Cistanche Deserticola ir jos ryžių vyno garinimo produktų neuroendokrininės imuninės funkcijos tyrimas gliukokortikoidų sukeltų žiurkių modelyje-Ⅱ

3.2.4. Imunohistochemija

Neuronų apoptozę kontroliuoja daugelis apoptozinių ir antiapoptotinių genų, daugiausia apoptozę skatinantis genas Bax ir antiapoptoziniai Bcl-2 genų šeimos genai. Bcl-2 yra reaktyviosiose deguonį gaminančiose organelėse, tokiose kaip mitochondrijos, endoplazminis tinklas ir branduolinės membranos. Bcl-2 mažai veikia laisvuosius deguonies radikalus, bet galiužkirsti kelią oksidaciniam pažeidimui ląstelėse. Baxas perneša iš citoplazmos į mitochondrijų membraną, keičia mitochondrijų membranos struktūrą, skatina citochromo c išsiskyrimą ir apoptozės indukciją.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Antinksčių citoplazmoje buvo Bax ir Bcl{0}} baltymo ekspresija. Dažymas parodė visas geltonas daleles. Palyginti su BC grupe, vidutinis Bax baltymo optinis tankis MC grupėje žymiai padidėjo (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

5(b) paveiksle parodyta, kad, palyginti su BC grupe, vidutinis Bcl-2 baltymo optinis tankis MC grupėje žymiai sumažėjo (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Kaspazės -3 baltymas yra lokalizuotas daugiausia citoplazmoje savo pradine forma normaliuose audiniuose ir turi mažą ekspresiją. Teigiami signalai yra šviesiai geltoni arba rusvai geltoni. Palyginti su BC grupe, kaspazės -3 ekspresija MC grupėje žymiai padidėjo (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

Normaliuose audiniuose Fas geno ekspresija buvo sumažinta, o teigiamas in situ hibridizacijos signalas buvo rusvai geltonas. Kaip parodyta 5 paveiksle (d), palyginti su BC grupe, vidutinis Fas baltymo optinis tankis MC grupėje padidėjo (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

FasL baltymas daugiausia yra ląstelės membranoje arba citoplazmoje, o jo teigiami signalai yra rudi. Palyginti su BC grupe, vidutinis FasL geno optinis tankis MC grupėje žymiai padidėjo (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Rezultatai parodė, kad CD ir WCD galisukelti apoptozę uždegiminėse ląstelėseir sumažinti antinksčių pažeidimą skatinant FasL baltymo ekspresiją ir prisijungimą prie Fas baltymo, aktyvinant kaspazės{0}} baltymą ir suaktyvinant kaspazės kaskadą. WCD-HD grupės poveikis buvo geriausias.

3.3. Imuninės funkcijos nustatymas

3.3.1. Imuninių organų indeksas

Palyginti su BC grupe, MC grupės užkrūčio liaukos koeficientas ir blužnies indeksas žymiai sumažėjo (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. T limfocitų pogrupių nustatymas periferiniame kraujyje

CD{0}} ląstelių procentas viršutiniame kairiajame kvadrante ir CD8+ ląstelių dešiniajame apatiniame kvadrante BC ir kiekvienoje vaistų grupėje buvo didesnis nei MC grupėje. Lyginant su BC grupe, CD4+ThCD8+ santykis reikšmingai sumažėjo MC grupėje (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α ir IFN-C kiekio serume nustatymas

8 paveiksle parodyta, kad, palyginti su BC grupe, IL-6, TNF- ir IFN-c lygis žymiai padidėjo (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Laimo audinių mikroskopo stebėjimo eksperimento rezultatai

9 paveiksle parodyta, kad BC grupėje buvo daug limfocitų. Limfocitai ir retikulocitai buvo laisvai išdėstyti centre su išsibarsčiusiais apvaliais arba ovaliais timocitais. Nebuvo nekrozės, uždegiminių ląstelių infiltracijos ir nenormalių pokyčių.

MC grupėje buvo didelis limfoidinės nekrozės audinio kiekis, kurio centre buvo netvarkingas limfocitų ir retikulocitų išsidėstymas. Išnyko apvalūs arba ovalūs timocitai, buvo akivaizdi masinė ląstelių degeneracija arba nekrozė, buvo uždegiminių ląstelių infiltracija su nenormaliais patologiniais pokyčiais.

CD grupėse limfocitų morfologinės charakteristikos normalizavosi, centrinių limfocitų ir retikulocitų išsidėstymas buvo beveik normalus. Atsigavo apvalūs arba ovalūs timocitai, tačiau liko nedaug degeneracinių ar nekrozinių limfocitų ir infiltruojančių uždegiminių ląstelių.

WCD ir PC grupėse limfocitų morfologinės charakteristikos buvo geriau pataisytos. Limfocitai ir retikulocitai centre buvo gerai išsidėstę, apvalūs arba ovalūs timocitai buvo beveik normalūs, tačiau išliko nedaug infiltruojančių ir degeneracinių limfocitų.

3.4. CaM baltymų geno ekspresija

RQ reikšmė (CaM mRNR-aktino mRNR) buvo laikoma CaM mRNR ekspresijai ištirti. BC grupės RQ buvo 1. CaM mRNR ekspresija pagumburyje MC grupėje žymiai padidėjo (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Diskusija

Kinijos farmakopėjoje [2] įrašyta, kad CD ir WCD gali būti naudojami klinikoje kaip pagrindiniai gabalėlių išvalymo tipai. Po to, kai buvo išgarintas su ryžių vynu,senėjimą stabdantis ir tonizuojantis inkstų-yang poveikisbuvo sustiprinti. Per UPLC-QqQ-MS aptikome kiekybinius cheminės medžiagos bazės pokyčius ryžių vyno garinimo proceso metu. Iridoidiniai glikozidai buvo nestabilūs, o šių glikozidų kiekis sumažėjo, net tapo neaptinkamas. Taip pat pakito feniletanolio glikozidų kiekis, kuris galėjo sukelti farmakodinamikos ir klinikinio poveikio pokyčius.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klasikinis inkstų ir jang trūkumo modelis buvo pakartotas po oda suleidus kortikosterono [19]. Kortikosterono perdozavimas gali slopinti CRH paslaptį pagumburyje. Tuo tarpu AKTH paslaptis taip pat buvo slopinama. Antinksčių žievės hormono lygis sumažėjo, todėl HPA ašies funkcija sumažėjo. HPA ašies hipofunkcija yra bendra inkstų-yang trūkumo savybė [20]. Tada žiurkėms pasireiškia „išsekimo“ reiškiniai, o simptomai sutampa su inkstų yang trūkumo klinikoje simptomais.

MC grupėje CRH, AKTH, T ir CORT kiekis žiurkės serume žymiai sumažėjo (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Bcl{0}} šeimos narių proporcijos keitimas yra vienas iš pagrindinių mechanizmų, kuriais FasThFasL tarpininkauja mirties receptorių kelyje, o Bcl-2 šeima reguliuoja mitochondrijų kelią [21]. Apoptozę slopinantis faktorius Bcl-2 ir apoptozę indukuojantys faktoriai, tokie kaip Bax, priklauso Bcl-2 šeimai [22]. Ląstelių apoptozę galima nustatyti pagal santykinį apoptozę slopinančių ir apoptozę sukeliančių faktorių santykį [23]. Mitochondrijos atlieka centrinių daugelio apoptozės formų kontrolinių taškų funkciją [24]. Šis tyrimas parodė, kad CD-MD ir WCD gali nustatyti Bax ekspresiją ir padidinti Bcl{13}} ikipagerinti inkstų-yang trūkumą. Fas yra pagrindinis mirties receptorius, sukeliantis apoptozę surišant su Fas ligandu (FasL) [25]. Fas ir FasL ekspresija MC grupėje padidėjo, o ši išraiška žymiai padidėjo WCD-MD grupėje (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Imuninės funkcijos trūkumas yra viena iš svarbių inkstų ir jang trūkumo apraiškų [28]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad WCD-MD grupės blužnies ir užkrūčio liaukos indeksas žymiai atsigavo (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

HPA ašis yra svarbiausia reguliavimo sistema, nes ji reguliuoja gliukokortikoidų sekreciją ir endokrininę sistemą, kad palaikytų antinksčių žievės sekrecinę funkciją [32]. Per didelis CaM mRNR ekspresija pagumburio audinyje buvo susijusi su inkstų yang trūkumu. CD ir WCD gali blokuoti kalcio kanalus, slopinti CaM mRNR ekspresiją pagumburyje ir sumažinti kalcio antplūdį, taip sumažinant Ca2+·CaM komplekso aktyvumą.

Inkstų-yang trūkumo susidarymas yra lėtinis ligos vystymosi procesas. Inkstai nebėra grynai anatominė sąvoka, o bendras terminas neuroendokrininiam imunitetui ir urogenitalinėms sistemoms. Neuroendokrininis-imuninis (NEI) tinklas yra svarbi integruota reguliavimo sistema [33]. CD ir WCD gali reguliuoti HPAT ašies funkciją ir pagerinti inkstų-yang trūkumo atsigavimą. Šis rezultatas yra eksperimentinis inkstų-yang trūkumo klinikinės prevencijos ir gydymo pagrindas.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%