Kiekybinis uždegiminių infiltratų įvertinimas atliekant inkstų persodinimo biopsijas, naudojant multipleksinį tiramido signalo stiprinimą ir gilų mokymąsi

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke'as Hermsenas¹Valerijus Volkas²Janas Hinrichas Bräsenas²ir kt

Abstraktus

Uždelsta transplantato funkcija (DGF) yra stiprus intersticinės fibrozės ir kanalėlių atrofijos (IFTA) rizikos veiksnys persodinus inkstus. Kiekybinis uždegiminių infiltratų įvertinimas DGF pacientų inkstų biopsijose gali atskleisti nuspėjamuosius IFTA vystymosi žymenis. Šiame tyrime sujungėme multipleksinį tiramido signalo stiprinimą (mTSA) ir konvoliucinius neuroninius tinklus (CNN), kad įvertintume uždegiminę mikroaplinką DGF pacientų (n=22) inkstų biopsijose, paimtose praėjus 6 savaitėms po transplantacijos. Pacientai buvo suskirstyti pagal IFTA vystymąsi (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola apsaugo nuo inkstų ligos, spustelėkite čia, kad gautumėte mėginį

Įvadas

Uždelsta transplantato funkcija (DGF) po inksto transplantacijos yra daugiafaktorinė ir daugiausia susijusi su donoro savybėmis ir išemijos laiku. DGF paprastai apibūdinamas kaip dializės poreikis per 7 dienas po transplantacijos ir yra stiprus lėtinio inkstų transplantato pažeidimo rizikos veiksnys [1–3]. Klasikinis lėtinio inkstų pažeidimo komponentas yra intersticinė fibrozė ir kanalėlių atrofija (IFTA). Tačiau ne visi DGF pacientai progresuoja iki IFTA vystymosi, o sudėtingas ryšys tarp DGF ir IFTA vis dar menkai suprantamas. Pirma, taip yra dėl delsos tarp galimai priežastinių įvykių ir funkcinio nuosmukio, o antra, dėl kintamo ir sudėtingo galimų induktorių poveikio, pavyzdžiui, atmetimo ir šalutinio vaisto poveikio [1, 4]. Daugelyje tyrimų buvo aprašytas bendras uždegimas ir specifiniai makrofagai kaip transplantato praradimo prognozė [5–8]. Tačiau pagrindiniai patologiniai procesai nėra visiškai suprantami, o didelis uždegimo lygis ne visada sukelia ilgalaikį transplantato praradimą. Dėl aplinkos dirgiklių makrofagai įgyja specializuotas funkcijas ir poliarizuojasi į skirtingus fenotipus. Daugybė tyrimų rodo, kad specifiniai makrofagų potipiai (alternatyviai aktyvuoti makrofagai) dalyvauja audinių remodeliavime, sukeldami audinių atstatymą arba fibrozę. Yra žinoma, kad poliarizacija link audinių remodeliavimosi (kartais profibrotinio) fenotipo priklauso nuo daugybės aplinkos dirgiklių, be kita ko, T-pagalbininkų limfocitų potipių [9–11]. Įvertinus T-pagalbininkų ląstelių populiacijas transplantate DGF metu, buvo nustatytas paplitęs T-pagalbininkas 1 potipis, tačiau koreliacijos su transplantato baigtimi ar progresavimu į IFTA iki šiol nebuvo ištirtos [12]. Išsamus uždegiminės mikroaplinkos įvertinimas, ypač sutelktas į makrofagus ir T pagalbininkų ląstelių pogrupius kruopščiai atrinktose pacientų grupėse, gali padėti suprasti, kodėl kai kurie, bet ne visi DGF pacientai progresuoja kuriant IFTA.

Tačiau išsamų uždegiminių infiltratų tyrimą trukdo keli (techniniai) apribojimai. Tradicinės imunohistochemijos (IHC) ir imunofluorescencijos metodai palaiko tik riboto skaičiaus ląstelių žymenų vizualizavimą vienoje audinio dalyje. Smulkių vertingų audinių fragmentų, tokių kaip inkstų biopsijos, nuosekliai dalyti nepageidautina, o skirtingų skyrių ląstelių ryšius aiškinti sunku. Be to, kiekybinis uždegiminių infiltratų įvertinimas vizualiniu įvertinimu yra reikšmingas tarp stebėtojų kintamumo lygis [13]. Tradiciniai vaizdo apdorojimo metodai, tokie kaip pikselių slenkstis, vandens takoskyra ir morfologija pagrįstas segmentavimas, remiasi išankstinėmis žiniomis apie visas morfologines ląstelių reprezentacijas ir audinių dėmių intensyvumą visame duomenų rinkinyje [14–16]. Todėl šiems metodams dažnai trūksta biologinių ir techninių vaizdų variacijų tvirtumo ir jie prastai perkeliami į naujus ar išorinius duomenų rinkinius. Skaitmeninės patologijos atsiradimas paspartino alternatyvių visos skaidrės vaizdų (WSI) vertinimo metodų kūrimą [17, 18]. Įrodyta, kad giluminio mokymosi modeliai, ypač konvoliuciniai neuroniniai tinklai (CNN), gali segmentuoti ir aptikti atitinkamas biologines struktūras histopatologinėse skaidrėse [19–23]. Šie metodai gali pereiti nuo subjektyvaus vizualinio įvertinimo ir tradicinio vaizdo apdorojimo prie tikslaus, objektyvaus ir atkuriamo ląstelių aptikimo.

Šio tyrimo tikslas – sukurti objektyvaus, kiekybinio daugelio uždegiminių ląstelių žymenų įvertinimo metodą, apeinant būtinybę atlikti platų nuoseklų skaidrės pjūvį. Norėdami tai padaryti, deriname multipleksinius IHC, daugiaspektrinius vaizdus ir gilaus mokymosi modelius. Norėdami parodyti šių metodų pritaikomumą, tiriame uždegiminės mikroaplinkos, kiekybiškai įvertintos gilaus mokymosi modeliais, sąsajas su IFTA plėtra atliekant DGF pacientų stebėjimo transplantato biopsijas.

cistanche ekstraktas gydo inkstų ligas

medžiagos ir metodai

Norėdami įvertinti uždegiminę mikroaplinką DGF pacientų inkstų biopsijose, atlikome multipleksinę IHC stebėjimo biopsijose, paimtose praėjus 6 savaitėms po transplantacijos. Pacientai buvo suskirstyti pagal IFTA vystymąsi (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Audinių mėginiai

Naudojome Hanoverio medicinos mokyklos (Hanoveris, Vokietija) inkstų transplantacijos recipientų stebėjimo biopsijas, gautas vykdant būsimą stebėjimo biopsijos programą. Įtraukimo kriterijai buvo šie: DGF atsiradimas (apibrėžiamas kaip<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA vertinimas

Intersticinės fibrozės (ci) ir kanalėlių atrofijos (ct) (IFTA) mastas po 6 savaičių ir 6 mėnesių, išreikštas naudojant Banff pažeidimo vertinimo sistemą [24], buvo gautas iš patologijos ataskaitos. Siekiant išsamiau įvertinti ryšį tarp ankstyvų uždegiminių infiltratų ir IFTA vystymosi, visos PAS nudažytos skaidrės buvo suskaitmenintos, kad būtų galima pakartotinai ištirti naudojant Pannoramic 25{9}} Flash II skaitmeninį skaidrių skaitytuvą (3DHistech, Vengrija) su 20 × objektyvas, kurio skiriamoji geba yra 0,24 μm/pikselis. Abiejų laiko taškų (6 savaičių ir 6 mėnesių) PAS WSI įvertino trys inkstų patologai pagal IFTA mastą (paviršiaus ploto procentas, su 10 procentų intervalais). Vidutiniai patologų IFTA balai buvo naudojami kaip galutinis balas, siekiant apskaičiuoti IFTA pokytį nuo 6 savaičių iki 6 mėnesių po transplantacijos. Pacientai buvo suskirstyti pagal absoliutų IFTA balo padidėjimą 10 ar daugiau procentų (n=13), o ne arba<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Be to, Banffo pažeidimų balai buvo lyginami tarp laiko taškų naudojant Wilcoxon signed rangų testą. Tai atskleidė reikšmingus skirtumus tarp 6 savaičių ir 6 mėnesių Banff kategorijų ti (p=0.017), ci (p=0.004) ir ct (p=0.011) biopsijų. .

Daugkartinis TSA dažymas

Mes atlikome multipleksinį IHC, naudodami mTSA, kad vizualizuotume kelis ląstelių žymenis per 6 savaičių biopsijas. Po inkubacijos su pirminiu ir antriniu antikūnu audinys buvo apdorotas fluorescenciniu būdu pažymėtu tiramidu. Krienų peroksidazė iš antrinio antikūno katalizuoja aktyvių tiramido radikalų susidarymą. Tiramido radikalai kovalentiškai jungiasi su tirozino liekanomis ant antigeno. Šis nuolatinis surišimas leido karščiui pašalinti pirminio ir antrinio antikūnų kompleksą, išsaugant fluorescencinio tiramido nuosėdas [25]. Tai įgalino vėlesnį inkubavimą su kitais tos pačios rūšies antikūnais prieš tikslinius antigenus.

mTSA buvo atlikta dviejose iš eilės stiklelių iš 6 savaičių stebėjimo biopsijų. Sukūrėme dvi mTSA grupes, kad įvertintume uždegiminį infiltrą ir peritubulinių kapiliarų mastą mūsų pacientų grupėse. I skydelis buvo anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 ir CD34 antikūnų. II skydelis buvo naudojamas T-pagalbininkų ląstelių ir makrofagų poliarizacijai tirti naudojant anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 ir CD163 antikūnus. Antikūnų specifikacijos, skiedimai ir dažymo tvarka išvardyti 1 papildomoje lentelėje. Visos stiklelės buvo deparafinuotos ksilene, dehidratuotos 95 procentų etanolyje, plaunamos vandentiekio vandeniu ir virinamos 10 kartų praskiestame trisboratu-EDTA (T) , 0658, VWR Life Sciences, JAV) buferis. Po atvėsinimo stikleliai buvo plaunami 3 procentų vandenilio peroksidazės tirpalu endogeninei peroksidazei blokuoti ir plaunami tris buferiniu druskos buferiu su 0,05 procento Tween 20 (822184, Merck KGaA, Vokietija) (TBS-T). Baltymų blokavimas buvo atliktas naudojant TBS-T su 1 procentu galvijų serumo albumino (BSA) (mTSA 1 žingsnis). Pirminiai antikūnai buvo inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje arba per naktį keturių laipsnių Celsijaus temperatūroje (mTSA 2 žingsnis). Po plovimo TBS-T stikleliai buvo inkubuojami su HRP konjuguotu antriniu antikūnu (Poly-HRP-GAMs / Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Nyderlandai) 30 minučių kambario temperatūroje (mTSA 3 žingsnis). Tada TSA buvo atlikta naudojant Opal TSA fluoroforus iš Opal 7-color Manual IHC rinkinio (NEL811001KT, Akoya Biosciences, JAV) (mTSA 4 žingsnis) (fluoroforai ir juos atitinkantys antikūnai išvardyti 1 papildomoje lentelėje). Antikūno-TSA kompleksas buvo pašalintas virimo ciklu TBE buferyje (mTSA 5 žingsnis). mTSA 1–5 žingsniai buvo kartojami tol, kol stikleliai buvo nudažyti visais antikūnais iš atitinkamos plokštės. Skaidrės buvo padengtos fluoromount-G su DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, JAV).

herba cistanche

Daugkartinis TSA patvirtinimas

Pasikartojantys virimo ciklai gali turėti įtakos tikslinio epitopo afinitetui. Kai kurių antikūnų dažymas yra silpnesnis po to, kai audinys virinamas kelis kartus, kitiems antikūnams reikia daugiau virimo ciklų, kad būtų pasiektas optimalus dažymo intensyvumas, o kitiems antikūnai visiškai nepaveikiami. Šį poveikį visiems antikūnams įvertinome naudodami chromogeninį IHC FFPE kontroliniam tonzilių audiniui. Kiekvienam ištirtam antikūnui (n=9) buvo nupjautos šešios dalys (4 μm storio). Visi stikleliai buvo deparafinuoti ksilene, dehidratuoti 95 procentų etanolyje, nuplauti vandeniu iš čiaupo ir virinami 10 kartų praskiestame TBE (pirmas virimo ciklas). Atvėsus, vienas tiriamas antikūnas buvo laikomas fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Likusios skaidrės vėl virtos. Šis ciklas buvo pakartotas penkis kartus. Vėliau visi stikleliai buvo plaunami 3 procentų vandenilio peroksidazės tirpalu ir po to nuplaunami PBS. Pirminiai antikūnai (1 papildoma lentelė) buvo inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje. Po inkubacijos stikleliai buvo plaunami PBS. Skaidres, nudažytas anti-CD68, Tibeto ir GATA3 antikūnais, reikėjo papildomai inkubuoti su post-antikūnų blokavimu (PAB) 15 minučių (VWRKDPVB blokavimas, Immunologic, Nyderlandai). Po inkubavimo stikleliai buvo plaunami PBS ir inkubuojami su HRP konjuguotu antriniu antikūnu (vadovaujantis PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nyderlandai, kitiems, žr. antrinių antikūnų 1 papildomą lentelę). Vizualizacija buvo atlikta naudojant 3,3′-diaminobenzidiną (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nyderlandai). Rezultatai vizualizuoti 1 papildomame paveiksle. Remdamiesi šiais rezultatais, nustatėme optimalią antikūnų tvarką mTSA eksperimentams, kaip nurodyta 1 papildomoje lentelėje.

Jei dominantys epitopai yra lokalizuoti kartu, tiramido nuosėdos gali trukdyti viena kitai. Norėdami patikrinti šį sterinį slopinimą, naudojome tonzilių kontrolės audinių stiklelius ir nudažėme juos savo mTSA plokštėmis. Antikūnų ekspresija mTSA buvo lyginama su viena dažytų stiklelių, kurios praėjo tiek pat virimo ciklų, raiška. Mes nepastebėjome dažymo modelių skirtumų tarp vienkartiniu ir daugkartiniu būdu dažytų stiklelių (pavyzdžiai pateikti I skydelyje, papildomi 2 ir 3 pav.). Visi pirminiai antikūnai mTSA buvo naudojami tame pačiame praskiedime, kuris buvo naudojamas chromogeniniam IHC. Fluorescencinio signalo intensyvumas buvo optimizuotas koreguojant TSA tirpalo praskiedimus.

Daugkartinis TSA vaizdavimas

Daugiaspektrinis vaizdas buvo atliktas naudojant Vectra Polaris vaizdo sistemą (CLS143455, Akoya Biosciences, JAV) su 20 x objektyvu, 0,49 μm viename pikselyje skiriamąja geba ir naudojant DAPI, FITC, CY3, Texas Red ir Cy5 spektriniai kubai. „Vectra“ sistema leidžia rankiniu būdu pasirinkti sritis multispektriniam gavimui, kuriuos vėliau sistema padalija į plyteles (1.1 pav.). Autofluorescencijos spektrai ir visi Opal TSA fluoroforai buvo iš anksto įrašyti į spektrinę "biblioteką", naudojant Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, JAV). Spektrinė biblioteka leido suskaidyti multipleksinę plytelę į kelias atskiras plyteles, atspindinčias kiekvieno fluoroforo indėlį ("išmaišymas"). Dėl to susidarė monochrominės, daugiakanalės plytelės, kurių kiekvienas kanalas atitinka vieną fluoroforą, taigi ir antikūnus (1.2 pav.).

Konvertavimas į dirbtinį šviesiojo lauko IHC

Remiantis išsaugotomis koordinatėmis, plytelės buvo susiuvamos, kad būtų sukurtas kelių kanalų WSI naudojant pasirinktinį python scenarijų (1.3 pav.). Kanalai, reprezentuojantys DAPI signalą (IDAPI) ir kanalai, reprezentuojantys vieną iš antikūnų (IIHC), buvo konvertuoti atitinkamai į dirbtinį hematoksilino ir DAB dažymą (1.4 ir 1.5 pav.). Remiantis žinomu chromatiniu hematoksilinu ir DAB Cx, Cy koordinatėmis po atspalvio-sotumo-tankio (HSD) transformacijos, dėmių vektoriai buvo gauti ankstesniuose tyrimuose [26, 27]. Šie dėmių vektoriai buvo naudojami dirbtinio šviesaus lauko IHC raudonai-žalia-mėlynai reikšmėms apskaičiuoti (1.5 pav.), kaip:

su CR, st dažiklio šviesos sugertis st raudonojoje spektro dalyje. B ir G vertės buvo apskaičiuotos panašiai.

Vaizdo analizė

Dominantys regionai (IG)

Dominantys regionai (IG) buvo anotuoti kiekvienu atveju kohortoje naudojant automatizuotą skaidrių analizės platformos programinę įrangą (ASAP; 1.9 versija, prieinama kaip atvirojo kodo programinė įranga GitHub). Šios ROI susideda iš žievės kanalėlių intersticio, todėl neįtraukiama kapsulė, glomerulų ir arterijų. Kadangi inkstų subkapsulinių sričių uždegimas transplantacijos patologijoje laikomas nespecifiniu, šio tyrimo biopsijos pirmiausia buvo analizuojamos, neįtraukiant subkapsulinės srities (nustatyta kaip 400 µm žemiau kapsulės). Antra, mes pakartojome analizę, įskaitant subkapsulinį regioną. Vaizdiniai ROI pavyzdžiai yra įtraukti į papildomą 4 pav.

Limfocitų aptikimas CNN I

Dirbtiniai šviesaus lauko IHC vaizdai, vaizduojantys CD3, CD4, CD8 ir CD20 dažymą, buvo analizuojami naudojant esamą CNN su U-Net architektūra [22, 28]. Šis tinklas buvo specialiai sukurtas citoplazminių limfocitų žymenims aptikti IHC. CNN našumą galima išreikšti tikslumu, prisiminimu ir F1- balu, kur:

CNN bandymo rinkinyje pasiekė {{0}}.76 tikslumą, 0.79 atšaukimą ir 0.78 F1-balą kuris buvo naudojamas originaliame dokumente, kurį sudaro tradicinis IHC WSI. Norint aptikti atskiras teigiamas ląsteles, reikia nustatyti CNN išvesties slenkstį, o po to apdoroti. Kadangi CD3 dažymas mTSA skydelyje buvo stipresnis, palyginti su CD4, CD8 ir CD20, pastariesiems trims objektų aptikimo slenkstis buvo žemesnis (0,4), o pradinis objektų aptikimo slenkstis CD3 (0,7). Norint įvertinti CNN našumą dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI šiame tyrime, šiame tyrime buvo naudojami keturi dirbtiniai šviesaus lauko IHC WSI (CD8 ir CD20 iš dviejų pacientų). Taškų komentarai (n=1115) buvo sukurti naudojant ASAP programinę įrangą. Pritaikius tinklą, buvo apskaičiuotas tikslumas, atšaukimas ir F1- balas, siekiant įvertinti CNN našumą. Aptikimai buvo laikomi tikrai teigiamais, jei jie buvo rasti 4 µm atstumu (vidutinis limfocitų skersmuo) nuo pagrindinės tiesos anotacijos. Kai 4 µm diapazone buvo rasti du aptikimai, tik tas aptikimas, kuris buvo arčiausiai anotacijos, buvo laikomas tikru teigiamu. Vėliau limfocitų aptikimas CNN I buvo naudojamas visų dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI, atstovaujančių citoplazminiams limfocitų žymenims (CD3, CD4, CD8 ir CD20), analizei.

Limfocitų aptikimas CNN II

Analizuojant dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI su branduolinio dažymo modeliais (pateikta T-bet ir GATA3), kanalai, atstovaujantys DAPI ir CD4, buvo pasirinkti sujungti į vieną WSI (4). Ankstesniuose tyrimuose įgyti dėmių vektoriai buvo naudojami dirbtiniam DAPI signalo mėlynos spalvos (hematoksilino) ir CD4 signalo rudos spalvos (DAB) dažymui, todėl buvo sukurtas dirbtinis šviesaus lauko IHC WSI (5).

Reikalingas naujos CNN mokymas, patvirtinimas ir testavimas. Šiuo tikslu iš inkstų, tonzilių ir priedėlio FFPE kontrolinio audinio buvo nupjautos devynios skaidrės. Šios skaidrės buvo nudažytos IHC anti-Tibeto (klonas 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, JAV) ir anti-GATA3 (klonas L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nyderlandai) antikūnų. Skaidrės buvo suskaitmenintos naudojant Pannoramic 250 Flash II skaitmeninį skaidrių skaitytuvą, kurio skiriamoji geba yra 0,12 μm/pikselis. Du stebėtojai, naudodami ASAP programinę įrangą, skirtinguose regionuose sukūrė 5726 taškų komentarus. Anotacijos iš penkių skaidrių buvo naudojamos U-Net architektūros CNN mokymui, naudojant 256 × 256 pikselių pataisas, kurių pikselių dydis yra 0,49 μm / pikselis. Du WSI buvo naudojami CNN patvirtinimui ir objekto aptikimo slenksčiui (0,4) nustatyti. CNN našumas tradiciniame IHC WSI buvo įvertintas naudojant du IHC WSI testus. CNN našumas dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI buvo įvertintas naudojant antrinį bandymų rinkinį, kurį sudaro keturi dirbtiniai šviesaus lauko IHC WSI (Tibetas ir GATA3 iš dviejų pacientų) su 1082 taškų anotacijomis. Siekiant įvertinti abiejų bandymų rinkinių našumą, buvo apskaičiuotas tikslumas, prisiminimas ir F{22}}balas. Aptikimai buvo laikomi tikrai teigiamais, jei jie buvo rasti 4 µm atstumu nuo pagrindinės tiesos anotacijos. Kai 4 µm diapazone buvo rasti du aptikimai, tik tas aptikimas, kuris buvo arčiausiai anotacijos, buvo laikomas tikru teigiamu. Vėliau limfocitų aptikimas CNN II buvo naudojamas visų dirbtinių šviesaus lauko IHC WSI, atstovaujančių branduolinius (limfocitų) žymenis (Tibetas ir GATA3), analizei.

Makrofagų aptikimas CNN

Priešingai nei limfocitų aptikimas, atskirų makrofagų identifikavimas nėra vienareikšmis. Ypač sugrupuotose scenose galima tikėtis didelio stebėtojo kintamumo. Todėl buvo naudojamas daug didesnis atvejų skaičius ir žmonių anotacijos, skirtos specialiai trečiajam CNN aptikti CD68 plius ir CD163 plius makrofagus. Buvo surinktos IHC dažytos skaidrės (n=111) iš vietinio ir persodinto inkstų audinio. IHC dažymas buvo atliktas naudojant anti-CD68 (klonas PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danija arba klonas KP1, M0876, Dakas, Danija) arba anti-CD163 (klonas MRQ -26 arba 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, JK) antikūnas. IHC skaidrės buvo suskaitmenintos naudojant panoraminį 250 Flash II skaitmeninį skaidrių skaitytuvą arba Aperio AT2 skaidrių skaitytuvą (Leica Biosystems, Wetzlar, Vokietija), esant 0.24 arba 0 skyrai. .25 μm/pikselis, atitinkamai. Keturi stebėtojai sukūrė 37 709 taškų anotacijas keliose ROI WSI, naudodami makrofagų anotacijos protokolą, dėl kurio buvo susitarta po pirminių bandomųjų eksperimentų. 101 skaidrės anotacijos buvo naudojamos YoloV2 architektūros CNN mokymui [29]. Yolo ypač tinka aptikimo užduotims atlikti. Tinklas, sudarytas iš septynių konvoliucinių sluoksnių, buvo apmokytas 256 × 256 pikselių lopais, išskirtais 0, 98 μm / pikselio skiriamąja geba, su 21 μm ribojančiais langeliais (remiantis vidutiniu makrofagų dydžiu). CNN patvirtinimui ir objekto aptikimo slenksčiui (0,45) bei ne maksimaliems slopinimo parametrams (0,05) nustatyti buvo panaudota dešimt WSI. CNN našumas tradiciniame IHC WSI buvo įvertintas naudojant dešimties IHC WSI testų rinkinį. CNN našumas dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI buvo įvertintas antriniu testų rinkiniu, kurį sudaro keturi dirbtiniai šviesaus lauko IHC WSI (CD68 ir CD163 iš dviejų pacientų) su 1033 taškų anotacijomis. Siekiant įvertinti abiejų testų rinkinių veikimą, buvo apskaičiuoti tikslumo, prisiminimo ir F1 balai. Aptikimai buvo laikomi tikrai teigiamais, jei jie buvo rasti 21 µm atstumu (vidutinis makrofago skersmuo) nuo pagrindinės tiesos anotacijos. Kai 21 µm diapazone buvo rasta daugiau aptikimų, tik tas aptikimas, kuris buvo arčiausiai anotacijos, buvo laikomas tikru teigiamu. Vėliau makrofagų aptikimo CNN buvo naudojamas visų dirbtinių šviesaus lauko IHC WSI, atstovaujančių makrofagų žymenis (CD68 ir CD163), analizei.

cistanche tubolosa testosteronas

Dvigubas pozityvumas

Ląstelių pozityvumas dviem žymenims (dvigubas pozityvumas) buvo įvertintas nustatant pikselių skaičių tarp ląstelių aptikimų skirtinguose kanaluose. Jei atstumas tarp dviejų limfocitų aptikimų buvo<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Ląstelių skaičius buvo apskaičiuotas ROI viduje, o ląstelių tankis buvo pagrįstas ląstelių skaičiumi ir anotuotos ROI plotu.

Erdviniai santykiai

Automatizuotas ląstelių aptikimas WSI leidžia ištirti erdvinius ryšius tarp ląstelių. Vidutinis trumpiausias atstumas buvo nustatytas (regionuose, išskyrus subkapsulinį regioną) CD68 plius ląstelėms ir CD3 plius , CD3 plius CD8 plius ir CD20 plius ląstelėms I skydelio WSI abiejose pacientų grupėse ir tarp CD163 plius ląstelių ir CD4. plus , CD4 plus Tbet plus ir CD4 plus GATA3 plus WSI abiejose pacientų grupėse.

Peritubulinė kapiliarinė apimtis

Siekiant įvertinti peritubulinių kapiliarų apimtį, Fidžyje buvo išanalizuoti nesumaišyti CD34 kanalą reprezentuojantys WSI (2 versija.{2}}.0, JAV, makrokomandos ir papildiniai: „Open and Duplicate“, „ASAP“ ROI skaitytuvas“) [30]. Teigiami pikseliai buvo nustatyti naudojant automatinį slenkstį ir vėliau išreiškiami procentais nuo bendro pikselių skaičiaus ROI.

Statistinė analizė

Per 6 savaičių biopsijas buvo apskaičiuotas šių ląstelių populiacijų tankis: T limfocitai (CD3 plius ), citotoksiniai T limfocitai (CD3 plius CD8 plius ), B limfocitai (CD20 plius ), makrofagai (CD68 plius , skydeliai I ir II), poliarizuoti makrofagai (CD68 plius CD163 plius, CD163 plius), T-helper 1 limfocitai (CD4 plius Tbet plus) ir T-helper 2 limfocitai (CD4 plius GATA3 plus). Spearmano koreliacijos koeficientai buvo apskaičiuoti siekiant įvertinti, ar yra koreliacija tarp T-pagalbininko 1 ir T-pagalbininko 2 limfocitų tankio (CD4 plius Tbet plus, CD4 ir GATA3 plius) ir poliarizuotų makrofagų tankio (CD68 plius CD163 plius arba CD163 plius). Mes stebėjome CD68 signalą (fluoroforas 540 nm) I skydelio dirbtinėje CD4 (fluoroforo 520 nm) IHC. Todėl papildomai pateikiame CD3 ir CD8- ląstelių tankį. Norėdami įvertinti skirtumus tarp pacientų grupių, turinčių skirtingus IFTA rezultatus, pateikiame vidutines, minimalias ir didžiausias ląstelių tankio vertes kiekvienai grupei. Reikšmingi ląstelių tankio ir peritubulinių kapiliarų apimties skirtumai (nurodomi kaip CD{35}}teigiamų pikselių procentas) tarp grupių buvo įvertinti naudojant Mann-Whitney U testą nepriklausomiems mėginiams. Ar pacientams, kurių IFTA rezultatai skiriasi, CD3 ir CD8-/CD3 ir CD8 plius ląstelių santykis labai skiriasi, buvo įvertinta naudojant nepriklausomų mėginių t testą. Pacientų grupių CD68 plius ir CD163 plius ląstelių erdvinių ryšių su kitomis imuninėmis ląstelėmis skirtumai buvo įvertinti dėl reikšmingumo naudojant Mann-Whitney U testą nepriklausomiems mėginiams.

Rezultatai

CNN pagrįstas IHC teigiamų ląstelių aptikimas

Norint pritaikyti esamus CNN, kurie iš pradžių buvo sukurti šviesaus lauko mikroskopijai, mTSA fluorescenciniai vaizdai buvo transformuoti į dirbtinius šviesaus lauko vaizdus. MTSA nudažytų sričių pavyzdžiai su atitinkamais dirbtinio šviesaus lauko IHC vaizdais pateikti 2 pav. Dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI pavyzdys parodytas papildomame 4 pav. Kelių raiškos WSI galima atidaryti ir peržiūrėti skaitmeninės skaidrės peržiūroje. programinė įranga, pvz., ASAP ir Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Kaip parodyta 2 pav., dirbtinis šviesaus lauko IHC WSI buvo tinkamas automatizuotai analizei CNN, kuri iš pradžių buvo sukurta tradicinei IHC WSI.

Trys CNN buvo naudojami kiekybiniam uždegiminių ląstelių įvertinimui 6 savaičių mTSA dažytų transplantacijos biopsijų metu: limfocitų aptikimui naudojant citoplazminį (CNN I) ir branduolinį (CNN II) IHC dažymą ir makrofagų aptikimui. 2 lentelėje parodytas CNN našumas (tikslumas, atšaukimas ir F{3}}balai) DAB nudažytų IHC WSI ir dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI laikymo rinkiniuose. CNN našumas paprastai buvo toks pat geras arba geresnis nei anksčiau aprašytas pradinis CNN (F1-balas 0,78), kurio našumas buvo panašus į patyrusių stebėtojų rankiniu būdu [22]. . Nors limfocitų aptikimas CNN II parodė šiek tiek sumažintą virtualių šviesaus lauko vaizdų našumą, palyginti su tikrais DAB vaizdais (kuriuo CNN buvo apmokytas), CNN makrofagų aptikimui buvo pastebėta priešingai.

Sėkmingo automatinio dvigubo pozityvumo vertinimo pavyzdys pateiktas 3 pav.

Skirtingų ląstelių tipų koreliacija

Stipriausia koreliacija buvo pastebėta tarp CD4 ir GATA3 plius ląstelių tankio ir CD163 plius ląstelių tankio (Spearmano koeficientas 0,75, p < 0.001)="" 6="" savaičių="" biopsija="" (papildomas="" 5a="" pav.).="" ši="" koreliacija="" buvo="" silpnesnė="" tarp="" cd4="" ir="" tbet="" plius="" ląstelių="" tankio="" ir="" cd163="" plius="" ląstelių="" tankio="" (spirmeno="" koeficientas="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (papildomas="" 5b="" pav.)="" .="" apribojant="" ląstelių="" populiaciją="" iki="" dvigubai="" teigiamų="" makrofagų="" (cd68="" ir="" cd163="" plius),="" spearmano="" koreliacijos="" koeficientas="" buvo="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" su="" cd4="" ir="" gata3="" plius="" ląstelėmis="" ir="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" su="" cd4.="" plius="" tbet="" plius="" ląstelės="" (papildomas="" 5c,="" d="" pav.).="" subkapsulinės="" srities="" įtraukimas="" į="" analizę="" rezultatų="">

Uždegiminių infiltratų palyginimas tarppacientų, progresuojančių į IFTA, palyginti su ne IFTA

Pacientams, kuriems po 6 mėnesių progresavo IFTA, biopsijose, paimtose praėjus 6 savaitėms po transplantacijos, buvo žymiai didesnis CD163 plius ląstelių tankis (vidutiniškai 505 ląstelės/mm2), palyginti su pacientais, kuriems neprogresavo iki IFTA (vidutiniškai 370 ląstelių/mm2; p=0 .043) (3 lentelė). Įtraukus subkapsulinę sritį, šis poveikis šiek tiek sumažėjo (p=0.051). CD68 ir CD4 buvo naudojami abiejose plokštėse. Skaidrės, nudažytos mTSA I skydeliu, parodė didesnį CD68 teigiamumą nei skaidrės, nudažytos mTSA skydeliu II. CD4 ląstelių tankis yra didesnis mTSA II skydelyje, palyginti su mTSA I skydeliu (3 lentelė).

Peritubulinių kapiliarų apimtis buvo panaši 6 savaičių biopsijose DGF pacientams, kurių IFTA rezultatai buvo skirtingi (3 lentelė), tiek neįtraukiant (p=0.74), tiek įtraukus (p=0.90) subkapsulinę sritį. iš/analizėje.

Įvertinus CD3 ir CD8-/CD3 plius CD8 plius ląstelių santykį, nustatyta, kad pacientams, sergantiems<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Vidutinis trumpiausias atstumas nuo CD68 plius ląstelių iki CD3 plius , CD3 plius CD8 plius ir CD20 plius ląstelių (I skydelis) ir nuo CD163 plius ląstelių iki CD4 plus , CD4 plius Tbet plus ir CD4 plius GATA3 plius ląstelių (II skydelis). pacientų grupėse labai nesiskiria. Rezultatai vizualizuoti 4 pav.

cistanche ekstraktas: gerina inkstų funkciją ir fizinę jėgą

Diskusija

Šiame tyrime mes sukūrėme metodą, leidžiantį tiksliai ir objektyviai kiekybiškai nustatyti uždegiminių ląstelių infiltratų skaičių transplantato biopsijose pacientams, kuriems buvo atlikta inkstų transplantacija, kuriems buvo atliktas DGF. Šiuo tikslu sujungėme multipleksinį IHC, tiramido signalo stiprinimą, daugiaspektrinį vaizdą ir kiekybinį nustatymą CNN. Mes pirmieji konvertavome išklotus daugiaspektrinius duomenis į vieną dirbtinį chromogeninį vaizdą kiekviename ląstelės žymeklyje, palengvindami WSI analizę ir CNN pritaikymą šviesaus lauko IHC. Sukūrėme du naujus CNN, skirtus branduoliniu būdu dažytų limfocitų ir makrofagų aptikimui, ir parodėme, kad CNN, sukurtų naudojant tradicinį IHC WSI, apibendrinami dirbtiniu šviesaus lauko IHC WSI. Mūsų metodo pritaikomumas buvo įrodytas naudojant CNN gautus kiekybinius rezultatus tiriant uždegiminės mikroaplinkos koreliacijas 6 savaičių DGF pacientų biopsijose su IFTA išsivystymu praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos.

Mes naudojome komerciškai prieinamą rankinį dažymo rinkinį, skirtą multipleksiniam IHC, kad galėtume vizualizuoti imunines ląsteles ir peritubulinius kapiliarus stebėjimo biopsijose, gautose praėjus 6 savaitėms po transplantacijos. Daugkartinio dažymo procedūra susideda iš kelių plovimo, inkubavimo ir audinių virinimo etapų ir apima kelis reagentų tirpalus. Todėl labai svarbu atlikti išsamų metodų patvirtinimą ir kokybės kontrolę, todėl rekomenduojama naudoti specifinius antikūnus, kurie duoda pastovų dažymo intensyvumą. Nepaisant atliktų patvirtinimo žingsnių, į makrofagus panašūs dažymo modeliai buvo pastebėti CD4 kanaluose, esančiuose stiklelių iš mTSA I ir II plokščių. CD4 ir CD68 dažymo ciklai nebuvo atlikti iš eilės, todėl šio reiškinio negalėjo sukelti nepilnas CD68 antikūno pašalinimas (1 papildoma lentelė). Nors buvo aprašyti reti makrofagų dvigubo teigiamo CD4 atvejai [31], labiau tikėtinas paaiškinimas yra fluoroforų emisijos spektrų, kurie buvo naudojami CD4 (520 nm) ir CD68 (540 nm) vizualizavimui, artumas. naudojant fluorescencinio mikroskopo FITC filtro kubą. Tai gali sukelti stipraus CD68 signalo „nutekėjimą“ į CD4 kanalą. Didžioji šio signalo dalis buvo pašalinta iš analizės I skydelyje, nes bendrajai T pagalbininkų ląstelių analizei buvo naudojamos tik CD4 plius ląstelės, kurios buvo dvigubai teigiamos su CD3. Nepaisant to, nusprendėme netiesiogiai įvertinti ir bendrąsias T pagalbines ląsteles, kaip pakaitalą naudodami CD3 ir CD8−. II skydelyje CD4 buvo naudojamas tik kartu su Tibetu ir GATA3, todėl buvo apribota klaidingai teigiamų aptikimų naudojimo rizika.

Žemesnis CD68 pozityvumas buvo pastebėtas II skydelyje, palyginti su I panele. Manome, kad tai yra sterinio slopinimo, kurį sukelia tiramido nuosėdos, priklausančios CD163, rezultatas ("skėčio efektas") [32]. Mes pastebėjome daug daugiau CD163-teigiamų ląstelių tirtoje grupėje nei tonzilių audinyje, kuris buvo naudojamas steriniam slopinimui patikrinti, galbūt tai paaiškina, kodėl šis poveikis nebuvo aptiktas patvirtinimo metu.

Daugybinis IHC buvo derinamas su multispektriniu vaizdavimu, siekiant ištirti naviko mikroaplinką keliuose onkologiniuose tyrimuose, o pastaruoju metu taip pat analizuojant inkstų transplantato atmetimą [33–35]. Norint išskirti visų žymenų indėlį į mTSA skaidres, sekcijos vaizduojamos Vectra sistema arba panašiu fluorescenciniu mikroskopu su daugiaspektriu nustatymu. Įrašius mažo didinimo apžvalgos vaizdą, Vectra sistema padalija audinį į plyteles ir automatiškai nuskaito plyteles įvairiais spektrais. Dėl to susidaro vaizdo plytelės su keliais prisidedančiais spektrais. Kadangi pavienių fluoroforų spektrai yra žinomi iš iš anksto įrašytos spektrinės „bibliotekos“, multipleksines plyteles galima suskaidyti į kelias atskiras plyteles, atspindinčias kiekvieno fluoroforo indėlį („išmaišymas“). Daugumoje tyrimų nesumaišyti vaizdai vėliau analizuojami naudojant komercinę programinę įrangą. Daugeliu atvejų šios programos nepalaiko WSI analizės, joms sunku analizuoti sugrupuotas ląsteles ir dažnai jos nėra atsparios artefaktams ir dažymo skirtumams. Konvertuojant nesumaišytas plyteles į dirbtinius šviesaus lauko IHC WSI, galėjome pritaikyti esamą CNN, specialiai sukurtą limfocitų aptikimui IHC [22] (vadinamas limfocitų aptikimo CNN I). Šis tinklas gali labai tiksliai aptikti atskirus ir sugrupuotus limfocitus, tuo pačiu atsparus foniniam dažymui (2 pav., CD3). Be to, apmokėme du naujus CNN, skirtus aptikti ląsteles su branduolinio dažymo modeliais (Tibetas, GATA3) (limfocitų aptikimo CNN II) ir makrofagų aptikimui. Makrofagus labai sunku aptikti dėl jų išsibarsčiusio dažymo modelio. Todėl makrofagų aptikimas CNN buvo apmokytas naudojant keturių skirtingų ekspertų anotacijas. Prieš pateikiant anotacijas, buvo suplanuoti keli susitikimai, kuriuose buvo aptarti ir įvertinti makrofagų anotavimo kriterijai. Dėl to buvo sukurtas tinklas, galintis atkuriamu būdu aptikti makrofagus, o tuo pačiu metu yra tvirtas nespecifiniam dažymui (2 lentelė, 2 pav. ir papildomas 6 pav.). Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis makrofagų aptikimo algoritmas nuskaitytuose histopatologiniuose pjūviuose. Išbandėme visų trijų tinklų veikimą naudodami tradicinį IHC WSI (panašų į tuos, kurie buvo naudojami treniruočių metu) ir antrinį bandymų rinkinį, kurį sudarė dirbtinio šviesaus lauko IHC WSI, sukurto iš kelių spektriniu būdu įrašytų vaizdų. Visi CNN rodo labai gerą pirminių testų rinkinių našumą ir panašius F{11}}balus antriniuose testų rinkiniuose. Limfocitų aptikimo CNN I efektyvumo metrika buvo apskaičiuota naudojant normalius audinius, artefaktus ir ląstelių grupes. Antrojo bandymo rinkinio dirbtiniame šviesiojo lauko IHC nebuvo audinių artefaktų ir mažiau ląstelių grupių. Tai gali paaiškinti bendrą geresnį šio tinklo veikimą antrajame bandymų rinkinyje. Makrofagų aptikimas CNN buvo apmokytas ir išbandytas keturių skirtingų anotatorių anotacijomis. Nors anotacijos kriterijai buvo ypač aptarti, anotacijos stiliaus skirtumai vis dėlto buvo pastebėti. Todėl CNN jautrumas tikriausiai yra kažkur anotacijos stiliaus kraštutinumų viduryje. Antrojo bandymo rinkinio anotacijas sugeneravo vienas anotatorius, atrodytų, atitinkantis CNN jautrumą.

Naudodami aprašytus CNN leido mums precedento neturinčiu tikslumu ištirti uždegiminį infiltraciją unikalioje griežtai atrinktų pacientų su DGF ankstyvosios priežiūros biopsijomis.

Deja, keli mėginiai turėjo būti neįtraukti į analizę, daugiausia dėl to, kad po diagnostinio apdorojimo nebuvo pakankamai likusio audinio. Net ir esant ribotam duomenų rinkinio dydžiui, DGF pacientų, kuriems išsivystė IFTA, biopsijose nustatėme žymiai didesnį CD163 plius ląstelių tankį, o tai atitinka potencialiai skatinantį šių ląstelių vaidmenį [11]. Nors pastebėta tendencija atitiko paskelbtus duomenis, negalėjome patvirtinti žalingo ankstyvo CD68 ir makrofagų buvimo, apie kurį anksčiau buvo pranešta kitoms pacientų, kuriems buvo atlikta inkstų persodinimas, grupėse [7, 36, 37]. Mes nustatėme teigiamą koreliaciją tarp CD4 plius GATA3 plius ląstelių ir CD163 plius ląstelių tankio, o tai gali patvirtinti T-helper 2 limfocitų indėlį į profibrotinę mikro aplinką. Nors šiame tyrime nebuvo aptikta naujų nuspėjamųjų biomarkerių IFTA vystymuisi DGF pacientams, mes sėkmingai sukūrėme metodus, leidžiančius tiksliai, atkuriamą ir keičiamą retų audinių uždegiminio įsiskverbimo įvertinimą, pavyzdžiui, transplantacijos biopsijas. Šie metodai yra vertingi būsimiems kiekybiniams histopatologinio audinio uždegimo tyrimams.

Norėdami sumažinti antinksčių nuovargį naudodami cistanche, spustelėkite čia, kad gautumėte daugiau informacijos

Duomenų prieinamumas

Bendradarbiavimo užklausas, susijusias su šiame tyrime pateiktų duomenų naudojimu, galima adresuoti atitinkamam autoriui (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) arba FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Padėkos

Dėkojame Markui Gorrisui ir Kiek Verrijpui už patarimus dėl mTSA dažymo ir vaizdo gavimo, Merijn van Erp už pritaikytų ImageJ funkcijų sukūrimą ir Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg ir Martijn Otten už makrofagų aptikimo tinklo pagrindinę tiesą. Be to, dėkojame Irinai Scheffner už pagalbą renkant klinikinius duomenis.

Autoriaus indėlisMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH ir JAWML

suprojektavo studiją. Pacientų medžiagą ir klinikinius duomenis rinko ir pateikė JS, WG ir FF. FF koordinavo MHH vykdomas pastangas. JHB, EJS ir JK įvertino PAS skaidrę pagal IFTA procentą. MH atliko mTSA dažymą, I ir II plokščių patvirtinimą ir I skydelio vaizdavimą bei išmaišymą. VV atvaizduota ir nesumaišyta II plokštė. DJG sukūrė metodus, kaip konvertuoti mTSA plyteles į dirbtinio šviesaus lauko WSI. MH atliko konversijas. ZS-C sukūrė limfocitų aptikimo CNN ir parašė limfocitų kiekybinio nustatymo scenarijus. JL sukūrė makrofagų aptikimo CNN ir parašė makrofagų kiekybinio nustatymo scenarijus. MH atliko ląstelių ir kapiliarų kiekybinius matavimus. NSS apskaičiavo ląstelių atstumus. MH, BS, LBH ir JAWML analizavo duomenis. MH sudarė figūras ir parengė popieriaus juodraštį. Galutinė rankraščio versija buvo peržiūrėta ir patvirtinta visų autorių.

FinansavimasŠis darbas buvo paremtas iniciatyva ERACoSysMed (projektas SysMIFTA) kaip Europos Sąjungos bendrosios programos „Horizontas 2020“ dalis, kurią pasiūlė „ZonMw“ (dotacijos Nr. 9003035004), kurią bendrai finansavo Vokietijos mokslinių tyrimų ir švietimo ministerija (BMBF), dotacijos Nr. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) ir FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML gavo konsultavimo mokesčius iš „Philips“ (Nyderlandai) ir dotacijas iš

„ContextVision“, „Philips“ (Nyderlandai) ir „Sectra“ (Švedija), už pateikto darbo ribų. JK gavo finansinę paramą iš Olandijos inkstų fondo (projektas DEEPGRAFT, dotacija Nr. 17OKG23).

Etikos standartų laikymasis

Interesų konfliktasAutoriai nedeklaruoja jokių konkuruojančių interesų.

Etikos patvirtinimas ir sutikimas dalyvautiDuomenų rinkimas ir analizė buvo atliekama gavus informuoto paciento sutikimą ir Hanoverio medicinos mokyklos etikos tarybos (nr. 2765) pritarimą.

Leidėjo pastabaSpringer Nature išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Atvira prieigaŠis straipsnis yra licencijuotas pagal Creative Commons Attribution 4.0 Tarptautinė licencija, leidžianti naudoti, dalytis, pritaikyti, platinti ir atkurti bet kokia laikmena ar formatu, jei tinkamai nurodote originalų autorių (-ius). ) ir šaltinį, pateikite nuorodą į Creative Commons licenciją ir nurodykite, ar buvo atlikti pakeitimai. Šiame straipsnyje esantys vaizdai ar kita trečiųjų šalių medžiaga yra įtraukti į straipsnio Creative Commons licenciją, nebent medžiagos kredito limite nurodyta kitaip. Jei medžiaga neįtraukta į straipsnio Creative Commons licenciją ir jūsų numatytas naudojimas neleidžiamas įstatymų nustatyta tvarka arba viršija leistiną naudojimą, turėsite gauti leidimą tiesiogiai iš autorių teisių turėtojo.

Nuorodos

1. Siedlecki A, Airija W, Brennan DC. Uždelsta transplantato funkcija persodinus inkstus. Am J transplantacija. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Ilgalaikio transplantato praradimo rizikos veiksniai inksto transplantacijos recipientams, kuriems yra lėtinė alotransplantato disfunkcija. Exp Clin transplantacija. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Ryšys tarp uždelstos transplantato funkcijos ir alotransplantato bei paciento išgyvenimo: sisteminė apžvalga ir metaanalizės. Nephrol Dial transplantacija. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Uždelsta inkstų transplantacijos funkcija: nuo mechanizmo iki vertimo. Kidney Int. 2014 m.;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B ir kt. Bendras uždegimas yra pranašesnis už dabartinį Banff uždegimo balą, numatant baigtį ir molekulinio sutrikimo laipsnį inkstų transplantatuose. Am J transplantacija. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Vėlesnio inkstų transplantato funkcijos sumažėjimo prognozavimas iš ankstyvos stebėjimo biopsijos. Am J transplantacija. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z ir kt. Makrofagų vaidmuo žmogaus inkstų transplantato fibrozės vystymuisi pirmaisiais metais po transplantacijos. Am J transplantacija. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M ir kt. Alternatyviai aktyvuoti makrofagai lėtinio inkstų transplantato pažeidimo patogenezėje. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofagų plastiškumas ir sąveika su limfocitų pogrupiais: vėžys kaip paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Inkstų mikroaplinka ir makrofagų fenotipai lemia inkstų uždegimo ir fibrozės progresavimą arba išnykimą. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in organ transplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M ir kt. 1, 2 ir 17 T pagalbinių ląstelių pogrupiai pacientams, kuriems persodintas inkstas, kurių transplantato funkcija yra uždelsta. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P ir kt. Naviką infiltruojančių limfocitų įvertinimas: nuo vizualinio įvertinimo iki mašininio mokymosi. Seminaras Vėžio Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Vaizdo analize pagrįstas metodas lėtinio transplantato pažeidimo indekso parametrų kiekybiniam įvertinimui. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM ir kt. Vandens ribos algoritmų taikymas sugrupuotų branduolių segmentavimui. Citometrija. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Veiksmingas apskritas slenkstis. IEEE Trans Med vaizdo gavimas. 2014;23:992–1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M ir kt. Apklausa apie gilų mokymąsi medicinos įvaizdžio analizėje. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Vaizdo analizė ir mašininis mokymasis skaitmeninėje patologijoje: iššūkiai ir galimybės. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G ir kt. Diagnostinis giluminio mokymosi algoritmų, skirtų limfmazgių metastazių nustatymo moterims, sergančioms krūties vėžiu, įvertinimas. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S ir kt. Giluminiu mokymusi pagrįstas inkstų audinio histopatologinis įvertinimas. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.