Cistanche Deserticola ir jos ryžių vyno garinimo produktų neuroendokrininės imuninės funkcijos tyrimas gliukokortikoidų sukeltų žiurkių modelyje-Ⅰ

1. Įvadas

Cistanche deserticola, kuris vadinamas „dykumos ženšeniu“, yra tradicinė kinų medicina, kuri šimtmečius buvo naudojama kaip jang tonizuojanti žolėstiprina inkstus ir stiprina yang[1]. Aštuonios rūšys ir vienas jų variantasCistanche Herba buvo įrašyti Kinijoje ir tikCistanche deserticolaYC Ma irCistanche tubulosa(Schenk) Wight yra įrašytas į Kinijos farmakopėją [2]. Farmakologiniai tyrimai tai parodėCistanches Herbapasižymi neuroprotekciniu [3], imunomoduliuojančiu [4], kardioprotekciniu [5], nuo nuovargiu [6], priešuždegiminiu [7], hepatoprotekciniu [8], antioksidaciniu [9], antibakteriniu [10], vidurius laisvinančiu [11] ir priešnavikiniu poveikiu. poveikis [12]. Platuspraneštos šios genties biologinės veiklos spektras buvo priskirtas sudėtingai ir įvairiai fitocheminei sudėtimi.Cistanche deserticolasudėtyje yra feniletanolio glikozidų, iridoidų, polisacharidų [13] ir kt. Feniletanolio glikozidų kiekis yra didžiausias pirminėse vaistinėse medžiagose [14].

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA INKSTUMS GAIVINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kinijos Materia Medica (CMM) apdorojimas yra tradicinė farmacijos technika, skirta patenkinti skirtingus gydymo, dozavimo ir preparatų gaminimo reikalavimus pagal tradicinės kinų medicinos teoriją. Tie perdirbti produktai vadinami nuoviro gabalėliais, kurie naudojami klinikose. Apdorojimo tikslas – padidinti veiksmingumą mažinant neapdorotų vaistų toksiškumą. 2015 m. Kinijos farmakopėja užfiksavo, kad Cistanche stori griežinėliai (CD) ir ryžių vyne garuose Cistanche (WCD) gali būti naudojami kaip nuoviro gabaliukai klinikoje. Mūsų tyrimų grupė parodė, kad Cistanche garuose su ryžių vynu palengvėjo vidurius laisvinantis poveikis, o senėjimą stabdantis ir inkstus stiprinantis poveikis sustiprėjo [15].

Pagumburio-hipofizės-antinksčių-užkrūčio liaukos (HPAT) ašies funkcija yra sutrikusi esant inkstų ir jang trūkumo sindromui [16]. Pacientams, kuriems yra inkstų yang trūkumas, taip pat labai sutrikusi imuninė funkcija. HPA ašies disfunkcija yra glaudžiai susijusi su imunodeficitu. Neuroendokrininio imuninio tinklo (NEI) teorija rodo, kad imuninės ir neuroendokrininės sistemos turi daug ligandų ir receptorių [17], o pagumburis laikomas pagrindiniu tašku, susiejančiu neuroendokrininę sistemą su imuninėmis sistemomis.

Šiame tyrime pakartojome inkstų yang trūkumą modelio žiurkėms su eksogeninių kortikosteroidų injekcijomis ir ištyrėme inkstų-yang trūkumo mechanizmą reaguojant į skirtingus Cistanche deserticola perdirbtus produktus endokrininės imuninės funkcijos požiūriu.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos ir reagentai

Cistanche deserticola buvo surinkta iš Alashan Neimenggu 2019 m.5 ir identifikavo kaip džiovintus mėsingus Cistanche deserticola YC Ma stiebus prof. Yanjun Zhai (Farmacijos mokykla, Liaoningo tradicinės kinų medicinos universitetas, Kinija). Kuponų pavyzdžiai buvo saugomi Liaoningo apdorojimo inžinerinių technologijų centre.

Standartiniai ajugolio junginiai buvo įsigyti iš Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Čengdu, Kinija); cistanozidas F,echinakozidas, cistanosidas A ir izoakteozidasbuvo įsigyti iš „Must Company“ (Sičuanas, Kinija); akteozidas buvo įsigytas iš Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Kinija). MS klasės acetonitrilas ir metanolis buvo įsigyti iš Merck KGaA (Darmstadt, Vokietija). HPLC kokybės skruzdžių rūgštis buvo nupirkta iš Merck KGaA (Darmstadt, Vokietija). Ryžių vynas buvo pirktas iš Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Džedziangas, Kinija).

Kortikosteronas (CAS: 50-22-6, grynumas > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan tabletės (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), žiurkės AKTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 ir IL-10 ELISA aptikimo rinkiniai buvo įsigyti iš Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Žiurkių kortizolio ELISA rinkinį pateikė BOSK Co., žiurkės CD4 antikūnas, CD8a antikūnas (nr. 561833 ir 559976), eritrocitų lizatas (Solarbio, R1010), PBS buferinis tirpalas (Solarbio, P1020-500), TRIzolis (MAN0001271), CaM ir -aktinas prieš ir pasroviui. Atvirkštinės transkripcijos rinkinys (nr. RR037A) ir cDNR sintezės rinkinys (nr. 10000068167) buvo pateiktas Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroformas, izopropanolis, 75 % etanolis ir etanolis. Visi tirpalai buvo analitiškai gryni ir pagaminti Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Itin grynas vanduo buvo gaminamas naudojant Milli-Q sistemą (18,2 MΩ, Millipore, MA, JAV).

2.2. Eksperimentiniai instrumentai

Fermento žymeklis (Thermo, 3530911931 modelis), automatinė plokštelių plovimo mašina (modelis HBS- 4009), skaitmeninis ekranas, stūmimo ir traukimo jėgos matuoklis (modelis VICTOR- 50N), greitaeigė užšaldymo centrifuga (modelis Sigma 3k15). ), ultramikrospektrofotometras (modelis B-50Q), genų stiprintuvas (modelis L96G), realaus laiko fluorescencinis kiekybinis PGR (modelis StepOne), srauto citometras (modelis AC66051710132), parafino mikrotomas (modelis Laikalympus), mikroskopas (O , modelis BS-53) ir gryno vandens instrumentas (modelis F7JA36507).

2.3. Mėginių paruošimas UPLC-Q-TOF-MS ir farmakologiniams eksperimentams

WCD buvo apdorotas iš tos pačios partijosCistanche deserticolamūsų laboratorijoje. Norint paruošti WCD, sausi CD gabaliukai (5 mm storio) (100 g) buvo užpilami ryžių vynu (30 ml), garinami aukštu slėgiu (1,25 kPa) 4 valandas ir džiovinami 55 laipsnių temperatūroje.

Stambūs CD ir WCD milteliai buvo mirkomi 1 0 kartus 95% etanolyje 0,5 val., Ekstrahuojami su grįžtamu šaldytuvu 3 kartus kiekvieną kartą po 1 val., filtruojami, o filtratai 3 kartus sujungiami. Etanolis buvo išgautas sumažintame slėgyje ir gautas ekstraktas, skirtas vartoti. Ekstraktas (1 ml) buvo pridėtas prie 50% metanolio, padidinant bendrą tūrį iki 20 ml, ir laikomas 4 laipsnių temperatūroje turinio analizei.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS CD ir WCD ištraukų analizės sąlygos

2.4.1. LCThMS analizės sąlygos

Duomenų surinkimui ir apdorojimui buvo naudojama UPLC-MSThMS sistema su MassLynx 4.1 Analyst programine įranga. Analitinė kolonėlė buvo Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm), esant 40 laipsnių C temperatūrai. Judanti fazė buvo 0,1 % skruzdžių rūgšties vandeninis tirpalas (A) ir acetonitrilas, turintis 0,1 % skruzdžių rūgšties (B). Eliuacijos gradientas buvo 0.{15}}–1.{17}} min su 3% B, 1,01–2.{22}} min su 3%–11,5% B, 2,01–3.{29 }} min su 12 % B, 3,01–4.{34}} min su 15 % B, 4,01–5.{39}} min su 20 % B, 5,01–6.00 min su 22 % B, 6,01–8.{49}} min su 25% B ir 8,01–9.{54}} min su 10% B. Srauto greitis buvo 0,3 mLTh min., o įpurškimo tūris - 1,0 μL.

Neigiamų jonų režimu buvo naudojamas Waters trigubas keturgubas masės spektrometras (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, JAV), turintis elektropurškimo jonizacijos (ESI) šaltinį. Desolvatacijos dujos buvo azotas, kurio srautas buvo 500 LTh, esant 250 laipsnių temperatūrai. Visi aptikti junginiai buvo matuojami kelių reakcijų stebėjimo (MRM) režimu; 1 lentelėje pateikti energijos parametrai, o 2 lentelėje – analizuojamų komponentų kalibravimo kreivės.

2.4.2. Etaloninių medžiagų paruošimas

Tubulozidas A (302 mg), echinakozidas (300 mg), 2′-acetillakteozidas (2,34 mg), akteozidas (2,45 mg), izoakteozidas (0,61 mg), cistanozidas F ( 2,14 mg), salidrozido (3,39 mg), genipozido rūgšties (2,84 mg), ajugolio (1,58 mg) ir katalpolio (2,39 mg) buvo ištirpinti metanolyje, kad būtų paruoštas pradinis tirpalas. Pradinis tirpalas buvo praskiedžiamas metanoliu, kad būtų gautos tinkamos koncentracijos darbiniams standartiniams tirpalams. Visi paruošti tirpalai prieš naudojimą buvo laikomi 4 laipsnių temperatūroje.

2.5. Gyvūnų modelių rengimas ir grupavimas

SD žiurkių patinai (180–220 g) buvo įsigyti iš Liaoning Changsheng Biotechnological Co., gyvūnų leidimo numeris: SCXK (Liao) 2015–0001. Visoms žiurkėms buvo suteikta laisva prieiga prie maisto ir vandens 25 laipsnių temperatūroje ir 30–50% santykinė drėgmė. Prieš eksperimentą gyvūnai buvo laikomi 7 dienas.

Šimtas žiurkių atsitiktinai suskirstytos į 10 grupes: tuščiosios kontrolinės (BC) grupės, modelio kontrolinės (MC) grupės, teigiamos kontrolės (PC) grupės, ryžių vyno kontrolės (WC) grupės, CD didelės dozės (CD). -HD) grupė, CD vidutinės dozės (CD-MD) grupė, CD mažos dozės (CD-LD) grupė, WCD didelės dozės (WCD-HD) grupė, WCD vidutinės dozės (WCD-MD) grupė ir WCD mažos dozės (WCD-LD) grupė. CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD ir CD-LDThWCD-LD dozės buvo atitinkamai 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) ir 1,37 gTh (kg ∙ d). Dozė PC grupei buvo 1,646 gTh (kg ∙ d), o WC grupei - 1 mLTh100 g 40 dienų. 6 dieną po suleidimo žiurkėms po oda buvo sušvirkšta kortikosterono vandens suspensija (kortikosterono + 0,1 % dimetilsulfoksido + 0.1 % Tween-80 + 0,9 % natrio chlorido), išskyrus BC grupei [18]. Kortikosterono koncentracija buvo 5 gThL, o dozė – 0,1 mLTh100 g. BC grupės žiurkėms buvo duodama įprasto fiziologinio tirpalo + 0,1% dimetilsulfoksido + 0.1% Tween- 80 + 0.9% natrio chlorido injekcijomis ta pačia doze.

2.6. HPA ašies funkcijų nustatymas

2.6.1. Svorio, temperatūros ir laikymo galios testas

Svorio tyrimas buvo atliekamas kas 3 dienas, temperatūra matuojama kas 6 dienas. eksperimento metu. 39 dieną didžiausia užpakalinės galūnės jėga buvo matuojama sukibimo matuokliu. Žiurkės buvo pastatytos ant lygių platformų, todėl jų užpakalinė galūnė sugriebė stulpą. Žiurkės instinktyviai griebs bet kokį daiktą, kad nejudėtų atgal, kai uodega traukiama tol, kol traukimo jėga viršys sukibimą. Kai žiurkė prarado sukibimą, pirminis stiprintuvas galėjo automatiškai įrašyti didžiausią sukibimo jėgą.

2.6.2. T, CRH, AKTH, CORT ir kortizolio lygio nustatymas serume

Praėjus vienai valandai po paskutinio vartojimo, žiurkės buvo anestezuotos intraperitonine injekcija uretano tirpalu (20 gTh100 ml). Tada kraujo mėginiai buvo paimti, centrifuguojami 3500 r greičiu 15 minučių, kad būtų gautas serumas, ir laikomi –20 laipsnių temperatūroje. T, CRH, ACTH, CORT ir kortizolio koncentracijos buvo išmatuotos naudojant žiurkės ELISA rinkinius pagal gamintojo instrukcijas.

2.6.3. Stebėjimai mikroskopu

Antinksčių audinio morfologinė struktūra buvo stebima dažant HE. Antinksčių audinys buvo fiksuotas 10% paraformaldehidu, dehidratuotas etanolyje, skaidrus ksileno tirpalu, įterptas įprastais metodais, supjaustytas iki 4 μm storio griežinėliais, nuvaškuotas ksileno tirpalu, hidratuotas etanolio gradientu ir nudažytas hematoksilinu ir eozinu. dažymo tirpalas. Padarius skaidrią ksilenu, plokštelė buvo užsandarinta neutralia guma ir stebima mikroskopu.

2.6.4. Imunohistocheminis Bax, Bcl-2, kaspazės-3, Fas ir FasL baltymų ekspresijos dažymas antinksčiuose

Formalinu fiksuotos, į parafiną įterptos žiurkės antinksčių sekcijos buvo deparafinuotos ir rehidratuotos po to, kai buvo supjaustytos 4 μm storiu. Endogeninės peroksidazės aktyvumui blokuoti sekcijos buvo iš anksto inkubuojamos vandenilio peroksido bloke 1 0 min. Pjūviai buvo panardinti į 0,01 M citratą (pH 6,0) ir pakaitinti iki virimo. Procedūra kartojama po 5–10 min. Atvėsinus, pjūviai 1–2 kartus plaunami PBS (pH 7,2–7,6), maždaug 5 min. paliekami kambario temperatūroje ir 2–3 kartus plaunami PBS (pH 7,2–7,6). 5% BSA blokuojantis tirpalas buvo pridėtas kambario temperatūroje, o skysčio perteklius ant sekcijos buvo nukratytas po 20 minučių. Buvo pridėta praskiestų pirminių antikūnų, specifinių FasTh FasL, Bcl-2ThBax ir kaspazei-3 (1:100 praskiesta PBS) ir inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje 1 valandą arba 4 laipsnius per naktį. Pjūviai 2–3 kartus plaunami PBS (pH 7,2–7,6). Tada buvo pridėtas biotinilintas ožkų anti-pelės IgG, pjūviai džiovinami 20–37 laipsnių temperatūroje 20 minučių ir plaunami PBS (pH 7,2–7,6) 4 kartus 5 minutes. Po kruopštaus plovimo PBS, sekcijos buvo inkubuojamos su A ir B reagentų mišiniu 30 minučių, inkubuojamos su PBS 45 minutes ir galiausiai 30 minučių buvo sukurtos su DAB substratu (DAKO), prieš tai šiek tiek prieš dažant hematoksilinu, dehidratuotos, ir sumontuotas.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA SEKSUALINIAM JAUTUMUI PASTIPRINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Imuninių funkcijų nustatymas

2.7.1. Imuninių organų indekso apskaičiavimas

Praėjus valandai po paskutinio vartojimo, žiurkės buvo anestezuotos intraperitonine uretano tirpalo (20 gTh100 ml) injekcija, tada blužnis ir užkrūčio liauka buvo pašalinti ir nedelsiant pasverti steriliame gaubte. Blužnies arba užkrūčio liaukos svorio koeficientai (%) � blužnies arba užkrūčio liaukos svoris (mg) Kūno svoris (g).

2.7.2. T limfocitų pogrupių nustatymas periferiniame kraujyje

Splenocitai ir hemocitai buvo inkubuojami su monokloniniais antikūnais anti-CD4 (PE) ir anti-CD8 (FITC) 30 minučių tamsoje. Įpilta 2 ml eritrocitų lizato ir tirpalas maišomas maišant. Tirpalas buvo paliktas tamsoje 10 minučių ir centrifuguojamas 5 minutes. Supernatantas buvo išmestas, o po to tirpalas 3 kartus plaunamas lediniu PBS ir resuspenduojamas PBS permeabilizuojančiame tirpale. Mažiausiai 10,{11}} ląstelių buvo ištirta srauto citometrija per 1 val. po kiekvieno dažymo Mab.

2.7.3. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ir IFN-c kiekio serume nustatymas

Praėjus valandai po paskutinės dozės, žiurkės buvo anestezuotos intraperitonine uretano tirpalo (20 gTh100 ml) injekcija, o kraujas buvo paimtas iš pilvo aortos. Kraujas buvo centrifuguojamas 3500 R greičiu 15 minučių, kad būtų gautas serumas, ir laikomas –20 laipsnių temperatūroje. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ir IFN-c koncentracijos buvo nustatytos naudojant žiurkės ELISA rinkinius pagal gamintojo instrukcijas.

2.8. CaM ekspresija hipotalamo ir hipofizės audiniuose

Bendra RNR buvo išskirta iš pagumburio ir hipofizės audinių TRIzol. Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta 10 μL visos RNR pagal gamintojo instrukcijas. Lygiai kDNR kiekiai buvo išanalizuoti naudojant qPCR, naudojant dsDNR surišančius dažus (Promega, JAV) ir CFX 96 realaus laiko PGR sistemą (Bio-Rad, JAV), kad būtų galima pažvelgti į skirtingus genus pradinio aktyvavimo sąlygomis. 95 laipsnių 10 minučių, 40 denatūravimo ciklų 95 laipsnių temperatūroje 15 s ir atkaitinimo pratęsimo 60 laipsnių temperatūroje 1 min.

CaM ir -aktino pradmenys pateikti 1 lentelėje, o -aktinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. Kiekvienas mėginys buvo normalizuotas naudojant kritinių slenksčių (Ct) skirtumą tarp tikslinio geno ir -aktino. Rezultatui aprašyti buvo panaudota tokia lygtis: ΔΔCt � (Ct tikslinis genas − Ct -aktino genas) eksperimentinė grupė − (Ct tikslinis genas − Ct -aktino genas) kontrolinė grupė. Tada kiekvieno mėginio mRNR lygiai buvo lyginami naudojant ekspresijos 2- ΔΔCt tikslinį geną. Kiekvienos grupės rezultatai buvo suvidurkinti (3 lentelė).

2.9. Statistinė analizė

Visi duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS programinę įrangą (19 versija.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami naudojant vienpusę kartotinių matavimų dispersinę analizę (ANOVA). Rezultatai buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD), naudojant GraphPad Prism programinę įrangą (6 versija.0, San Diegas, CA, JAV). Skirtumai, kurių P reikšmė mažesnė nei 0,05, buvo laikomi statistiškai reikšmingais.

3. Eksperimento rezultatai

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalysis

Norint pasiekti geriausią atskyrimą, smailės formą ir trumpą analizės laiką, mūsų preliminaraus eksperimento metu buvo tiriamos chromatografinės sąlygos, įskaitant kolonėlę, mobiliąją fazę ir gradiento programą. Tipiškos chromatogramos su MRM režimu pateiktos 1 paveiksle.

Iš 4 lentelės matome, kad feniletanoidų glikozidų kiekis WCD padidėjo, palyginti su CD, ypač echinakozido ir akteozido, o iridoidų kiekis WCD sumažėjo.

3.2. HPA ašies funkcijos reglamentas

3.2.1. Svorio, temperatūros ir laikymo galios testas

MC grupės ir eksperimentinių grupių žiurkėms laipsniškai pasireiškė inkstų ir jang trūkumo simptomai po kortikosterono. Simptomai, tokie kaip svorio kritimas, hipotermija, plaukų blizgesio praradimas, slenkanti dvasia, reakcijos vėlavimas ir reikšmingas vandens suvartojimo bei aktyvumo sumažėjimas, labai pagerėjo CD ir WCD grupėse. 2(a) paveiksle pavaizduoti svorio pokyčiai. Kiekvienos narkotikų grupės svoris padidėjo, ypač CDHD ir WCD-HD grupėse. MC grupėje svorio prieaugis buvo mažiausias. 2(b) paveiksle pavaizduoti temperatūros pokyčiai, kurie buvo mažiausi MC grupėje, o temperatūra padidėjo WCD-HD, WCD-MD ir WCD-LD grupėse.

2 paveiksle (c) parodyta, kad BC grupės ir kiekvienos eksperimentinės grupės laikymo galia padidėjo, o WCD-MD grupė buvo didžiausia, o tai parodė, kad inkstų-yang trūkumo sukelto silpnumo požymiai pagerėjo po vartojimo.

3.2.2. T, CRH, ACTH, CORT ir kortizolio lygiai

3 paveiksle parodyta, kad, palyginti su BC grupe, T, CRH, AKTH ir CORT lygis žiurkės serume sumažėjo (P < 0.01) ir sumažėjo kortizolio kiekis (P < 0.05) MC grupėje. Palyginti su MC grupe, T lygis WCD-HD ir WCD-MD grupėse padidėjo (P < 0.01), CRH lygis WCD-LD, WCD-MD ir WC grupės pagerėjo (P < 0.01), AKTH kiekis padidėjo CD-HD, WCD-MD ir WCD-HD grupėse (P < 0,01), CORT lygis padidintas CD-MD, WCD-MD ir WCD-HD grupėse (P < 0,01) ir padidėjo CDHD ir WCD-LD grupėse (P < 0,05), o kortizolio lygis padidėjo kiekvienoje vaistų grupėje.

3.2.3. Stebėjimo mikroskopu rezultatai

Antinksčių audinys gali būti suskirstytas į žievės sluoksnį ir smegenų sluoksnį. Žievės sluoksniai apima rutulinius, ryšulius ir tinklinius sluoksnius. Ląstelėse yra daugiau lipidų, o šerdies sluoksnį sudaro daugiausia feochromocitomos ląstelės ir nedidelis kiekis pluoštinio audinio. Kaip parodyta 4 paveiksle, mes nustatėme, kad BC grupėje viskas buvo normalu, o MC grupėje antinksčių žievė turėjo akivaizdžią hiperplaziją, ląstelių atrofiją ir didėjantį tankį. Svogūninė juostelė sustorėjo, o peršviečiama fascikulinė zona, siaura zona reticularis ir mažesnės ląstelės pasižymėjo nevienoda spalva ir kapiliarų perkrova. PC grupėje buvo matomos žievės ir medulinės ribos. Rutulinių ir ryšulių juostų ląstelės išsidėsčiusios tolygiai, atkurta morfologinė struktūra. Toks pat geresnis atkūrimas buvo pastebėtas WCD grupėse, o WCD-MD grupės poveikis buvo geresnis nei WCD-HD ir WCD-LD grupių. Antinksčių morfologija CD grupėse nebuvo tokia gera kaip WCD grupėse.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%