigenacijos pažeidimo in vitro modelis, kuris imituoja ląstelių sąlygas šalto IRI metu in vivo. Eksperimentuose in vitro buvo naudojamos žiurkės inkstų epitelio ląstelės (NRK{{0}}E ląstelių linija; ATCC, JAV), nes šios ląstelės yra jautrios išeminiam pažeidimui [27], o jų naudojimas atitinka žiurkės transplantacijos modelis, naudojamas antrajam šio tyrimo tikslui. Ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM), turinčioje 1 0 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS), inaktyvuoto šiluma 60 ◦ C temperatūroje 20 min., ir 1 procentą penicilino / streptomicino (P/S). Ląstelės buvo inkubuojamos normaliomis augimo sąlygomis – 37 ◦C, 21 proc. O2 ir 5 proc. CO2. Kontrolinės ląstelės buvo tokiomis pat sąlygomis, kaip ir priešeksperimentinėse ląstelėse. Eksperimentinės ląstelės buvo apdorotos terpe be serumo (SF), SF ir 200 nM AP39 arba SF su įvairiomis koncentracijomis (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) natrio tiosulfato pentahidrato (STS), kurie buvo gauti iš 250 mg/mL injekcinis STS tirpalas (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Buvo naudojama 200 nM AP39 koncentracija, nes anksčiau parodėme, kad tokia koncentracija AP39 yra citoprotekcinis prieš tą pačią ląstelių liniją panašiame šalto IRI modelyje [20]. Tada ląstelės buvo inkubuojamos 10 ◦ C temperatūroje 24 valandas hipoksinėmis sąlygomis (5 proc. CO2, 0,5 proc. O2, 95 proc. N2) HypOxystation H85 hipoksijos kameroje (HYPO2YGEN, JAV), kad būtų sukeltas išeminis peršalimas. Naudota hipoterminė 10 ◦C temperatūra, nes tai buvo žemiausia temperatūra, kurią buvo galima technologiškai pasiekti išlaikant 0,5 procento hipoksijos O2 lygį. Po hipoksijos terpė su eksperimentinėmis ląstelėmis buvo pakeista kontroline terpe, o ląstelės reoksigenizuotos inkubuojant normaliomis augimo sąlygomis (37 ◦C, 21 proc. O2 ir 5 proc. CO2) 24 valandas, kad būtų imituojama reperfuzija ir su ja susiję pažeidimai. Po 24 valandų reoksigenacijos ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas ląsteles nudažant su FITC konjuguotu aneksinu-V (FITC-Aneksin-V; BioLegend, JAV) ir 7-aminoaktinomicinu D (7-AAD; BioLegend, JAV). ), kuris atitinkamai matuoja ląstelių apoptozę ir nekrozę. Ląstelės buvo analizuojamos naudojant srauto citometriją, naudojant CytoFLEX S (Beckman Coulter, JAV). FlowJo 11 versija (FlowJo LLC, JAV) buvo naudojama tinkamai surinkti duomenis statistinei analizei.

2.2. Eksperimentiniai gyvūnai

Trisdešimt 275–300 g sveriančių Lewis žiurkių patinų, įsigytų iš Charles River (St. Constant, QC, Kanada), standartinėmis sąlygomis buvo laikomos Vakarų universiteto (Londonas, ON) gyvūnų priežiūros ir veterinarijos paslaugų įstaigoje. Tyrimus su gyvūnais patvirtino Vakarų universiteto gyvūnų priežiūros ir naudojimo taryba su protokolo ID 2018–155.

2.3. Inksto persodinimo modelis

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 procentų svorio netekimas) arba mirtis. Humaniški galutiniai taškai buvo tikrinami du kartus per dieną ir visos žiurkės buvo nužudytos CO2 ekspozicijos kameroje esant 40 procentų srautui. Eutanazijos metu nebuvo jokių chirurginių komplikacijų, dėl kurių rezultatai galėjo skirtis.

2.4. Inkstų funkcijos analizė

Po inksto transplantacijos žiurkės buvo stebimos medžiagų apykaitos narveliuose 14 dienų ir po to nužudytos. Kraujo ir šlapimo mėginiai buvo paimti pagal POD 3, 5, 7, 10 ir 14, siekiant nustatyti inkstų funkcijos parametrus (kreatinino kiekį kraujyje, karbamido azotą [BUN], šlapimo osmoliškumą ir šlapimo išsiskyrimą). BUN ir kreatinino kiekis serume buvo gauti iš inksto transplantacijos recipientų, o fiktyviai operuotų žiurkių buvo matuojamas naudojant IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer aparatą (Markham, ON). Šlapimo osmoliškumo lygiai buvo nustatyti užšalimo taško osmometrijos metodu, naudojant 3320 Osmometer aparatą (Advanced Instruments, Norwood, MA) ir lyginami su įmonės pateiktais standartais.

2.5. Histopatologinė ir morfometrinė analizė

Į parafiną įterpti inkstų audiniai buvo supjaustyti į 4 µm storio dalis ir histologijai pritvirtinti ant mikroskopinių stiklelių. Sekcijos buvo nudažytos hematoksilinu ir eozinu (H&E), terminalo deoksinukleotidiltransferazės dUTP slapyvardžio žymėjimu (TUNEL), kad būtų nustatytas atitinkamai ATN ir apoptozės laipsnis. Apakęs inkstų patologas H&E sekcijas įvertino ATN pagal šią schemą: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 procentai transplantato ATN. Inkstų sekcijos taip pat buvo nudažytos šiais pirminiais antikūnais: inkstų pažeidimo žymekliu (KIM-1), makrofagų paviršiaus žymekliu CD68 ir neutrofilams specifiniu fermentu mieloperoksidaze (MPO; Abcam®, Torontas, Kanada) ir vizualizuojami antriniais antikūnais ir DAB substrato chromogenas naudojant Dako Envision System (Dako, Glostrup, Danija) pagal gamintojo protokolą, po to analizuojamas skaitmeniniu šviesos mikroskopu Eclipse 90i (Nikon® Instruments, Niujorkas) 10 kartų padidinus ir kiekybiškai įvertintas ImageJ programine įranga v. 1.8 (National Sveikatos institutai, Bethesda, MD).

2.6. Kiekybinė PGR analizė

Bendra RNR buvo išskirta iš inkstų transplantato audinių, gautų naudojant POD 3, naudojant RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Torontas, Kanada), ir atvirkštinė transkribuota į cDNR naudojant OneScript® Plus cDNR sintezės rinkinį (ABM, Kanada) kartu su oligo(dT)12– 18 gruntų pagal gamintojo protokolą. Prieš naudojimą izoliuota RNR ir kDNR buvo analizuojami naudojant nanodrop (DeNovix DS-11 spektrofotometrą, Kanada), o A260/280 reitingai nuosekliai buvo atitinkamai > 1,95 ir > 1,8. Kiekvieno qPCR mėginio reakcijos mišinys buvo 20 µL ir buvo pagamintas pagal Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) protokolą ir analizuojamas naudojant CFX Connect Real-Time PGR aptikimo sistemos įrenginį (Bio-Rad, Kanada). . Pradmenų sekos buvo sukurtos naudojant Primer-BLAST programinę įrangą (NCBI) nuo beta aktino, poli (ADP-ribozės) polimerazės (PARP), gama interferono (IFN-), naviko nekrozės faktoriaus-alfa (TNF-), interleukino 6 (IL). -6), B-ląstelių limfoma 2 (Bcl-2), Bcl-2- susijęs X baltymas (BAX), kaspazė 3, BH3 sąveikaujantis domeno mirties agonistas (BID), c-Jun N-galo kinazė 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktyvatorius 1 alfa (PGC-1), mitochondrijų kompleksas I (NDUFB8), mitochondrijų kompleksas II (SDHB), mitogenu aktyvuota baltymų kinazė 1/2 (ERK1). /2), neutrofilų želatinazės lipokalino (NGAL) ir inkstų pažeidimo molekulės-1 (KIM-1) genų. Visi dominantys genai buvo normalizuoti prieš beta aktiną. Genų ekspresijos kartotiniai pokyčiai buvo lyginami su fiktyviai operuotomis žiurkėmis ir buvo apskaičiuoti naudojant ΔΔCt metodą.

2.7. Statistinė analizė

Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant GraphPad (La Jolla, CA) Prism statistikos programinės įrangos paketą, 9 versija.{1}}. Išgyvenamumo duomenys buvo analizuojami naudojant Kaplan-Meier išgyvenamumo analizę ir log rank testą, o qPCR geno ekspresijos duomenys buvo analizuojami naudojant nesuporuotą vienpusį t testą. Visi kiti duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), po to Tukey post-hoc testą, siekiant nustatyti statistinius skirtumus tarp grupių. Statistinis reikšmingumas buvo priimtas p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Rezultatai

3.1. STS papildyta terpė be serumo pagerina inkstų kanalėlių epitelio ląstelių išgyvenimą šaltos hipoksijos / reoksigenacijos metu

Srauto citometrijos analizė po dažymo dėl apoptozės ir nekrozės parodė, kad NRK{{0}}E ląstelės, apdorotos SF in vitro šalto IRI metu, žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą, palyginti su kontrolinėmis (normoksinėmis) ląstelėmis (1A pav.; p < 0.05).="" nors="" visi="" eksperimentiniai="" mėginiai="" parodė="" žymiai="" mažesnį="" inkstų="" kanalėlių="" epitelio="" ląstelių="" gyvybingumą="" nei="" ląstelės,="" išaugintos="" normaliomis="" sąlygomis="" (p="">< 0,05),="" ląstelės,="" apdorotos="" sf,="" papildytu="" 150="" µm="" ir="" 500="" µm="" sts,="" parodė="" žymiai="" didesnį="" gyvybingumą="" nei="" gydytų.="" naudojant="" tik="" sf="" terpę="" (1a="" pav.;="" p="">< 0,05),="" kuri="" atitiko="" žymiai="" sumažėjusią="" apoptozę,="" palyginti="" su="" ląstelėmis,="" apdorotomis="" vien="" tik="" sf="" terpėmis="" (1b="" pav.;="" p="">< 0,05).="" be="" to,="" atrodo,="" kad="" ląstelių="" gyvybingumo="" padidėjimas="" ir="" apoptozės="" sumažėjimas="" pasiekia="" optimalų="" lygį="" su="" 150="" µm="" ir="" 500="" µm="" sts,="" nes="" didesnė="" dozė="" pakeitė="" šias="" tendencijas="" (1a="" ir="" b="">

3.2. UW tirpalo papildymas STS pagerina ankstyvą inkstų transplantato išgyvenimą ir funkciją

Inkstų transplantatų išsaugojimas STS papildytame UW tirpale reikšmingai pagerino recipiento išgyvenamumą – iki POD 14 (nužudymo diena) išgyveno 83 proc., palyginti su kontroline grupe be STS papildymo, kuri parodė 12,5 proc. išgyvenamumą, ypač per pirmąsias 3 dienas (1 pav.). 2A; p < 0.05).="" be="" to,="" sts="" papildymas="" žymiai="" pagerino="" transplantato="" funkciją="" ankstyvuoju="" laikotarpiu="" po="" transplantacijos,="" palyginti="" su="" gydymu="" vien="" uw.="" kreatinino="" ir="" bun="" kiekis="" serume="" buvo="" reikšmingai="" padidėjęs="" tiek="" uw,="" tiek="" uw="" ir="" sts="" grupėse="" pagal="" pod="" 3,="" o="" tai="" koreliavo="" su="" sumažėjusiu="" šlapimo="" osmoliškumu,="" palyginti="" su="" apgaulingu="" (2b,="" c="" ir="" 3a="" pav.;="" p="">< 0).{25="" }}5).="" tačiau="" kreatinino="" ir="" bun="" koncentracija="" serume="" uw="" ir="" sts="" grupėje="" reikšmingai="" sumažėjo="" pod="" 3="" ir="" atitinkamai="" padidėjo="" šlapimo="" osmoliškumas,="" palyginti="" su="" uw="" grupe="" (2b,="" c="" ir="" 3a="" pav.;="" p="">< 0,05).="" įdomu="" tai,="" kad="" kreatinino="" ir="" bun="" koncentracijos="" serume="" uw="" ir="" sts="" grupėje="" nuolat="" mažėjo="" nuo="" pod="" 3="" iki="" pod="" 14,="" padidėjus="" šlapimo="" osmoliškumui="" ir="" buvo="" panašios="" į="" apgaulingo="" (2b,="" c="" ir="" 3a="" pav.).="" be="" to,="" šlapimo="" išsiskyrimas="" uw="" ir="" sts="" grupėje="" per="" pirmąsias="" keturias="" pooperacines="" dienas="" buvo="" žymiai="" didesnis,="" palyginti="" su="" uw="" ir="" sham="" grupėmis="" (3b="" pav.;="" p="">< 0,05).="" tačiau="" jis="" nuolat="" mažėjo="" link="" pradinės="" (fiktyviosios)="" vertės="" ir="" buvo="" panašus="" į="" apgaulingą="" pod="" 14,="" o="" šlapimo="" išsiskyrimas="" išgyvenusioms="" žiurkėms="" uw="" grupėje="" išliko="" didesnis="" nei="" pradinė="" pod="" 14="" vertė="" (3b="">

3.3. STS pridėjimas prie UW tirpalo sumažina transplantacijos sukeltą ląstelių mirtį po inksto transplantacijos

Inkstų pjūviai, gauti naudojant POD 3 ir 14, buvo nudažyti TUNEL kaip apoptozinių ląstelių mirties matas ir įvertinti apakusio inkstų patologo (4A pav.). Inkstų transplantatų iš UW grupės POD 3 apoptozinių ląstelių mirtis buvo žymiai didesnė, kaip rodo didesnis TUNNEL balas, palyginti su UW ir STS bei fiktyvių grupių inkstais (5A ir b pav.; p < 0).{11}="" }5).="" skiepai="" iš="" uw="" ir="" sts="" grupės="" reikšmingai="" nesiskyrė="" nuo="" sham="" tuo="" pačiu="" metu="" ir="" esant="" pod="" 14="" (4b="" pav.).="" be="" to,="" nors="" transplantatų="" iš="" uw="" ir="" uw="" plius="" sts="" grupių="" pod="" 3="" atn="" balai="" žymiai="" padidėjo,="" palyginti="" su="" fiktyviąja="" grupe="" (5="" pav.;="" p="">< 0.05),="" uw="" ir="" sts="" skiepai="" parodė="" sumažėjusius="" atn="" balus="" pod="" 3="" lyginant="" su="" uw="" (5="" pav.;="" p="">< 0,05).="" be="" to,="" nors="" uw="" transplantatų="" gavėjai="" neišgyveno="" iki="" pod="" 14,="" todėl="" jų="" atn="" balų="" nebuvo="" galima="" nustatyti="" pagal="" pod="" 14,="" uw="" ir="" sts="" transplantatų="" gavėjai="" išgyveno="" iki="" pod="" 14,="" tačiau="" jų="" atn="" balai="" žymiai="" padidėjo,="" palyginti="" su="" netikrų="" grupe="" (1="" pav.).="" 5;="" p=""><>

3.4. Inkstų transplantatų, išsaugotų STS papildytame UW tirpale, po inksto transplantacijos sumažėjo traumų žymenys ir uždegiminis infiltratas

Inkstų pjūviai, gauti naudojant POD 3 ir 14, buvo nudažyti KIM-1, kad būtų aptiktas proksimalinis kanalėlių pažeidimas, taip pat CD68 (makrofagų žymuo) ir MPO (neutrofilų žymeklis), ir įvertintos apakusio inkstų patologo (6A, 7A pav., ir C). Inkstų audinių KIM-1, CD68 ir MPO ekspresija buvo žymiai didesnė UW grupėje su POD 3, palyginti su UW ir STS bei fiktyviomis grupėmis (6B, 7B ir D pav.; p < {{11}="" }.05),="" nors="" šių="" žymenų="" ekspresija="" uw="" ir="" sts="" transplantatuose="" reikšmingai="" nesiskyrė,="" palyginti="" su="" apgaulinga="" pod="" 14="" (6b,="" 7b="" ir="" d="" pav.;="" p=""> 0,05).

3.5. STS papildymas UW tirpalu slopino priešuždegiminių, proapoptotinių ir mitochondrijų genų ekspresiją inkstuose

Priešuždegiminių, proapoptotinių, į mitochondrijas nukreiptų ir inkstų pažeidimo žymenų genų ekspresija buvo nustatyta naudojant qRT-PGR transplantuotuose inkstuose, gautuose naudojant POD 3. Prouždegiminių genų IFN-, TNF- ir IL{{8 }} buvo ženkliai padidėjęs UW transplantatuose, palyginti su UW ir STS transplantatais ant POD 3 (8A pav.; p < 0.05)="" ir="" atitiko="" tą="" patį="" modelį="" su="" proapoptotiniais="" genais="" parp,="" bax="" ,="" kaspazės-3,="" bid,="" jnk1="" ir="" jnk2="" (8a="" pav.;="" p="">< 0.05),="" o="" antiapoptozinio="" bcl-2="" ekspresija="" uw="" buvo="" šiek="" tiek="" padidėjusi="" plius="" sts="" grupė,="" palyginti="" su="" uw="" grupe,="" nors="" šis="" padidėjimas="" nepasiekė="" statistinio="" reikšmingumo="" (8a="" pav.).="" be="" to,="" mitochondrijų="" genų="" pgc-1,="" ndufb8="" (i="" kompleksas)="" ir="" sdhb="" (ii="" kompleksas)="" ekspresija="" uw="" transplantatuose="" buvo="" žymiai="" mažesnė,="" palyginti="" su="" uw="" ir="" sts="" transplantatais="" (8b="" pav.;="" p="">< 0="" .05),="" o="" atvirkščiai="" buvo="" pastebėta="" naudojant="" erk1="" ir="" erk2="" išraiškas="" (8b="" pav.;="" p="">< 0,05).="" be="" to,="" kim-1="" geno="" ekspresija="" uw="" transplantatuose="" buvo="" reikšmingai="" padidinta,="" palyginti="" su="" uw="" ir="" sts="" transplantatais="" (8c="" pav.;="" p="">< 0,05),="" o="" sumažėjusi="" ngal="" ekspresija="" uw="" ir="" sts="" transplantatuose="" nepasiekė="" statistinio="" reikšmingumo,="" lyginant="" su="" uw="" skiepai="" (8c="" pav.;="" p=""> 0,05).

4. Diskusija

Šiame tyrime nustatytas standartinio konservavimo tirpalo papildymas STS, kliniškai gyvybingu FDA patvirtintu H2S donoru, siekiant sušvelninti transplantacijos sukeltą šaltą inkstų IRI, pagerinti transplantato kokybę ir pailginti recipiento išgyvenamumą. Naudodami in vitro inkstų IRI ir žiurkių singeninės ortotopinės inkstų transplantacijos modelį, pirmą kartą parodome, kad UW tirpalo papildymas STS ilgo SCS metu apsaugo nuo organų ir organų.

Pagrindinė mūsų in vitro modelio išvada yra ta, kad STS papildymas terpėje be serumo apsaugo inkstų epitelio ląsteles nuo šaltos hipoksijos ir šilto reoksigenacijos sukeltos apoptozės ir padidina gyvybingumą, o tai atitinka mūsų ankstesnį tyrimą, kuriame parodėme apsauginį mitochondrijų poveikį. - tikslinis H2S donoro vaistas, AP39, in vitro šalto inkstų IRI modelyje [20]. Įdomu tai, kad didesnė 1 mM STS koncentracija pakeitė teigiamą poveikį, o tai reiškia, kad STS pasireiškia dvifaziu dozės ir atsako reiškiniu, vadinamu hormeze, kai mažesnė koncentracija yra citoprotekcinė, o didesnė koncentracija yra citotoksinė. Mitochondrijų pažeidimas yra pagrindinė inkstų IRI pasekmė, nes mitochondrijų pralaidumas gali slopinti adenozino trifosfato (ATP) gamybą ir padidinti reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS), destruktyvaus audinių pažeidimo tarpininko, susidarymą [13]. Neseniai buvo pasiūlyta, kad mitochondrijos yra pagrindinė STS veiklos vieta. Yra žinoma, kad STS ne tik generuoja H2S mitochondrijose per nuo glutationo priklausomą redukciją ir atvirkščiai per sulfido oksidacijos kelią, bet ir išsaugo mitochondrijų ATP sintezę, mažina ROS gamybą ir pagerina sudėtingą fermentų veiklą elektronų transportavimo grandinėje (ETC) [24]. ,28–30]. Be to, naujausi tyrimai parodė, kad STS žymiai padidino PGC-1, teigiamo mitochondrijų biogenezės ir ATP gamybos reguliatoriaus [26], ekspresiją, o tai atitinka mūsų in vivo stebėjimą. Šie molekuliniai mechanizmai gali lemti žymiai padidintą mitochondrijų ETC kompleksų I ir II (atitinkamai NDUFB8 ir SDHB) ekspresiją mūsų inkstų transplantacijos modelyje, padidinus išgyvenamumą ir funkciją, kaip pastebėta inkstų transplantatuose, išsaugotuose STS papildytame UW tirpale.

Remdamiesi mūsų in vitro rezultatais, nusprendėme ištirti, ar apsauginis STS poveikis yra taikomas in vivo naudojant transplantacijos modelį, kuriame šaltas IRI yra pagrindinis transplantato disfunkcijos ir padidėjusių komplikacijų po transplantacijos veiksnys. Mūsų išvados rodo, kad ilgesnis (24 val.) inkstų transplantatų SCS STS papildytame UW tirpale žymiai pagerina transplantato kokybę ir funkciją, kuriai būdingas sumažėjęs kreatinino ir BUN kiekis serume, didesnis šlapimo kiekis ir ilgesnis recipiento išgyvenamumas, palyginti su transplantatais, išsaugotais vien UW tirpale. . Svarbu pažymėti, kad greitas šlapimo išsiskyrimas net po klinikinės inksto transplantacijos yra kritinis rezultatas, lemiantis, ar reikalinga dializė, kad būtų pašalinta uždelsta transplantato funkcija (DGF). Todėl mūsų pastebėjimas, kad STS padidina šlapimo išsiskyrimą iš karto po transplantacijos ir yra panašus į „Sham“ grupę pagal POD 14, yra daug žadantis atradimas. Pastebėtas inkstų funkcijos pagerėjimas po transplantatų, išsaugotų STS papildytame UW tirpale, transplantacijos taip pat suteikė reikšmingą išgyvenamumo pranašumą. Kiekybiškai STS papildymas pailgino transplantato gyvavimo laiką taip, kad 83 procentai (5/6) žiurkių, gavusių UW ir STS skiepus, išgyveno iki POD 14 (numušimo diena), palyginti su tik 12,5 procento (1/8) žiurkių recipientų. skiepai, konservuoti UW tirpale be STS papildymo. Ši šio tyrimo išvada taip pat atitinka mūsų ankstesnį tyrimą, kuriame tik 14 procentų (1 iš 7) žiurkių recipientų transplantatų buvo išsaugoti UW tirpale 24 valandas be H2S (GYY4137) papildų ir išgyveno iki POD 14 [20]. .

STS papildymas ne tik pagerino inkstų funkcijos parametrus, bet ir slopino inkstų transplantato apoptozę ir uždegimą, nes sumažino proapoptotinių ir uždegiminių genų ekspresiją audiniuose, tuo pačiu padidindamas antiapoptotinių genų reguliavimą ir sumažindamas CD68-teigiamų makrofagų ir MPO teigiami neutrofilai, dėl kurių sumažėjo KIM{5}} ekspresija ir ATN bei galiausiai išsaugoma inkstų morfologija. Yra žinoma, kad šie uždegiminiai citokinai yra ląstelių mirties tarpininkai šalto IRI metu [31], o jų UW ir STS transplantatų sumažėjimas greičiausiai dėl gerai žinomų STS savybių mažina endotelio pralaidumą kraujagyslių endotelio viename sluoksnyje, susilpnina citokinų gamybą. ir skatina priešuždegiminių citokinų gamybą [32]. Be to, mūsų išvados, kad STS papildymas UW tirpalu sumažina priešuždegiminių genų ekspresiją, atitinka ankstesnio tyrimo apie STS priešuždegiminį aktyvumą, nes sumažina TNF- ir IL{13}} kiekį sergant neurologinėmis ligomis [33]. ,34]. Mechaniškai STS inaktyvuoja kaspazę-3, prisijungdamas prie jos aktyvios vietos stipriais vandenilio ryšiais ir taip užkertant kelią natūralaus substrato patekimui į aktyviąją vietą, galiausiai sustabdant apoptozę [35]. STS taip pat blokuoja JNK, baltymo, vaidinančio lemiamą vaidmenį apoptozinėje signalizacijoje, aktyvavimą [35], o tai patvirtina mūsų išvadą apie STS mažinantį poveikį kaspazei3 ir JNK. Tačiau mes negalime nustatyti, ar tokie mechanizmai veikia šiame tyrime, nes neatlikome papildomų eksperimentų šiems molekuliniams mechanizmams ištirti.

Pagrindinis mūsų in vitro eksperimento apribojimas yra mūsų techninis iššūkis naudoti dabartinę standartinę konservavimo temperatūrą 4 ◦ C [36], nes mūsų naudojama 10 ◦ C buvo žemiausia temperatūra, kurią galima technologiškai pasiekti nepakenkiant hipoksinei aplinkai. Tai tikras skirtumas ląstelių fiziologinių procesų ir išsaugojimo metodų atžvilgiu. Galimas sprendimas yra panaudoti chemiškai sukeltą hipoksiją plastikiniame maišelyje ir įdėti jį į 4 ◦C šaldytuvą, kad atspindėtų klinikines SCS sąlygas. Tačiau šie anaerobinės atmosferos generavimo maišeliai buvo sukurti naudoti šiltoje temperatūroje (21–37 ◦C), nes tokiomis sąlygomis veikia cheminiai junginiai, sukeliantys hipoksinę aplinką. Būsimuose tyrimuose turėtų būti siekiama optimizuoti temperatūrą hipoksijos kameroje, kad būtų imituojami klinikiniai SCS nustatymai. Pasiekus pastovią 4 ◦C temperatūrą nepažeidžiant hipoksinės aplinkos, galėsime nustatyti, ar stebimi fenotipai eksperimentiniame in vitro šalto IRI modelyje yra nuosekliai išreikšti. Be in vitro eksperimento, mūsų žiurkių transplantacijos modelis taip pat neturi trūkumų. Atlikome singeninę inkstų transplantaciją (genetiškai identiški donorai ir recipientai, turintys imunologinį suderinamumą), kuri taikoma tik identiškiems dvyniams atliekant klinikinę inkstų transplantaciją, o dauguma klinikinių inkstų transplantacijų yra alogeninės (genetiškai skirtingi donorai ir recipientai). Alogeninė transplantacija verčia transplantacijos recipientus prieš transplantaciją atlikti imunologinius tyrimus, siekiant nustatyti donoro žmogaus leukocitų antigenus (HLA; molekules, sukeliančias ir reguliuojančias imuninį atsaką), nustatyti donorų ir recipientų imunologinį suderinamumą ir išvengti organų atmetimo [37, 38]. Būsimuose STS tyrimuose turėtų būti atsižvelgiama į alogeninę transplantaciją. Kitas ribojantis inkstų persodinimo modelis yra tai, kad mes sutelkėme dėmesį į gyvus donorus, neoptimalūs transplantatai iš donorystės po širdies mirties (DCD) donorų tampa vis labiau paplitę kaip donoro inkstų šaltinis daugelyje transplantacijos centrų visame pasaulyje [39]. DCD veikia donoro organus įvairiais šiltos išemijos laikotarpiais, be šaltų išemijos laikotarpių SCS metu, ir yra susijęs su padidėjusiu DGF dažniu ir sumažėjusiu transplantato išgyvenamumu, palyginti su gyvais donorais [40]. Todėl būsimuose tyrimuose reikėtų atsižvelgti į DCD inkstų transplantacijos modelį, kad būtų galima įvertinti STS poveikį IRI šiame modelyje.

Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų tyrimas rodo, kad standartinio konservavimo tirpalo papildymas kliniškai gyvybingu H2S donoro vaistu ilgalaikio inkstų transplantatų SCS metu apsaugo nuo transplantacijos sukelto šalto inksto IRI, pagerina bendrą transplantato kokybę ir transplantato funkciją bei pailgina transplantato recipiento išgyvenamumą. Atsižvelgiant į tai, kad DGF rizika didėja ilgėjant šalčio išemijos laikui atliekant klinikinę inksto transplantaciją, o tai kelia didelį klinikinį susirūpinimą, pastebėjimas, kad STS apsaugo inkstų transplantatus užsitęsus SCS ir apsaugo nuo DGF po transplantacijos, yra puikus klinikinis pažadas, galintis sumažinti arba užkirsti kelią DGF dažnis klinikinės inkstų transplantacijos metu artimiausiu metu. Taigi būsima STS pridėjimo prie išsaugojimo sprendimų nauda gali būti galimas šios tebesitęsiančios problemos sprendimas. Apskritai šis tyrimas papildo vis gausėjančią literatūrą, patvirtinančią STS ir kitų H2S donorų citoprotekcinį poveikį organų IRI, ypač gerinant transplantacijos rezultatus transplantacijos sukelto šalto inkstų IRI atveju. Šios strategijos galėtų palengvinti daugiau transplantatų, kurie yra veikiami ilgo šalto išemijos laiko, naudojimą, o tai gali padidinti persodinamų organų skaičių.

CRediT autorystės pareiškimas

Visi autoriai sutiko su šio rankraščio pateikimu. Interesų konflikto nėra.

Nuorodos

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford ir kt., Mirtingumo palyginimas tarp visų dializuojamų pacientų, pacientų, kuriems atliekama dializė ir laukia transplantacijos, ir pirmosios lavono transplantacijos recipientai, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll ir kt., Sisteminė apžvalga: inkstų transplantacija, palyginti su dialize kliniškai reikšmingais rezultatais, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte ir kt., Inksto transplantacijos iš DCD Italijoje ekonomiškumas, transplantacija. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia- reperfusion trauma, Eur. J. Traumos iškilo. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Organų išsaugojimas: dabartinės koncepcijos ir naujos strategijos ateinančiam dešimtmečiui, Transfus. Med. Hemotina. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Cold ischemia and the long-term Survival of cadaveric renal allografts, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo ir kt., Pagrindinis uždelsto transplantato funkcijos ir šalto išemijos laiko poveikis inkstų transplantato išgyvenimui, Nephrol. Surinkite. Transplantacija. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Šalčio išemijos laiko įtaka transplantato išgyvenimui tarp ECD transplantacijos recipientų: porinė inkstų analizė, Am. J. Transplantacija. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, recipiento rizikos veiksniai, susiję su uždelsta transplantato funkcija: suporuota inkstų analizė, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay ir kt., Kiekviena papildoma peršalimo išemijos valanda žymiai padidina transplantato nepakankamumo ir mirtingumo po inkstų persodinimo riziką, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondrijai skirti antioksidantai: ateities perspektyvos inkstų išemijos-reperfuzijos pažeidimo atveju, Oxid. Med. Ląstelė Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oksidacinis stresas, kurį sukelia mitochondrijų kalcio perteklius, Ann. NY Akad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Mitochondrijų vaidmuo išemijos / reperfuzijos pažeidimo atveju, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Transplantacija. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Vandenilio sulfidas ir ląstelių signalizacija: komandos žaidėjas ar teisėjas? Augalų fiziol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, H(2)S, kaip naujo endogeninio dujinio K(ATP) kanalo atidarytojo kraujagysles atpalaiduojantis poveikis, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter ir kt., Gydymas vandenilio sulfidu sumažina inkstų transplantato išemijos ir reperfuzijos pažeidimą sandėliuojant šaltai ir pagerina ankstyvą persodinto inkstų funkciją bei išgyvenamumą po alogeninės inksto transplantacijos, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Papildomas vandenilio sulfidas apsaugo transplantato inkstų funkciją ir pailgina recipiento išgyvenamumą po ilgalaikio šalčio išemijos ir reperfuzijos pažeidimo, sumažindamas inkstų transplantato apoptozę. ir uždegimas, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian ir kt., Vandenilio sulfidas apsaugo inkstų transplantatus nuo užsitęsusio šalčio išemijos ir reperfuzijos pažeidimo per specifinius mitochondrijų veiksmus, Am. J. Transplantacija. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Natrio tiosulfatas ūminiam apsinuodijimui cianidu: tyrimas su žiurkės modeliu, Ann. Pharm. Kun. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri ir kt., Natrio tiosulfatas apsaugo nuo inkstų funkcijos sutrikimo po hiperterminės intraperitoninės chemoterapijos (HIPEC) su cisplatina, Int. J. Hipertas. 37 (1) (2020) 897–902.