Cistanche desercicola polisacharido cistanche apibūdinimas ir jo apsauginis poveikis dideliam gliukozės sukeltai HK -2 ląstelių sužalojimui

Anotacija:

 

Tikslas: ištirti cistanche desercicola polisacharidų (CDP) struktūrą ir žmogaus proksimalinių vamzdinių epitelio ląstelių apsauginį poveikį ir mechanizmą (HK {{0}}}}) sužalojimas. Metodai: Cheminė sudėtis, molekulinė masė, monosacharidų sudėtis ir galima CDP struktūra buvo aptikta sieros rūgšties fenolio metodu, hidroksilo biphenilo metodu, nuostabiu mėlynu metodu, jonų chromatografijos metodu, aukšto efektyvumo gelio permetimo chromatografija ir infraraudonųjų spindulių chromatografija. The protective effect of CDPs on HK-2 injury and its mechanism were evaluated by establishing a damage model of HK-2 cells induced by high glucose.Results : The average molecular weight of CDPs was 8031,4198,3444 kDa, which was mainly composed of glucose, galactose, rhamnose, mannose ir arabinozė, ir gali būti -glikozidinis ryšys. Tai gali sumažinti HK -2 ląstelių oksidacinį pažeidimą, kurį sukelia didelė gliukozė, ir HK {-2 ląstelių mitochondrijų membranos potencialo pažeidimą. Santykinė 4 receptorių (TLR4) baltymų raiška ir P -branduolio faktoriaus (NF) -κB p65 / -Actino ir P -IκB / -Actino santykis HK -2 ląstelės buvo žymiai sumažintos po intervencijos su skirtingomis CDP koncentracijomis (P <0,05, p <0,01). Išvada: CDP gali sumažinti aukštąGliukozės sukelta inkstų kanalėlių epitelio ląstelėSužalojimas slopinant TLR4 / NF-κB, siekiant skatinti ląstelių proliferaciją ir slopinti oksidacinį stresą bei apoptozę.

 

Raktiniai žodžiai: Cistanche Deserticola polisacharidas; Žmogaus inkstų kanalėlių epitelio ląstelės; Oksidacinis stresas; TLR4/NF-κB kelias

 

 

 

Diabeto nefropatijos (DN) cistanche (DN)

 

Diabeto nefropatija (DN)yra pagrindinė inkstų ligos galutinės stadijos priežastis ir kelia didelę grėsmę pacientų gyvybei ir sveikatai [1]. Inkstų kanalėlių sužalojimas vaidina pagrindinį vaidmenį DN atsiradime ir vystymosi metu. Hemodinaminiai anomalijos, oksidacinis stresas, uždegiminis atsakas ir metaboliniai anomalijos, kurias sukelia aukšto cukraus aplinka, gali sukelti inkstų vamzdinių epitelio ląstelių apoptozę ir nekrozę, sukeldami inkstų kanalėlių pažeidimus [2,3]. TLR4 inkstuose yra TLRS šeimos narys, o su juo susijęs signalo perdavimas vaidina svarbų vaidmenį DN atsiradime ir vystymosi metu [4]. Esant didelėms gliukozės sąlygoms, didelė TLR4 ekspresija inkstuose gali suaktyvinti NF-κB kelią, apsunkindamas ląstelių oksidacinį pažeidimą ir sukeldamas HK -2 ląstelių apoptozę [5, 6].
Cistanches Herba yra džiovintas mėsingas stiebas su fosforo lapais iš cistanche deserticola ycma ir (arba) cistanche tubulosa (Schenk) wight, tradicinio vaistinio ir valgomojo augalo. Skonis saldus, sūrus,

Jis šildo ir patenka įinkstų ir storosios žarnos dienovidiniai. Tai daro inkstų yang tonizuojančio poveikį, gerinant esenciją ir kraują, drėkina žarnyną ir palengvina vidurių užkietėjimą. [7] Polysacharidai yra viena iš pagrindinių aktyviųjų cistanche desercicola ingredientų. Cistanche deserticola vandens ekstrakto polisacharidų kiekis yra palyginti didelis, o literatūra praneša, kad kiekis yra nuo 29,598 iki 39,609 mg/g [8]. Jį daugiausia sudaro gliukozė, galaktozė, rhamnozė, arabinozė, fruktozė ir kt. Jis yra sudarytas iš monosacharidų ir turi daug farmakologinio poveikio, įskaitant imuninio aktyvumo reguliavimą, anti-senėjimą, gerinimą ir atmintį, apsaugoti nervus, priešintis kepenų pažeidimui, anti-virusui ir priešnakiui [9]. Pastaraisiais metais daugybė tyrimų parodė, kad tradicinės kinų medicinos polisacharidai gali pagerinti diabetinę nefropatiją. Kelių taikinių, daugialypių kelio charakteristikos ir reikšmingas kinų žolelių polisacharidų poveikis rodo didelį potencialą įsikišti į diabetinę nefropatiją [10]. Wang ir kt. Tyrime. [11], Banyano polisacharidai parodė reikšmingą poveikį gerinant gliukozės ir lipidų metabolizmą, sumažindami uždegiminius atsakus ir reguliuojant 2 tipo diabetinių pelių žarnyno mikrobiotą per žarnyno kepenų ašį. Ankstesni tyrimų grupės tyrimai parodė, kad Cistanche desercicola vandens ekstraktas gali padidinti HK -2 ląstelių išgyvenamumą aukšto cukraus ir riebios aplinkos aplinkoje, reguliuoja ląstelių apoptozę, oksidacinį stresą ir uždegimą ir turi potencialų terapinį poveikį diabetinės nefropatijos [12]. Eksperimento su gyvūnais rezultatai parodė, kad CDP gali efektyviai pagerinti pelių diabetinę nefropatiją, o patologiniai rezultatai parodė, kad inkstų kanalėlių fibrozė žymiai pagerėjo [13]. Tačiau yra keletas tyrimų, susijusių su cistanche deserticola polisacharidų vaidmeniu apsaugant aukštą gliukozės sukeltą HK -2 ląstelių modelį. Atsižvelgiant į potencialų polisacharidų farmakologinį aktyvumą ir mechanizmą, šiuo tyrimu siekiama nustatyti CDP cheminę sudėtį, molekulinę struktūrą ir molekulinę struktūrą, naudojant sieros rūgšties fenolio metodą, hidroksibifenilo metodą, koomassietą nuostabų mėlyną metodą, jonų chromatografiją, aukšto našumo gelio pervertinimo chromatografiją ir infraraudonųjų chromatografiją. Buvo išanalizuota masės, monosacharidų sudėtis ir galima struktūra, ir buvo nustatytas HK -2 ląstelių, sukeltų dėl didelės gliukozės, pažeidimo modelis, siekiant įvertinti apsauginį CDP poveikį HK -2 pažeidimui ir jo veikimo mechanizmui. Pateikite teorinius pagrindus ir eksperimentinius įrodymus, kad gali būti taikomi CDP gydant DN.

1 Medžiagos ir metodai
1.1 Medžiagos ir instrumentai

CDP (polisacharidų turinys> 8 0%, partijos numeris: 2306019, „Shaanxi XItianyu Company“); dapagliflozinas (DAPA, partijos numeris: BMS -512148, AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); Žmogaus inkstų kanalėlių epitelio ląstelės HK -2 (partijos numeris: 20231014, ACTT įmonė, JAV); MEM CUTLIC MEDID, vaisiaus galvijų serumas (partijos numeris: 20231014, 20231014, „Gibco Company“, JAV); PBS buferis (partijos numeris: 20230906, „Hyclone Company“, JAV); 0,25% EDTA turinčio tripsino virškinimo sprendimo (partijos numeris: 20240411, „Anhui BioSharp Company“); CCK -8 ląstelių gyvybingumo aptikimo rinkinys (partijos numeris: 20240415, Wuhan elarite Biotechnology Co., Ltd.); Superoksido dismutazė (SOD), malondialdehidas (MDA), glutationo peroksidazė
Peroksidazė, GSH-PX) Aptikimo rinkinys (partijos Nr.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Yousuan Biotechnology Co., Ltd.); Hoechst33258 dažymo apoptozės rinkinys (partijos Nr.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 dažymas
Mitochondrijų membranos potencialo aptikimo rinkinys (partijos Nr.: 20240319, Wuhan elarite Biotechnology Co., Ltd.); Dichlorofluoresceino diacetato (DCF-DA) ląstelių reaktyviosios deguonies rūšių (ROS) aptikimo reagentas
rinkinys (Lot Nr.: 20231225, Pekino „Solebow Technology Co., Ltd.“); TLR4 monokloninis antikūnas, fosforilintas branduolinis faktorius-κB p65 (fosfo-nf-κB p65, p-nf-κB p65) monokloninis antikūnas (partijos Nr.: 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd.).

ICS5000 jonų chromatografas, „Mul-Tigo“ mikroplato skaitytuvas (Thermo Fisher, JAV); „Powerpac HC+Mini“ baltymų elektroforezės prietaisas (Biorad, JAV); TS2 apverstas mikroskopas (Nikon, Japonija); LC -10 Aukštos kokybės skysčio chromatografas, Ri -20 diferencinis detektorius („Shimadzu Technology Co., Ltd.“, Japonija); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) tandemo gelio stulpelis (BRT įmonė, JK); CPA225D elektroninis balansas, Eppendorf5424 centrifuga (Sartorius, Vokietija).

 

1.2 Eksperimentiniai metodai
1.2.1 CDPS bendro cukraus, urono rūgšties ir baltymų kiekio nustatymas

Metodas buvo laikomasi pagal nuorodą [14]. Bendras cukraus kiekis CDP buvo nustatytas fenolio ir jauko rūgšties metodu; CDP urono rūgšties kiekis buvo nustatytas M-hidroksibifenil kolorimetriniu metodu; o baltymų kiekis CDP buvo nustatytas naudojant „Coomassie Brilliant Blue“ metodą.

 

1.2.2 molekulinės masės nustatymas

Polisacharidų molekulinio masės pasiskirstymas buvo aptiktas aukšto našumo gelio prasiskverbimo chromatografijos tandemo kolonomis. Standartinio dekstrano (dekstrano p {{0}}}, p -10, p -20, p -50, p {{4 {4}}, p -200 ir pavyzdžių ir pavyzdžių ir pavyzdžių ir pavyzdžių ir pavyzdžių, p {{{{{{{7 {{{8 {{{8 {{8 {{{{{{{{{{{{{7 {7}). 0. 0 5 mol/l prieš naudojimą. Galutinė koncentracija buvo 5 mg/ml, sūkurys, kad ištirptų, ir centrifuguota esant 12 0 00 r/min 10 min. Supernatantas buvo įkvėptas ir filtruojamas 0,22 μm vandens mikroporinė membrana. Po greitojo centrifugavimo kaip mobilioji fazė buvo naudojama 0,05 mol/L NaCl. Chromatografinė stulpelis buvo BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); Srauto greitis buvo 0,7 ml /min; Stulpelio temperatūra: 40 laipsnių; injekcijos tūris: 25 μl; detektorius: diferencialinis detektorius RID -20 a; Analizės laikas: 62 min. Pasirinkite aukščiau pateiktą chromatografinį metodą analizei, gaukite sulaikymo laiką ir nubraižykite didžiausios molekulinės masės (MP) logaritmą ant ordinato (LGMP) ir sulaikymo laiką (RT) ant abscisos (LGMP-RT). Standartinė kreivė: Remiantis aukščiau pateiktu metodu, svorio ir vidutinio molekulinės masės (MW) sulaikymo laiko standartinė kreivė LGMW-RT ir numerio ir vidutinio molekulinės masės (MN) sulaikymo laiko standartinė kreivė LGMN-RT buvo pagaminti siekiant gauti molekulinę masę. Skaičiavimo formulė. Pakeitus mėginio sulaikymo laiką į formulę, galima gauti molekulinę masę (MP, MW, Mn).

1.2.3 Monosacharidų sudėtis

Monosacharidų sudėtis buvo nustatyta naudojant jonų chromatografiją. Paimkite tinkamus 16 monosacharidų standartų (fukozės, rhamnozės, arabinozės, galaktozės, gliukozės, ksilozės, mannozės, fruktozės, ribozės, galakturono rūgšties, gliukurono rūgšties, aminogalaktozės hidrochlorido), gliukosamino hidrochlorido, n-acetilosamino, gliukosamino hidrochlorido, n-acetilozamino, žmogaus rūgšties, žmogaus rūgšties). Iš 3 mol/L trifluoracto rūgšties (TFA), hidrolizuota 120 laipsnių 3 valandas, išdžiovinta azotu ir pridedama, kad būtų pašalintas sūkurys dejonizuotas vanduo, kad gerai išmaišytų ir paruotų standartinį atsargų tirpalą. Paimkite kiekvieną monosacharido standartinį tirpalą ir tiksliai paruoškite koncentracijos standartą kaip mišrų standartą. Remiantis absoliučiu kiekybinio įvertinimo metodu, buvo nustatyta skirtingų monosacharidų masė, o molinio santykis buvo apskaičiuotas remiantis moline monosacharidų mase.
Į polisacharidą įpilkite 2 ml 3 mol/L TFA ir 3 valandas reaguokite 12 0 laipsniu. Reakcijos metu N2 buvo naudojamas apsaugai. Ištirpinkite po išgarinimo esant sumažintam slėgiui. Įmaišykite 5 ml vandens ir sūkurį, kad maišytumėte. Paimkite 5 0 µl ir įpilkite 950 µL dejonizuoto vandens. Centrifuga 5 min. Supernatantas buvo filtruojamas per 0,22 μm mikrofiltracijos membraną ir analizuojamas naudojant jonų chromatografiją. Kolona buvo „Dionex CarbopactM PA20“ (3 mm × 150 mm); Mobilioji fazė buvo: H2O; B: 15 mol/lnaoH; C: 15 mol/ L NaOH ir 100 mol/ L Naac; Srauto greitis: 0,3 ml/min; injekcijos tūris: 25 µl; Kolonos temperatūra: 30 laipsnių; Detektorius: elektrocheminis detektorius; eliuavimo gradientas Žr. 1 lentelę.

 

1 lentelė Mobiliosios fazės gradiento eliuavimo lentelė

 

 

1.2.4 infraraudonųjų spindulių spektro aptikimas

Sverkite 1 mg sauso polisacharido ir KBR miltelių, sumalkite ir sumaišykite juos į skiedinį ir suspauskite juos į plonus lakštus, naudodamiesi tablečių presu. Analizė buvo atlikta naudojant Furjė transformacijos infraraudonųjų spindulių spektrometrą bangos skaičiaus diapazone 4500 ~ 400 cm -1.

 

1.2.5 Apsauginis CDP poveikis didelėms gliukozės sukeltoms HK -2 ląstelėms sergant diabetine nefropatija

1.2.5.1 HK -2 ląstelių kultūra

Po HK {{0}} ląstelių buvo atgaivintos, jos buvo kultivuojamos visoje terpėje, kurioje buvo 10% vaisiaus galvijų serumo ir 1% dvigubo antikūno, o ląstelės buvo dedamos į ląstelių kultūros inkubatorių 37 laipsnių, 5% CO2 ir prisotinta drėgmę, kad ji būtų laikoma siena. . Kai ląstelės išauga nuo 80% iki 90%, jos suskaidomos 0,25% tripsino ir subkultruota. Vėlesniems eksperimentams buvo naudojamos HK -2 ląstelės logaritminėje augimo fazėje.

 

1.2.5.2 CDPS atsargų tirpalo ir dozavimo koncentracijos paruošimas.

Tiksliai pasvarstykite 3 0 mg CDP, įpilkite 6 ml MEM aukštos gliukozės pilnos terpės, kad paruoštumėte 5 mg/ml CDPS atsargų tirpalą, ir laikykite jį 4 laipsnių šaldytuve. Naudodamiesi išmatuokite tam tikrą CDP motinos tirpalo tūrį, įpilkite auginimo terpės, gerai išmaišykite, sterilizuokite su 0,22 μm steriliu filtru ir paruoškite tinkamos koncentracijos mėginio tirpalą.

 

1.2.5.3 CDP poveikis normalioms HK -2 ląstelėms

HK -2 ląstelės logaritminėje augimo fazėje buvo pasėtos 96- šulinių plokštelėse, kurių tankis yra 3000 ląstelių/šulinys. Remiantis preliminariais eksperimentiniais rezultatais, ląstelės buvo suskirstytos į normalią kontrolinę grupę (kontrolinė grupė, CON), skirtingos masės koncentracijos (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml).
Buvo įsteigta tuščia grupė, kurioje yra tik auginimo terpė; Po auginimo su auginimo terpe ar vaistais 24 ir 48 valandas, į kiekvieną šulinį buvo pridėta 100 μl auginimo terpės, kurioje yra 10% CCK -8, o ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsniais, kad būtų išvengta atostogų šviesoje 1,5 val. Kiekvieno šulinio optinis tankis (OD) buvo matuojamas 450 nm bangos ilgiu, naudojant mikroplato skaitytuvą, o ląstelių gyvybingumas (%) buvo apskaičiuotas pagal formulės „ląstelių gyvybingumą (%)=[(OD), kad būtų galima išlikę šulinio šulinį) (OD, kad būtų galima valdyti, kad būtų įvertinta kiekvienos šulinio / OD, o OD - OD - × 100%“. normalios ląstelės.

1.2.5.4 HK -2 ląstelių aukštas gliukozės modeliavimo laikas ir koncentracijos patikra
Paruoškite gliukozės (gliukozės, GLC) atsargų tirpalą (10 mg/ml) ir praskieskite ją visišku auginimo terpės ir modeliavimo koncentracijomis atitinkamai 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ir 80 mmol/L. HK -2 ląstelės logaritminėje augimo fazėje buvo pasėtos 96- šulinių plokštelėse esant 3000/šuliniams, o CON, modelio grupė (modelis, MOD) ir tuščios reguliavimo grupė buvo nustatyti atitinkamai ir jiems buvo suteiktos visiškos kultūros vidutinio ir aukštos gliukozės kultūros terpės, atitinkamai skirtingų koncentracijų. , lygus visos kultūrinės terpės kiekis, kultūra 24 ir 48 valandas ir nustato ląstelių gyvybingumą pagal metodą, esantį „1.2.5.3“.

 

1.2.5.5 CDP poveikis modelio ląstelių išgyvenamumo greičiui

Remiantis eksperimentiniais „1.2.5.4“ rezultatais, HK -2 ląstelės logaritminės augimo fazėje buvo pasėtos 96- šulinių plokštelėse, kurių tankis yra 3000 ląstelių. Ląstelės buvo suskirstytos į CON, MOD, o skirtingos 50, 100 ir 200 masės koncentracijos ląstelės buvo kultivuojamos esant 400 ug/ml, 400 ug/ml ir 800 ug/ml CDP. Buvo nustatyta tuščia reguliavimo grupė be ląstelių. CON ir tuščios reguliavimo grupės buvo įtrauktos su vienodu kiekiu visos terpės. Mod ir kiekviena vaistais apdorota grupė buvo pridėta 60 mmol/L GLC ir auginama 24 valandas. , išmeskite kultūrinę terpę, pridėkite auginimo terpę arba atitinkamus vaistus ir kultūrą 24 ir 48 valandas, ir nustatykite ląstelių išgyvenamumą pagal metodą, esantį „1.2.5.3“.

 

1.2.5.6 CDP poveikis oksidacinių streso rodikliams modelio ląstelėse

According to the results of the experiment in "1.2.5.5", the cells were divided into Con, Mod, high dose CDPs group (CDPs-H, 400 mg/kg), middle dose CDPs group (CDPs- M, 200 mg/kg), low-dose CDPs group (CDPs-L, 100 mg/kg) and dapagliflozin group (Dapa, 10 μmol/L), and a blank group without cells was set up In Zero pakoregavimo grupė, po modeliavimo, buvo pridėta ir atitinkamų vaistų auginimo terpė arba atitinkami vaistai 24 valandas. Baltymai buvo surinkti, o lizatai buvo normalizuoti iki to paties lygio baltymų koncentracijos korekcija. Remiantis kiekvieno indikatoriaus rinkinio instrukcijomis, buvo aptiktas MDA, GSH-PX kiekis ir SOD aktyvumas kiekvienoje ląstelių grupėje.

 

1.2.5.7 ROS nustatymas HK -2 ląstelėse

Įpilkite ląstelės suspensiją prie 6- šulinio plokštelės ir įdėkite ją į ląstelių kultūros inkubatorių, kol ląstelės išaugs į monosluoksnį ir gauna atitinkamą stimuliaciją. Ląsteles 3 kartus nuplaukite iš anksto aušinamais PBS ir praskieskite MEM terpe be serumo. DCF-DA fluorescenciniai dažai buvo praskiedžiami iki galutinės 10 µmol/L koncentracijos. Dažai buvo įpilami į 6- šulinio plokštelę, ląstelės buvo plaunamos 3 kartus iš anksto aušinamais PBS, o DCFH-DA fluorescencinis dažas praskiedžiamas iki galutinės 10 µmol/L koncentracijos su mEM be serumo terpe. µmol/L, dažai buvo įpilami į {6- šulinio plokštelę, dažai buvo išmesti, ląstelės buvo tris kartus plaunamos MEM be serumo terpe, o po to vaizdai buvo surinkti fluorescenciniu mikroskopu.