Sinergetinis pelių imunitetas ir apsauga, bendrai imunizuojant DNR vakcinomis, koduojančiomis SARS-CoV smaigalio baltymą ir kitus struktūrinius baltymus-2

Santrauka:Naujų sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS CoV-2) variantų atsiradimas sukėlė pasikartojančius infekcijų protrūkius visame pasaulyje. Šie labai mutuoti variantai sumažina dabartinių koronavirusinės ligos 2019 (COVID-19) vakcinų, kurios skirtos tik pradinio viruso smaigalio (S) baltymui, veiksmingumą. Išskyrus SARS-CoV -2 S, kitų struktūrinių baltymų (nukleokapsidės, N; apvalkalo, E; membranos, M), kaip vakcinos tikslinių antigenų, imunoprotekcinis potencialas vis dar neaiškus ir vertas tyrimo. Šiame tyrime buvo sukurtos sintetinės DNR vakcinos, koduojančios keturis SARS-CoV-2 struktūrinius baltymus (pS, pN, pE ir pM), o pelės buvo imunizuotos trimis dozėmis švirkščiant į raumenis ir atliekant elektroporaciją. Pažymėtina, kad bendrai imunizacija su dviem DNR vakcinomis, kurios ekspresavo S ir N baltymus, sukėlė didesnį neutralizuojančių antikūnų kiekį ir buvo veiksmingesnis mažinant SARS-CoV-2 viruso apkrovą nei vien S baltymas pelėms. Be to, pS koimunizacija su pN arba pE + pM sukėlė didesnį S baltymui specifinį ląstelių imunitetą po trijų imunizacijų ir sukėlė švelnesnius histopatologinius pokyčius nei vien pS po užkrėtimo. Konservuotų struktūrinių SARS-CoV-2 baltymų, įskaitant N/E/M baltymus, vaidmuo turėtų būti toliau tiriamas, siekiant juos pritaikyti kuriant vakcinas, pvz., mRNR vakcinas.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Raktiniai žodžiai: COVID-19; SARS-CoV-2}}; bendra imunizacija; DNR vakcina; smaigalio baltymas; struktūrinis baltymas

1. Įvadas

Sunkus ūminis respiracinio sindromo koronavirusas 2 (SARS-CoV-2) yra 2019 m. koronavirusinės ligos (COVID-19), kuri visame pasaulyje sukėlė milijonus infekcijų ir mirčių bei kėlė pavojų žmonių sveikatai ir pasaulio ekonomikai, priežastis. . Nors veiksmingi gydymo metodai vis dar nepasiekiami, jie sparčiai tobulėjo, įskaitant CAR-T ląstelių terapijos ir nanotechnologijų taikymą [1, 2]. Vakcinacija yra veiksmingas būdas kontroliuoti pandemiją, todėl įvairios sveikatos priežiūros institucijos patvirtino keletą vakcinų [3,4]. Koronaviruso genomas koduoja keturis pagrindinius struktūrinius baltymus, būtent smaigalio (S), nukleokapsidės (N), membranos (M) ir apvalkalo (E) baltymus, kurie yra atsakingi už virionų surinkimą ir šeimininko imuninio atsako slopinimą [5] ]. S baltymas susideda iš 1273 aminorūgščių liekanų, turinčių du subvienetus, būtent S1 ir S2. Jis tarpininkauja virusams ir yra pagrindinis koronaviruso vakcinų kūrimo tikslas [6–11]. Tačiau SARS-CoV-2 S baltymas turi didelį mutacijų dažnį. Nenuostabu, kad SARS-CoV-2, RNR viruso, mutacija yra nuolatinė ir neišvengiama. Nuo 2020 m. rugsėjo mėn. atsirado penki SARS-CoV{21}} susirūpinimą keliantys variantai (LOJ), įskaitant B.1.1.7 (JK, alfa), B.1.351 (Pietų Afrika, beta), P.1 (Brazilija, Gama), B.1.617.2 (Indija, Delta) ir B.1.1.529 (Pietų Afrika, Omikronas) (Andreano ir Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Jie visi turi keletą smaigalio baltymo mutacijų [12]. Šie variantai kelia grėsmę dabartinių COVID-19 vakcinų, kurios skirtos tik smaigalio baltymui, veiksmingumui.

SARS-CoV-2 N baltymas jungiasi su viruso RNR per 140-aminorūgšties ilgą RNR surišantį domeną jų šerdyje „karoliukais ant stygos“ būdu. Jis yra labai konservuotas tarp koronavirusų, turintis ~ 90% sekos tapatybę su SARS-CoV, be to, tai yra vienintelis struktūrinis baltymas viriono viduje [13]. Be to, jis atlieka svarbų vaidmenį pakuojant virusinę RNR į ribonukleo kapsidų kompleksą ir yra būtinas viruso RNR replikacijai, virionų surinkimui ir išsiskyrimui iš šeimininkų ląstelių [14]. Remiantis dideliu koronavirusų N baltymo sekos panašumu, jis gali būti pasiūlytas kaip kryžminės apsaugos vakcinos taikinys. Anksčiau mes nustatėme, kad bendrai imunizacija dviem DNR vakcinomis, ekspresuojančiomis E ir M baltymus, suteikia dalinę apsaugą nuo SARS-CoV-2, todėl šį metodą reikėtų apsvarstyti kuriant vakciną [15]. Priklausomai nuo PSO pateikto kraštovaizdžio dokumento, dažniausiai yra septynios SARS-CoV{16}} vakcinos strategijos, kurias galima dar suskirstyti į tris kategorijas: pirma, baltymų pagrindu pagamintos vakcinos, įskaitant inaktyvuotas virusų vakcinas, į virusus panašias vakcinas. dalelių ir baltymų subvienetų vakcinos; antra, genų pagrindu sukurtos vakcinos, įskaitant vakcinas su virusais, DNR vakcinas ir mRNR vakcinas; trečia, baltymų ir genų metodų, tokių kaip gyvų susilpnintų virusų vakcinos, derinys. DNR technologijos, kaip naujos genais pagrįstos vakcinų strategijos, gali greitai palyginti kelias vakcinų kandidatūras ir strategijas ikiklinikinių tyrimų metu [16, 17]. Teoriškai beveik visi viruso baltymai yra potencialūs imunogenai ir vakcinos taikiniai. Tačiau, mūsų žiniomis, dar reikia sistemingai pranešti apie sintetinių DNR vakcinų imunogeniškumą ir apsauginį potencialą, koduojant SARS-CoV-2 S baltymus ir kitus struktūrinius baltymus. Buvo įvertintas keturių DNR vakcinų, ekspresuojančių SARS-CoV-2 S, N, E ir M l baltymus, imunogeniškumas ir apsauginis veiksmingumas pelėms, siekiant ištirti imunologinį S poveikį kartu su kitais struktūriniais baltymais.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Ląstelės

Huh7.5 ląstelės ir žmogaus embriono inksto 293T ląstelės buvo kultivuojamos 37 ◦C temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO2. Ląstelės buvo auginamos DMEM terpėje (HyClone, Logan, UT, JAV), papildytos 10% FBS (GEMINI Co., Šanchajus, Kinija) ir 1% penicilino-streptomicino (Gibco, Niujorkas, NY, JAV). Buvo patvirtinta, kad visos ląstelių linijos yra neigiamos užteršimui mikoplazma.

2.2. DNR vakcinų, koduojančių SARS-CoV-2 S/N/E/M, konstravimas

SARS-CoV-2 S/N baltymą koduojantis genas, turintis N-galo Kozak seką (GCCACC), po kurio seka iniciacijos kodonas (ATG), buvo susintetintas naudojant žinduoliams optimizuotą kodoną (GenScript Co., Nanjing). , Kinija). Tada jis buvo klonuotas į ekspresijos vektorių pcDNA3.1 (+) per EcoRI ir XbaI skaidymą ir pavadintas pS/pN (DNR vakcinos) (1A pav.). pE / PM baltymas buvo sukonstruotas ir identifikuotas, kaip aprašyta anksčiau [15]. Vakcinos buvo paruoštos naudojant Maxiprep rinkinius be endotoksinų (Qiagen, Pekinas, Kinija), o sekos patvirtintos naudojant Sanger DNR seką. S/N baltymo ekspresija buvo patvirtinta naudojant Western blot ir anti-S (Sino Biological, Pekinas, China)/anti-N antikūnus, praskiestus santykiu 1:1000. Šie eksperimentai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau [15, 18].

1 pav. Rekombinantinės DNR pagrindu pagamintų SARS-CoV-2 S/N baltymų vakcinos konstrukcijų dizainas ir ekspresija. (A) Rekombinantinių DNR vakcinų, koduojančių SARS-CoV-2 smaigalį (PS), nukleokapsidės (pN), apvalkalo (pE) ir (arba) membranos (PM) baltymus, schema. (B) Tikslinio baltymo ekspresija DNR vakcinose buvo patvirtinta Western blot 293T ląstelių, transfekuotų pS/pN/pE/pM plazmidėmis, analize.

2.3. Imunizacija ir iššūkis

BALB/c pelių patelės (Charles River Laboratories, Prancūzija) 6 savaičių amžiaus buvo laikomos Nacionaliniame profesinės sveikatos ir apsinuodijimų kontrolės institute 21 ◦C ir drėgmės kontroliuojamoje aplinkoje su 12 h šviesos/tamsos ciklais. Tuo tarpu maistas ir vanduo buvo tiekiami ad libitum, o visus eksperimentus su gyvūnais patvirtino Kinijos ligų kontrolės ir prevencijos centro (China CDC) eksperimentų su gyvūnais etikos komitetas. Tyrimas atitiko atitinkamas etikos taisykles.

Pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į penkias grupes ir imunizuotos vien tik pS/pN arba kartu imunizuotos pS + pN arba pS + pE + PM 0, 21 ir 42 dienomis švirkščiant į raumenis ir elektroporacija (35 mg/50). ml) (2 pav.) [19,20]. Trumpai tariant, DNR vakcinos buvo sušvirkštos į blauzdikaulio priekinį (TA) raumenį ir nedelsiant impulsuojamos elektra, naudojant 5 mm atstumu vienas nuo kito esantį dviejų adatų matricos elektrodą (ECM830; BTX) su adatomis. Pelių serumai buvo surinkti humoralinio imuninio atsako analizei, o pelių blužniai buvo apdoroti, kad būtų galima išmatuoti ląstelių imuninį atsaką (2 pav.).

2 pav. Imunizacijos ir SARS-CoV-2 užkrėtimo schema. Skiepijimo, iššūkių ir kraujo / audinių mėginių ėmimo laikas. BALB / C pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į grupes.

SARS-CoV-2 užkrėtimo eksperimentai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau [15,21]. Trumpai tariant, pelės buvo anestezuotos ir po to į nosį transdukuotos 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2, kurio bendras tūris buvo 45 µL. Praėjus penkioms dienoms po transdukcijos, pelės buvo anestezuotos, o po to į nosį įšvirkštos 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019), kurių bendras tūris buvo 50 µL fiziologinio tirpalo. buferis. Visas darbas su gyvu SARS-CoV{20}} pelių modeliuose buvo atliktas 3 gyvūnų biologinės saugos lygio (ABSL-3) laboratorijose.

2.4. Imunofermentinis tyrimas

Su fermentais susiję imunosorbento tyrimai (ELISA) buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau [15]. Trumpai tariant, S (įsigyti iš Sino Biological) / N baltymai (dovanoti iš Song), praskiesti karbonatiniu buferiu (0,1 M, pH 9,6), buvo padengti ant 96-šulinėlių EIA/RIA plokštelių (Thermo). Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) per naktį 4 ◦C temperatūroje. Plokštelės buvo užblokuotos 200 µl 10% ožkos serumo PBS 37 °C temperatūroje 2 valandas, po to penkis kartus plaunamos PBST. Tada buvo pridėti serumo mėginiai, nuosekliai praskiesti 2% ožkos serumu PBS ir inkubuojami 2 valandas 37 ° C temperatūroje, po to penkis kartus plaunami PBST. HRP konjuguotas ožkos anti-pelės IgG Ab (1:5000) buvo pridėtas 37 ◦C temperatūroje 1 val. Iš viso į kiekvieną šulinėlį buvo pridėta 100 µL TMB substrato ir užgesinama 50 µL 2M H2SO4. Absorbcija buvo nuskaityta esant 450 nm bangos ilgiui naudojant SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Honkongas, Kinija).

cistanche augalą stiprinanti imuninė sistema

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Pseudovirusinės infekcijos ir neutralizacijos eksperimentai

Pseudoviruso neutralizavimo tyrimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [21, 22]. Anksčiau buvo sukurta plazmidė, ekspresuojanti protėvių viruso S baltymą [22]. Buvo susintetintas Omicron varianto SARS-CoV-2 smaigalio baltymo genas (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (dovanota iš Vazyme Biotech Co., Ltd., Nankinas, Kinija) naudojant žinduoliams optimizuotą kodoną ir klonuotas į pcDNA3.1 vektorių, kaip aprašyta anksčiau [22]. Trumpai tariant, plazmidės, ekspresuojančios luciferazės reporterį, ir plazmidės, ekspresuojančios S baltymą, buvo kartu transfekuotos į HEK 293T ląsteles, naudojant X-treme GENE HP DNR transfekcijos reagentą. Ląstelių kultūra buvo atnaujinta praėjus 6 valandoms po transfekcijos, o pseudoviruso turintis supernatantas buvo surinktas po 48 valandų ir laikomas –70 ◦C temperatūroje. Pseudoviruso neutralizavimo tyrime lygus serumo ir viruso mišinys buvo inkubuojamas su 37 tūriais pseudoviruso turinčio supernatanto ir po to buvo pridėtas prie praskiesto serumo. ◦C 1 val. Tada Huh7.5 ląstelių auginimo terpė buvo pakeista 100 µL serumo ir viruso mišinio ir 12 valandų inkubuojama 37 ◦C temperatūroje. Ląstelės, kultivuotos tik su SARS-CoV-2 pseudovirusais, buvo paleistos lygiagrečiai. Tada terpė buvo pakeista DMEM (2% FBS), o inkubacija buvo inkubuojama 37 ◦ C temperatūroje 48 valandas. Tada liuciferazės signalas buvo išmatuotas naudojant Bright-Glo ugniagesių luciferazės rinkinį (Promega).

2.6. SARS-CoV-2 neutralizacijos tyrimas

Šiame eksperimente buvo naudojamas SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Trumpai tariant, serumai buvo atskiesti du kartus nuo pradinio praskiedimo santykiu 1:10, sumaišyti su lygiu tūriu (10–15 pfu/šulinėliu) gyvo SARS-CoV-2 ir inkubuoti 1 valandą 37 ◦C temperatūroje, po to jie buvo pridėti prie pasėtų Vero ląstelių. Po 48 valandų inkubacijos 37 ◦C temperatūroje buvo pastebėtas citopatinis efektas (CPE) ir 100 µl kultūros supernatanto buvo paimta nukleino rūgščių ekstrakcijai ir realiojo laiko fluorescencinės atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR). Vidutinė neutralizacijos dozė (ND50) buvo apskaičiuota naudojant Reed-Munch metodą [15].

2.7. IFN-ELISpot tyrimas

Peptidų telkinius, apimančius visą S/N/E/M baltymą, kaip nuoseklius 15-merus, peržengiančius 10 aminorūgščių, susintetino Scilight Biotechnology, LLC. Viename buteliuke buvo maždaug 2,5 mg kiekvieno išgryninto peptido peptidų telkinyje. Eksperimentas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [18]. Trumpai tariant, 96-šulinėlių plokštelės (BD ELISPOT Set, JAV) buvo padengtos anti-IFN-fiksavimo Ab ir inkubuojamos per naktį 4 ◦C temperatūroje. Plokštelės buvo užblokuotos visa auginimo terpe, tris kartus plaunant. Splenocitai buvo paimti po to, kai pelės buvo eutanazuotos 35 dieną, o 120 kiekvienos grupės šviežių vienaląsčių suspensijų buvo dedamos po 5 × 106 šulinėlį ir pridėta peptidų. Tada plokštelės buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 5% CO2 22 valandas ir aptinkamos naudojant ELISpot plokštelių skaitytuvą (Biosys, So. Pasadena, CA, JAV). Dėmių formavimo vienetas (SFU) reiškia T ląsteles išskiriantį IFN-.

2.8. Pelių apsaugos įvertinimas po SARS-CoV{4}} iššūkio

Eksperimentai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau [15, 21]. Trumpai tariant, plaučiai buvo paimti po to, kai pelės buvo eutanazuotos. Pusė audinių buvo naudojami nukleino rūgščių ekstrakcijai, realaus laiko fluorescencinei RT-PCR ir TCID50. Kita pusė buvo išsiųsta į Kinijos žemės ūkio universiteto Veterinarinės medicinos kolegiją patologiniam vertinimui.

2.9. Statistinė analizė

Nesuporuoti t testai, dvipusiai ANOVA testai ir Dunnett kelių palyginimų testas buvo atlikti naudojant GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p reikšmės < 0.05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis (* p < 0.05; ** p < 0,01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Rezultatai

3.1. DNR vakcinų apibūdinimas

E ir M baltymų lygiai buvo nustatyti naudojant Western blot metodą. Mes išmatavome SARS-CoV-2 koduotų S/N/E/M baltymų ekspresiją HEK-293T ląstelėse, transfekuotose pS/pN/pE/pM plazmidėmis, taikant Western blot analizę, naudojant anti -S/anti-N antikūnai ir anti-6 x His antikūnas, ląstelių lizatuose. Juostos apytiksliai atitiko numatytą S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) ir M (22–25 kDa) baltymų molekulinę masę (1B pav.).

3.2. Tvirta ir ilgalaikė anti-S ir (arba) anti-N IgG gamyba, sukelta pS ir (arba) pN DNR

Vakcinos Serumas buvo paimtas iš BALB/c pelių 35, 56, 96 ir 120 dienų (2 pav.). Anti S/anti-N IgG lygiai buvo nustatyti naudojant ELISA. S arba N specifinio IgG atsako, kurį sukelia pS arba pN, dydis serume padidėjo po pirmojo ir antrojo padidinimo. Anti-S ir anti-N IgG titrai buvo didesni pS + pN grupėje nei kitose grupėse; tačiau skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (3A, B pav.). Nebuvo aptikta jokių tvirtų E/M baltymų specifinių antikūnų atsakų, o tai atitinka ankstesnio tyrimo rezultatus (duomenys nerodomi) [15].

3 pav. B-ląstelių atsakas į SARS-CoV-2 BALB/c pelėms. (A) SARS-CoV-2 S (A) ir N baltymų (B) IgG surišimo baigties titrai serume. (C) Neutralizacijos titrai buvo nustatyti remiantis SARS-CoV-2 pseudotipo viruso sistema. (D) Anti-SARS-CoV-2 neutralizacijos titrai buvo nustatyti naudojant SARS-CoV-2 virusą. (E) Neutralizacijos tyrimas, pagrįstas SARS-CoV{15}} Omicron pseudotipo viruso sistema. Rodomi imituotų (mėlyna), pS (raudona), pS + pN (žalia), pS + pE + pM (rožinė) ir pN (oranžinė) grupių serumų slopinimo santykiai. Klaidų juostos rodo SEM, o p reikšmės buvo apskaičiuotos naudojant dvipusę ANOVA ir Sidako post hoc analizę, kur * p < 0.05

3.3. Didelis neutralizuojančių antikūnų kiekis, kurį sukelia bendrai imunizacija pS ir pN vakcinomis

Serijiniu būdu praskiestų serumo mėginių neutralizuojantys titrai buvo nustatyti naudojant pseudotipo SARS-CoV-2 virusą. Didžiausias neutralizuojančių antikūnų (nAb) kiekis buvo pastebėtas pS + pN grupėje, o abipusiai EC50 geometriniai titrai siekė 2988 (35 dieną) ir 3578 (56 dieną) (3C pav.). Panašūs rezultatai buvo pastebėti naudojant gyvo viruso mikroneutralizacijos (MN) tyrimą, kai nAb lygis pS + pN grupėje buvo didesnis nei S grupėje 56 ir 96 dienomis (p < 0,05; pav. 3D). Be to, nAb lygis pS + pN grupėje 56 dieną (antrasis padidinimas) buvo žymiai didesnis nei 35 dieną (p < 0,05; 3D pav.).

Kiekvienos vakcinos režimo neutralizuojantis aktyvumas prieš SARS-CoV-2 Omicron variantą buvo toliau nustatytas naudojant pseudotipo platformą ir serumo mėginius. Neutralizacijos profilis prieš Omicron virusą 35 ir 56 dienomis buvo panašus į prieš protėvių virusą (3E pav.), o tai rodo, kad gydymas PS + pN turėjo kryžminį neutralizuojantį poveikį.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

3.4. T-ląstelių atsakas, sukeltas DNR vakcinacijos

Kaip aprašyta anksčiau, T-ląstelių atsakas prieš SARS-CoV-2 S/N/E/M antigenus buvo įvertintas naudojant IFN-ELISpot, kaip aprašyta anksčiau [15]. Kaip ir tikėtasi, ir PS + pN, ir pS + pE + pM režimai sukėlė žymiai didesnį IFN + T ląstelių, būdingų S baltymui, kiekį 12 dieną 0 nei 35 dieną (p < 0). 05; 4A pav.). Be to, IFN + T ląstelių, specifinių N baltymui, skaičius 120 dieną (antrasis padidinimas) buvo žymiai didesnis nei 35 dieną pS + pN grupėje (p < 0,05; 4B pav.). Galiausiai, IFN + T ląstelių, būdingų M baltymui, skaičius 120 dieną (antrasis padidinimas) buvo žymiai didesnis nei 35 dieną abiejose grupėse (p < 0,05; 4D pav.).

4 pav. T ląstelių atsakas į SARS-CoV-2 atskirus struktūrinius baltymus BALB/c pelėse. (A) T-ląstelių atsakas buvo išmatuotas naudojant IFN-ELISpot splenocituose, stimuliuotuose 20 h su persidengiančiais peptidų telkiniais, apimančiais SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, ir (D) M baltymai. Juostos rodo vidurkį ± SD. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant dvipusį ANOVA ir Sidako post hoc testą, kur * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 ir **** p < 0,0001.

3.5. Sinerginė apsauga, kurią sukelia bendra imunizacija pS/pN arba pS/pE/pM

Tada įvertinome DNR vakcinų apsauginį veiksmingumą naudojant hACE2 peles, imunizuotas po užkrėtimo protėviu SARS-CoV-2 virusu. Po iššūkio bandomosios grupės pelių svoris laipsniškai mažėjo. Priešingai, pelėms, imunizuotoms pS arba pS+, iškart po užsikrėtimo sumažėjo svoris, o po to atsigavo (5A pav.). Pelėse, paskiepytose pS, pS + pN arba pS + pE + pM, gyvo viruso neaptikta. Be to, vakcinacija pS + pN reikšmingai sumažino viruso RNR kopijų skaičių, palyginti su gautais skiepijant vien tik pS (p=0.0228; 5B pav.). Be to, plaučių histopatologija parodė, kad pelėms tiek imitacinėse, tiek pN grupėse buvo židinio uždegimo dėmės, pleuros invaginacija, alveolių kolapsas, didelis uždegiminių ląstelių infiltracijos lygis ir hemoraginės zonos. Palyginimui, pelėms, gydomoms pS + pN arba pS + pE + pM, buvo švelnesni histopatologiniai pokyčiai ir mažesni INHAND balai po užkrėtimo nei kitos grupės (5C pav.).

5 pav. Apsauginis imunizacijos veiksmingumas po užkrėtimo gyvu SARS-CoV-2 virusu. (A) Pelės buvo sveriamos kasdien (vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM), n=4) tris dienas po užkrėtimo. (B) Infekcinis SARS-CoV-2 titras plaučių homogenatuose trečią dieną po užkrėtimo, nustatytas naudojant TCID5{{10}} tyrimą ir RNR kopijos numerį. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp grupių buvo nustatyti naudojant vienpusę ANOVA, po kurios buvo atlikta daugkartinė Dunnett palyginimo korekcija (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ir **** p < 0,0001). (C) Plaučių histopatologinė analizė naudojant H&E dažymą.

4. Diskusija

Šiame tyrime bendrai imunizacija su dviem DNR vakcinomis, ekspresuojančiomis S ir N baltymus, sukėlė didelį nAb kiekį ir labai veiksmingai sumažino SARS-CoV-2 viruso kiekį pelėms. DNR vakcinos, ekspresuojančios S baltymą, padidino S baltymui būdingą ląstelių imuniteto lygį po trijų imunizacijų, kai pelės buvo imunizuotos kartu su N / E ir M baltymais, ir palengvino histopatologinius pokyčius po užkrėtimo. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita, atskleidžianti sinerginį pelių imuniteto ir apsaugos stiprinimą naudojant S baltymą koduojančią DNR vakciną, kai jos yra kartu imunizuojamos su DNR vakcinomis, koduojančiomis kitus SARS-CoV struktūrinius baltymus{{8 }}.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Keliuose tyrimuose buvo pastebėti imunodominuojantys B ląstelių epitopai N antigeno srityse. N pagrindu pagamintos vakcinos paprastai negali sukelti nAb, greičiausiai todėl, kad N baltymas nėra rodomas viruso paviršiuje. Pažymėtina, kad bendrai imunizacija su S ir N baltymais sukėlė didesnį nAb kiekį prieš protėvių ir Omicron SARS-CoV-2 virusą nei kitos grupės. Padidėjęs nAb atsakas yra susijęs su geresniu viruso klirensu ir apsauginiu veiksmingumu. Mūsų rezultatai parodė, kad gydymas pS + pN buvo veiksmingesnis nei gydymas vien pS, sumažinant SARS-CoV-2 viruso kiekį po užkrėtimo. Ankstesniame tyrime buvo pranešta, kad žiurkėnai, imunizuoti vakcina, kuri ekspresuoja kartu M ir N baltymus, buvo apsaugoti nuo didelio svorio netekimo ir plaučių patologijos, o po SARS-CoV{12}} viruso titrai burnos ertmėje ir plaučiuose sumažėjo. tai atitinka mūsų rezultatus [23]. Deja, viruso titrų sumažėjimo negalima priskirti M arba N baltymui, o nAb lygis šiame tyrime nebuvo įvertintas. Vienas SARS-CoV-2 mRNR vakcinos tyrimas parodė, kad S + N bendrai imunizacija sukėlė sustiprintą S specifinį CD8+ T-ląstelių atsaką ir neutralizuoja antikūnų aktyvumą, užtikrindama geresnę plaučių apsaugą nuo deltos. variantą, palyginti su vien S, o tai atitinka šio tyrimo rezultatus [24]. Kitas tyrimas parodė, kad užkrečiamojo gastroenterito koronaviruso N baltymas skatino neutralizuojančių antikūnų sintezę, kai kiaulių TGEV-IMMUNE ląstelės buvo stimuliuojamos S ir N baltymų deriniu in vitro, ir šis poveikis gali būti paaiškintas pagalbinių T-limfocitų atsaku į N baltymas [25].

Imunodominuojantys CD{0}}/CD8+ T-ląstelių epitopai N-antigeno regionuose buvo nustatyti anksčiau. Keli tyrimai parodė, kad vakcinos, pagrįstos SARS-CoV-2 N baltymu, veiksmingai sukelia ląstelių imuninį atsaką. S + N grupė parodė padidėjusį S baltymui būdingą ląstelių imunitetą po trijų imunizacijų. Vienas SARS-CoV-2 mRNR vakcinos tyrimas parodė, kad kombinatorinis S + N sukėlė padidintą S specifinį CD8+ T-ląstelių atsaką, palyginti su vien S, o tai atitinka mūsų rezultatus [24]. Kitas tyrimas parodė, kad T-ląstelių atsakas į S ir N antigenus po dviejų antigenų hAd5 S + N pirminės vakcinacijos buvo lygiavertis anksčiau SARS-CoV-2- infekuotų pacientų atsakams, ir T-ląstelių prognozavimo modeliai in silico. epitopo HLA surišimas rodo, kad T-ląstelių atsakas į hAd5 S + N vakciną išsaugos savo veiksmingumą prieš B.1.351 variantą. Be to, anksčiau SARS-CoV{28}}infekuotų pacientų plazmos afinitetas buvo didesnis su ląstelėmis, ekspresuojančiomis dvigubą antigeno S-Fusion + N-ETSD konstrukciją, nei tik su hAd5 S-Fusion, o tai dar labiau rodo, kad S+N dvigubo antigeno vakcina yra geresnė nei S vieno antigeno vakcina [26].

Gyvas virusas plaučiuose nebuvo aptiktas, o svorio kritimas po užkrėtimo buvo sumažintas pS, pS + pN ir pS + pE + pM grupėse, o gydymas pN veiksmingai nesumažino viruso titro. Šios išvados pabrėžia S baltymo, kaip vakcinos tikslo, būtinumą ir veiksmingumą. Pažymėtina, kad bendrai imunizacija su pS ir pN turėjo geresnį poveikį nei pS arba pN viruso klirensui. Grupė pS + pE + pM parodė mažiau histopatologinių pokyčių plaučiuose, o tai atitinka mūsų ankstesnio tyrimo rezultatus [15]. S + N grupėje buvo mažai virusinės RNR kopijų plaučiuose, sumažėjo svorio ir greitas atsigavimo laikas po SARS-CoV{11}}, palyginti su grupe, imunizuota vien S/N, o tai atitiko šio tyrimo rezultatus. Tačiau nė viena grupė neaptiko neutralizuojančių antikūnų titrų, o tai gali būti paaiškinta vakcinų įvairovės ir eksperimentinių gyvūnų skirtumais [26]. Vienas SARS-CoV-2 adenoviruso vektorinės vakcinos tyrimas parodė, kad S vakcina ūmiai apsaugo smegenis tik tada, kai buvo imunizuota kartu su N vakcina [27]. Kitame tyrime buvo sukurtos Tri: ChAd, Bi: ChAd ir Mono: ChAd vakcinos, ekspresuojančios atitinkamai S1/N/RdRp, N/RdRp ir S1 baltymus, ir buvo išbandytos B.1.351 gyvūnų modeliu. Plaučiuose Mono: ChAdlungs buvo pastebėta didelė patologija, o Bi: ChAd ir Tri: ChAd plaučiuose šios patologijos beveik nebuvo [28].

Be to, nevakcinuoti gyvūnai turėjo didelį plaučių virusų kiekį, o gydymas Tri: ChAd žymiai sumažino virusų kiekį 3, 5 žurnalo. Palyginimui, tiek Bi: ChAd, tiek Mono: ChAd vakcinos tik vidutiniškai sumažino viruso kiekį. Šie rezultatai rodo, kad S/N dvigubo antigeno vakcinos apsauginis poveikis nuo variantų gali būti geresnis nei S vieno antigeno vakcinos, o tai atitinka mūsų rezultatus [28]. Keli tyrimai parodė, kad N baltymu imunizuotoms pelėms po SARS-CoV infekcijos išsivysto sunkus plaučių uždegimas [29–31]. Ankstesni tyrimai taip pat pranešė, kad imunizacija adenovirusine vektorine vakcina, ekspresuojančia pelių hepatito viruso N baltymą, apsaugo peles nuo mirtinos infekcijos, o tai rodo, kad N baltymas gali sukurti apsauginį poveikį [32]. Be to, grupėje, kuri buvo imunizuota CRT/N DNR vakcina, po užkrėtimo viruso titras buvo žymiai sumažintas, o vakcinos virusas ekspresavo SARS-CoV N baltymą [33].

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Vienas S baltymo tyrimas parodė, kad kombinuota DNR/baltymų vakcina sukelia humoralinį ir ląstelinį imunitetą geriau nei vien DNR/baltymų vakcina [8]. Įrodyta, kad vakcinos, nukreiptos tik į S baltymą, veiksmingesnės saugant nuo lengvo ar vidutinio sunkumo COVID-19, kurį sukelia atsirandantys variantai. Konservuotų SARS-CoV-2 struktūrinių baltymų, įskaitant N/E/M baltymus, vaidmuo vertas dėmesio kuriant vakciną ir taikant vakciną, nes vakcinos sukeltas T-ląstelių atsakas prieš konservuotus epitopus paprastai neturi įtakos mutacijų. . Viename tyrime buvo pranešta, kad nuo SARS pasveikę pacientai (n=23), praėjus 17 metų po 2003 m. protrūkio, vis dar turėjo ilgalaikių atminties T ląstelių, reaguojančių į SARS-CoV N baltymą. {15}} N baltymas, toliau patvirtinantis N baltymo, kaip kryžminės apsaugos vakcinos taikinio, naudojimą [34]. Šis tyrimas parodė, kad pS/pN bendrai imunizacija buvo susijusi su didesniu nAb atsaku, geresniu viruso klirensu ir pagerėjusiu ląsteliniu imuniniu atsaku ir gali užtikrinti geresnę apsaugą po SARS-CoV{20}}, palyginti su vien pS. Be to, buvo įrodyta, kad SARS-CoV-2 variantai užkrečia daugelį gyvūnų rūšių, o kai kurie laukiniai gyvūnai ir naminiai gyvūnai perduodami tarp žmonių [7]. Taigi veterinarinei SARS-CoV{27}} vakcinai reikia skirti daugiau dėmesio. Be to, nanotechnologijos gali būti galinga priemonė optimizuojant vakcinas ir verta daugiau dėmesio [2].

Šis tyrimas turi keletą apribojimų. Pirma, mes stebėjome tik DNR vakcinos strategiją BALB / c pelėms, o būsimi tyrimai turėtų įvertinti šių vakcinų režimų imunogeninį poveikį kituose gyvūnų modeliuose. Antra, reikia atlikti papildomus tyrimus, kad būtų galima visiškai suprasti molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas sustiprintas nAb ir S specifinis CD8 T-ląstelių atsakas, kurį sukelia bendrai imunizacija naudojant S ir N baltymus, ir panaudoti šias žinias siekiant optimizuoti COVID{5}} vakcinos dizainas. Galiausiai, N baltymui specifinių antikūnų funkcija nusipelno tolesnio tyrimo.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Apibendrinant galima pasakyti, kad šiame tyrime buvo įvertintas bendro imunizacijos su SARS-CoV-2 S, N, E ir M baltymais imuninės apsaugos potencialas. Kai kurios vakcinos, nukreiptos tik į S baltymą, turi sumažintą apsauginį poveikį atsirandančioms padermėms. Mūsų rezultatai padės sukurti kryžmiškai reaktyvią COVID{5}} vakciną, skirtą kontroliuoti esamus ir naujus SARS-CoV-2 variantus ir užkirsti kelią galimai koronaviruso pandemijai.

Nuorodos

1. Zmievskaja, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petuhovas, A.; Rizvanovas, A.; Bulatov, E. CAR-T ląstelių terapijos taikymas ne tik onkologijoje: autoimuninės ligos ir virusinės infekcijos. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabaras, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; ir kt. Nanotechnologijos prieš naująjį koronavirusą (sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusas 2): diagnostika, gydymas, terapija ir ateities perspektyvos. Nanomedicina 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanetas, A.; Cauchemez, S. COVID{1}} bandos imunitetas: kur mes esame? Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Džejanatanas, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Milleris, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Imunologiniai aspektai, susiję su COVID{1}} vakcinos strategijomis. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaosas, A.; Rupertas, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG SARS-CoV{2}} genomo struktūrinė analizė ir žmogaus sąveikos prognozės. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Džeksonas, CB; Farzanas, M.; Chen, B.; Choe, H. SARS-CoV-2 patekimo į ląsteles mechanizmai. Nat. kun. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchezas, E.; Salvatori, E.; Lionas, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Mužis, A.; Roscilli, G.; ir kt. Linijinės DNR vakcinos kandidatas, koduojantis SARS-CoV-2 receptorių surišimo domeną, sukelia stiprų imuninį atsaką ir neutralizuojančius antikūnus naminėms katėms. Mol. Ten. Metodai Clin. Dev. 2023 m. [CrossRef]

8. Borgojakova, MB; Karpenko, LI; Merkuljeva, IA; Ščerbakovas, D. N.; Rudometovas, AP; Starostina, EV; Šanšinas, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; ir kt. DNR/baltymų kombinuotos vakcinos nuo COVID imunogeniškumas-19. Bull. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Linas, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tangas, H.; Zhang, X.; Tianas, F.; ir kt. Žiedinės RNR vakcinos nuo SARS-CoV-2 ir naujų variantų. Ląstelė 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edvardsas, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; ir kt. SARS-CoV-2 mRNR vakcinos dizainas, įgalintas prototipo paruošimu patogenams. Gamta 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tianas, JH; Patelis, N.; Hauptas, R.; Zhou, H.; Westonas, S.; Hamondas, H.; Logue, J.; Portnoffas, A.; Nortonas, J.; Guebre-Xabier, M.; ir kt. SARS-CoV-2 glikoproteinų vakcinos kandidato NVX-CoV2373 imunogeniškumas babuinams ir apsauga pelėms. Nat. Komun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abdiento, V.; Benincasa, L.; ir kt. Hibridinis imunitetas pagerina B ląsteles ir antikūnus prieš SARS-CoV-2 variantus. Gamta 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammadas, T.; Fatima, U.; Singhas, IK; Singhas, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasanas, GM; Hassan, MI Įžvalgos apie SARS-CoV-2 genomą, struktūrą, evoliuciją, patogenezę ir gydymo būdus: struktūrinės genomikos metodas. Biochim. Biofizė. Acta Mol. Pagrindas. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Indijos naujoji COVID{1}} DNR vakcina paaugliams ir suaugusiems yra pirmoji. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Dengas, Y.; Huangas, B.; Han, D.; Wang, W.; Huangas, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; ir kt. DNR vakcinos, ekspresuojančios voką ir membranos baltymus, suteikia dalinę apsaugą nuo SARS-CoV-2 pelėms. Priekyje. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patelis, A.; Maslow, JN; Morrow, parlamentaras; Silvestras, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amantė, D.; Racine, T.; ir kt. Intraderminė SynCon®Ebola GP DNR vakcina yra stabili temperatūra ir saugiai rodo ląstelių ir humoralinio imunogeniškumo pranašumus sveikiems savanoriams. J. Užkrėsti. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smithas, TRF; Patelis, A.; Ramosas, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walkeris, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; ir kt. Kandidatės į DNR vakciną nuo COVID-19 imunogeniškumas. Nat. Komun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Dengas, Y.; Niu, P.; Daina, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huangas, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; ir kt. Bendra imunizacija su CHIKV VLP ir DNR vakcinomis pelėms sukelia daug žadantį humoralinį atsaką. Priekinis imunolis. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guanas, J.; Dengas, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Pradėjimas dviem DNR vakcinomis, ekspresuojančiomis hepatito C viruso NS3 baltymą, nukreiptą į dendritines ląsteles, pelėms sukelia puikų heterologinį apsauginį potencialą. Arch. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Dengas, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guanas, J.; Ruanas, L.; Tan, W. Sustiprintas DNR imunizacijos ir in vivo elektroporacijos poveikis hepatito B viruso šerdies-PreS1 ir S-PreS1 plazmidžių deriniu. Clin. Vakcina Imunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Dengas, Y.; Huangas, B.; Huangas, L.; Linas, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Žanas, Z.; ir kt. Šerdies apvalkalo struktūra COVID-19 mRNR vakcina, pasižyminti palankiu biologinio pasiskirstymo modeliu ir daug žadančiu imunitetu. Signalo perdavimas. Taikinys ten. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huangas, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Dengas, Y.; Tan, W. Pseudotipinės SARS-CoV-2 sistemos kūrimas ir efektyvumas, nustatytas neutralizavimo efektyvumo ir patekimo slopinimo testu in vitro. Biosaf. Sveikata 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooperis, SK; Bovenas, RA; Horwitz, MRA Replikuojanti bakterinė vektorinė vakcina, ekspresuojanti SARS-CoV-2 membranos ir nukleokapsidės baltymus, apsaugo nuo sunkios COVID{5}}panašios žiurkėnų ligos. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnikas, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tangas, J.; Zhong, C.; Adomas, A.; Šartonas, D.; Rafaelis, GH; Liu, Y.; ir kt. Kombinatorinė mRNR vakcinacija sustiprina apsaugą nuo SARS-CoV-2 delta varianto. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antonas, IM; Gonzálezas, S.; Bulido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveldas, JP; Enjuanes, L. Bendradarbiavimas tarp užkrečiamojo gastroenterito koronaviruso (TGEV) struktūrinių baltymų in vitro indukuojant virusui specifinius antikūnus. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynchas, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Siuvėjas, N.; Šaltis, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; ir kt. Vienkartinė imunizacija su rekombinantiniais ACAM2000 vakcinijos virusais, ekspresuojančiais smaigalį ir nukleokapsidės baltymus, apsaugo žiurkėnus nuo SARS-CoV{3}}sukeltos klinikinės ligos. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; klasė, J.; Dangi, T.; Richner, JM A SARS CoV-2 nukleokapsidinė vakcina apsaugo nuo distalinio viruso plitimo. BioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzokas, A.; Kangas, A.; Singhas, R.; Bavananthasivam, J.; Taip, G.; Luo, X.; ir kt. Naujos kartos COVID{2}} vakcinos į kvėpavimo takų gleivinę patekimas užtikrina tvirtą apsaugą nuo SARS-CoV-2 protėvių ir variantų. Ląstelė 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duanas, C.; Liangas, L.; Guo, H.; Xie, Q. Padidinta SARS-CoV nukleokapsidės baltymo ekspresija tabake ir jo imunogeniškumas pelėms. Vakcina 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatakė, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kasė, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hišima, T.; ir kt. Ankstesnė imunizacija su sunkiu ūminiu kvėpavimo sindromu (SARS) susijusiu koronaviruso (SARS-CoV) nukleokapsidės baltymu sukelia sunkią pneumoniją pelėms, užsikrėtusioms SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Demingas, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Simsas, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Marinuoti agurkai, R.; ir kt. Vakcinos veiksmingumas senstančiose pelėse, užkrėstose rekombinantiniais SARS-CoV turinčiais epidemijos ir zoonozinių spuogų variantais. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Greimas, F.; Horzinekas, MC; Rottier, PJ Pelės hepatito viruso smaigalys ir nukleokapsidės baltymai, išreikšti adenoviruso vektoriais, apsaugo peles nuo mirtinos infekcijos. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Pakabintas, CF; Pengas, S.; Rodenas, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Jis, L.; Chen, PJ; ir kt. DNR vakcinų, nukreiptų į sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso nukleokapsidės baltymą, generavimas ir apibūdinimas. J. Virolis. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Linas, M.; Tanas, N.; Linsteris, M.; ir kt. SARS-CoV-2-specifinis T ląstelių imunitetas COVID-19 ir SARS atvejais ir neužkrėstos kontrolės. Gamta 2020, 584, 457–462. [CrossRef]