Kraujagyslių chirurgijos pacientams, kurių neutrofilų ir limfocitų santykis yra padidėjęs, sumažėjo neutrofilų komplemento RNR ekspresija

Padidėjęs neutrofilų ir limfocitų santykis (NLR) pacientams, kuriems atliekama planinė kraujagyslių chirurgija (EVS), padidino mirtingumą, nepriklausomai nuo pooperacinių chirurginių rezultatų. Norėdami suprasti, kodėl didelis NLR yra susijęs su didesniu mirtingumu, ištyrėme neutrofilų ir limfocitų transkripto ekspresiją pacientams, kuriems atliekama EVS. Kraujo mėginiai buvo paimti iš pacientų, kuriems taikoma EVS, ir sveikų donorų, kad būtų galima apskaičiuoti NLR. RNR mėginiai buvo išskirti iš pacientų neutrofilų ir limfocitų ir suskirstyti į NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Įvadas

Širdies ir kraujagyslių ligos (ŠKL) yra pagrindinė mirties priežastis visame pasaulyje. Tai daugiausia lemia aterogenezė ir aterosklerozė, kurią, be individualios genetikos ir mitybos, lemia uždegiminiai ir imuniniai mechanizmai.1-3 Pastaruoju metu dėmesio centre atsidūrė diferencinis leukocitų (neutrofilų ir limfocitų) skaičius. prognozuoti širdies ir kraujagyslių sistemos (CV) rezultatus. Absoliutaus neutrofilų ir limfocitų skaičiaus santykis (NLR) buvo pripažintas kaip bendro mirtingumo prognozė atliekant kelis nedidelius ūminių koronarinių intervencijų, 4-6 hipertenzijos7,8 ir širdies nepakankamumo tyrimus.9

1 lentelė. Planinės kraujagyslių chirurgijos pacientų, tirtų RNR sek

Ankstesni tyrimai taip pat parodė, kad NLR yra pacientų, sergančių periferinėmis kraujagyslių ligomis, ilgalaikių baigčių prognozė.{1}} Šią išvadą patvirtina mūsų retrospektyvūs kraujagyslių chirurgijos pacientų populiacijų tyrimai. Viename tyrime, kuriame dalyvavo 108 pacientai, kuriems buvo planuota endovaskulinė pilvo aortos aneurizma, 30-dienos pooperacinis mirtingumas nesiskyrė tarp NLR<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 pacientų, 42,6 % insulto rizika) nei tie, kurių NLR yra<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] NLR grupės, atitinkamai).16 Pacientai, kurių priešoperacinis NLR buvo mažesnis, per 4-metų stebėjimą pasiekė žymiai didesnį išgyvenamumą be amputacijų (mažas NLR 65,5 %, vidutinis NLR, 37,5 % ir didelis NLR, 17,6 % [P < .0001]).16

Šiame tyrime atlikome neutrofilų ir limfocitų RNR sekos nustatymą (RNR-seq) iš pacientų, kuriems buvo atlikta planinė kraujagyslių chirurgija (EVS), kad nustatytų galimus padidėjusio NLR mechanizmus. Tyrimais buvo tiriama, ar yra padidėjęs NLR molekulinis pagrindas. Mūsų tyrimai atskleidė, kad pacientai, turintys padidėjusį NLR, kuriems buvo atliktas EVS atstatymas, išsiskiria labai reikšmingu imunoglobulino ir komplemento genų reguliavimu neutrofiluose.

cistanche nauda - stiprina imuninę sistemą

Metodai

Pacientai

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), rūkymo būklė, gydymas statinais, lėtinės obstrukcinės plaučių ligos, vėžio, lėtinės inkstų ligos, vainikinių arterijų ligos (CAD), periferinių arterijų ligos, smegenų kraujagyslių ligos ir lėtinio širdies nepakankamumo ligos istorija. Visiems pacientams buvo atliktas pilnas kraujo tyrimas su skirtingu baltųjų kraujo kūnelių skaičiumi. Pacientai buvo suskirstyti į žemą NLR (NLR_Low [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Kraujo atskyrimas

Visas kraujas (20 ml vienam pacientui) buvo paimtas į 10 ml talpos vakutainer mėgintuvėlius, antikoaguliuotus EDTA, ir kraujas buvo atskirtas per valandą nuo paėmimo. Neutrofilų ir limfocitų ląstelių populiacijos buvo išskirtos iš 8 ml kraujo naudojant EasySep tiesioginio žmogaus ląstelių izoliavimo rinkinius (STEMCELL Technologies, Vankuveris, Kanada) ir Big Easy EasySep magnetą (STEMCELL Technologies, Vankuveris, Kanada) pagal gamintojo protokolus. Prieš tai magnetas buvo atšaldytas ant ledo, o kraujo ląstelės ir reagentai buvo švelniai maišomi apverčiant mėgintuvėlį, o ne pipete. Reagentų santykis taip pat buvo pakoreguotas taip, kad būtų optimizuotas regeneravimas: prieš pirmąjį atskyrimą į kraują buvo įpilta 400 ml antikūnų mišinio, 400 ml magnetinių granulių ir 4 ml fosfatiniu buferiniu tirpalu, o po to - 200 ml antikūnų. mišinio ir 400 ml granulių prieš antrąjį atskyrimą ir 200 ml granulių prieš trečiąjį ir galutinį atskyrimą. Iš galutinių regeneravimo tūrių buvo paimta nedidelė 200 ml alikvotinė dalis ląstelių skaičiavimui ir stiklelio paruošimui. Likusi regeneravimo tūrio dalis buvo centrifuguojama 1000 apsisukimų per minutę greičiu 7 minutes, kad ląstelės būtų granuliuotos.

1 pav. Visas neutrofilų ir limfocitų RNR transkriptas, surinktas iš pacientų, kurių NLR yra didelis (NLR_High), mažas (NLR_Low) arba kontrolė (NLR_kontrolė) . „N“ arba „L“ raidžių kodas mėginio pavadinime reiškia, kad RNR šaltinis buvo neutrofilai arba limfocitai. Kiekvienoje kategorijoje buvo 6 pacientai. Mėlyna=sumažintas raiškos lygis; raudona=aukštas raiškos lygis.

Ląstelių skaičiavimas ir stiklelių paruošimas

Fosfatu buferiniame fiziologiniame tirpale resuspenduotos ląstelės toliau buvo padalytos į alikvotas, sumaišytos su tripano mėlyna ir rankiniu būdu suskaičiuotos naudojant hemocitometrą. Paprastai iš vieno mėginio buvo išskirta 9 × 106–15 × 106 neutrofilų ir 3 × 106–10 × 106 limfocitų. Išskirtų ląstelių stikleliai buvo paruošti naudojant citocentrifugą, sukami 600 apsisukimų per minutę greičiu 3 minutes, o po to nudažyti Wright-Giemsa dėme. Kiekvienos ląstelių populiacijos grynumas buvo nustatytas rankiniu būdu skaičiuojant, kai vienoje skaidrėje buvo išskirta mažiausiai 1000 ląstelių. Vidutinis neutrofilų ir limfocitų atskyrimo grynumas skaičiuojant ląsteles buvo atitinkamai 98,3% ir 96,2%. Srauto citometrija buvo atlikta 1 mėginio porai neutrofilų ir limfocitų ir parodė atitinkamai 90,6% ir 92,2% grynumą. Kitos neutrofilų preparato ląstelės buvo suskirstytos į limfocitus (4%), monocitus (2%), eozinofilus (2,3%) ir bazofilus (0,3%). Limfocitų preparate kitos ląstelės buvo neutrofilai (1,2%), monocitai (1,4%), eozinofilai (1,2%) ir bazofilai (1,8%). Visų atskirų mėginių masiniai RNR-seq duomenys taip pat buvo naudojami siekiant nustatyti ląstelių preparatų užterštumo monocitais mastą, nustatant, ar neutrofilai ar limfocitai iš NLR_didelio ar NLR_mažo mėginių CD14. , CD68, CD83 arba CD163. Nepriklausomai, RNR-seq duomenys buvo įvesti vertinant imuninių ir vėžio ląstelių (EPIC) proporciją – programą, skirtą įvertinti imuninių ir vėžio ląstelių dalį masiniuose genų ekspresijos duomenyse.17 Naudotą etaloninį profilį pateikė EPIC. kraujyje cirkuliuojančios imuninės ląstelės ir yra B ląstelių, CD4 ir CD8 T ląstelių, monocitų, neutrofilų ir natūralių žudikų ląstelių profilis. Pranešama išvestis pateikiama kaip mėginio ląstelių frakcijos.

2 pav. Žymiai skirtingai išreikšti neutrofilų ir limfocitų genai. (A) Žymiai skirtingai išreikštų genų skaičius neutrofiluose (mėlyna) ir limfocituose (oranžinė). (B) pagrindinių komponentų analizės grafikas, kuriame pateikiami reikšmingai skirtingai išreikšti genai neutrofiluose (žalia ir violetinė) ir limfocitai (raudona ir mėlyna) NLR_Aukštas (apskritimai) ir NLR_Žemas (kvadratai). (C) Žymiai skirtingai išreikštų genų iš NLR_Aukštos ir NLR_Mažai neutrofilų RNR šilumos žemėlapis. (D) Žymiai skirtingai išreikštų genų iš NLR_aukšto ir NLR_mažo limfocitų RNR šilumos žemėlapis.

RNR seka ir statistinė analizė

Išsamūs RNR ekstrahavimo ir sekos nustatymo metodai pateikti papildomuose metoduose. Sekos skaitymų kokybė buvo įvertinta, o adapteris buvo apkarpytas naudojant TrimGalore! („Babraham Institute“), „FastQC“ ir „CutAdapt“ įvyniojimo scenarijus. Nuskaitymai, praeinantys kokybės kontrolę, buvo suderinti su žmogaus etaloniniu genomu GRCh38, naudojant STAR lygintuvo programinę įrangą. Sulygiuoti rodmenys buvo apdoroti naudojant Cufflinks 2.2.1 versiją diferencinei ekspresijos analizei, naudojant GENCODE geno anotaciją GRCh38, o geno lygio ekspresijos duomenys buvo pateikti fragmentais, tenkančiais kilobazės nuorašu vienam milijonui nuskaitytų kartų.18 Labai skirtingai išreikšti genai buvo nustatyti naudojant klaidingą atradimo greičio ribinė P reikšmė<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Rezultatai

Paciento savybės

Iš 7 NLR_aukštų ir 9 NLR_žemų NLR buvo atrinktos šešios poros, remiantis aukščiausia poros RNR kokybe, įvertinta pagal RNR vientisumo skaičių (RIN) (1 lentelė). ). Taip pat buvo ištirtos šešios kontrolinės medžiagos iš 8 sveikų donorų. Į tyrimą įtrauktų pacientų vidutinis ± standartinis nuokrypis NLR pagal NLR_didelis buvo 4,37 ± 0,66, palyginti su NLR_Mažas, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Vidutinis ± standartinis pacientų amžiaus nuokrypis buvo 61,0 ± 17,0 metų, kai NLR_didelis, ir 64,5 ± 7,5 metų, kai NLR_mažas (P= ,68). Visi pacientai, išskyrus 1, sirgo aortos aneurizma, 9 – krūtinės ląstos/pilvo ląstos ir 2 – pilvo. Abu pacientai, sergantys pilvo aortos aneurizma, priklausė NLR{32}}žemai grupei. 11 iš 12 pacientų sirgo hipertenzija. Keturiems iš 6 pacientų abiejose NLR_didelio arba žemo NLR_grupėse buvo buvę lipidų sutrikimų. Keturi pacientai iš NLR_didelio ir 3 pacientai iš NLR_žemos grupės buvo buvę rūkaliai. Vienas NLR{40}}žemos grupės pacientas aktyviai rūkė. Penki pacientai iš NLR_didelio ir 4 NLR_žemo grupių pacientai vartojo statinus. Tik 3 pacientai abiejose grupėse sirgo cukriniu diabetu. Vienas pacientas kiekvienoje grupėje sirgo ŠKL, o 2 pacientai iš NLR{46}}žemos grupės sirgo periferinių arterijų liga.

3 pav. RNR-seq duomenys šiame tyrime buvo naudojami kaip nepriklausoma priemonė nustatyti kitokią ląstelių užterštumą neutrofilų ir limfocitų preparatuose. Rodomi tik neutrofilų duomenys. Buvo atlikta EPIC analizė, siekiant įvertinti imuninių ir vėžio ląstelių dalį masiniuose genų ekspresijos duomenyse. Ši analizė parodė neutrofilų, monocitų, B ląstelių, CD4 T ląstelių, CD8 T ląstelių, natūralių žudikų (NK) ląstelių ir kitų ląstelių procentą neutrofilų preparate.

Visas transkriptas

Mes stebėjome pasaulinius viso transkripto skirtumus, kai lyginame neutrofilų ir limfocitų genų ekspresijos profilius (1 pav.). Šis atradimas nenustebino, nes ląstelių tipui būdinga genų ekspresija anksčiau buvo apibūdinta kaip skirtinga.19 Neutrofilų skyriuje pacientams, kurių NLR_Aukštas, NLR_Žemas ir NLR{{ 4}}Kontrolės grupės, buvo daug sureguliuotų genų, kurie aiškiai nebuvo sureguliuoti limfocitų skyriuje ir atvirkščiai. Viso transkripto lygmenyje ląstelėms būdingi skirtumai tarp neutrofilų ir limfocitų buvo skirtingi ir dominuojantys, nepaisant NLR, paciento ar kontrolės. Tačiau atidžiau panagrinėjus ėmė ryškėti skirtumai. Pagrindinių komponentų analizės grafikas parodė, kad NLR_neutrofilų arba limfocitų kontrolė abiejose ląstelėse sutapo su NLR_aukštu ir NLR_mažu (1 papildomas paveikslas). Toliau tyrimais buvo siekiama rasti papildomų skirtumų tarp NLR{10}}Aukšto ir NLR_Žemo grupių reikšmingai skirtingai išreikštuose genuose. Pastebėta, kad 900 (74,5 %) reikšmingai skirtingai išreikštų genų buvo pastebėti neutrofiluose NLR_Aukštas vs NLR_Žemas grupėse (2A pav.). Palyginimui, limfocitai turėjo tik 190 (15,7%) reikšmingai skirtingai išreikštų genų. Pagrindinės NLR_Aukštų genų ir NLR_Žemų genų neutrofiluose ir limfocituose komponentų analizės diagrama atskleidė, kad NLR_Aukštų ir NLR_Žemų genų grupė neutrofilai išsiskyrė į 2 atskiras sritis, o NLR_didelio ir NLR_mažo limfocitų kiekio genai sutapo (2B pav.). Vėlgi, kaip ir su visais transkripto duomenimis, NLR_kontrolė sutapo su NRL_High ir NLR_Mažai reikšmingai skirtingai išreikštais genais tiek neutrofiluose, tiek limfocituose (2 papildomas paveikslas). Dauguma žymiai skirtingai išreikštų genų NLR_Daug neutrofilų buvo sumažėję nuo NLR_mažo (2C pav.). Panašus, bet daug mažesnis genų skaičius buvo sumažintas NLR{36}}daug limfocitų nei neutrofilų (2D pav.). Šie duomenys rodo, kad NLR lygiai dažniausiai buvo susiję su pakitusia genų ekspresija neutrofiluose. Be to, ją reikėjo palyginti su pacientais, priklausančiais ligos grupei NLR_Mažas, o ne NLR-Control, nes ankstesnė grupė aiškiai atsiskyrė nuo NLR_Aukštos, bet ne NLR_kontrolės ( 2B paveikslas; papildomas 2 paveikslas).

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Prieš tiriant skirtingą genų ekspresiją ir genų rinkinio praturtėjimą, papildomi tyrimai apibūdino monocitų užterštumo laipsnį neutrofilų preparate. Naudodamiesi RNR-seq duomenimis, pastebėjome, kad monocitų žymenų CD14, CD68, CD83 ir CD163 ekspresija NLR_Aukštas ir NLR_Mažas neutrofilų ar limfocitų preparatuose reikšmingai nesiskyrė. Neutrofilų RNR-seq duomenų EPIC analizė parodė, kad neimuninės ląstelės ("kitos ląstelės") ir CD4 T ląstelės buvo pagrindiniai neutrofilų preparatų teršalai (3 pav.). Išskyrus NLR{{10}}Mažas CD4 T ląsteles ir B ląsteles, nė viena iš kitų užteršiančių ląstelių NLR_Mažas neutrofilų skaičius ir NLR{13}}Didelis neutrofilų skaičius nesiskyrė. . Neutrofilų preparate monocitų užterštumas pagal EPIC analizę buvo tik 0,17 % ± 0.05 % NLR_Mažas, palyginti su 0,1 % ± 0,033 % NLR_Didelis pasirengimas (P=.12). Ši vertė rodo, kad monocitų užterštumas buvo daug mažesnis, kai jis buvo nustatytas naudojant RNR-seq duomenų analizę, palyginti su srauto citometrija.

4 pav. Žymiai išreikštų GO genų rinkinių kategorijų, skirtų biologiniams procesams tarp NLR_aukštos ir NLR_žemos, sklaidos burbulo diagrama. K: K santykis ant abscisės yra genų, kurie yra žymiai skirtingai išreikšti, skaičius (k), palyginti su bendru genų skaičiumi kategorijoje (K). Ordinatė yra sodrinimo reikšmė, išreikšta logaritmiu (P vertė). (A) GO genų rinkiniai, gauti iš neutrofilų RNR-seq, lyginant NLR_aukštą ir NLR_žemą. (B) GO genų rinkiniai, gauti iš limfocitų RNR sek. Apatiniame kairiajame abiejų sklypų kampe esantys genų rinkiniai yra mažiausiai reikšmingi. Genų rinkiniai abiejų sklypų viršutiniame dešiniajame kampe yra reikšmingiausi.

4 pav (tęsinys)

Norėdami ištirti skirtingai išreikštų genų pobūdį, atlikome GSEA su genų ontologijos (GO) kategorijomis biologiniams procesams, naudodami žymiai skirtingai išreikštus genų rinkinius tarp NLR_High ir NLR_Low. Rezultatai rodomi sklaidos burbulų diagramose (4 pav.). Genų rinkinių atskyrimas viršutiniame dešiniajame kiekvieno sklypo kampe rodo (1) didelį genų rinkinių genų procentą, kurie yra reikšmingai pakeisti, ir (2) didelę reikšmę genų rinkinio praturtinimui. Mūsų pavyzdyje sklaidos burbulų diagramos parodė tiek komplemento, tiek humoralinio atsako GO kategorijų praturtėjimą nepriklausomai tiek neutrofilams, tiek limfocitams. Neutrofiluose genų rinkiniai, skirti klasikiniam komplemento aktyvinimo būdui, baltymų aktyvavimo kaskados reguliavimui ir humoraliniam imuniniam atsakui, kurį sąlygoja cirkuliuojantis imunoglobulinas, buvo reikšmingiausi, o didžiausias genų rinkinio narių procentas reikšmingai pasikeitė (4A pav.). Nepriklausomai, taip pat buvo pastebėta, kad identiški limfocitų genų rinkiniai turi didelį reikšmingai pakitusių genų santykį ir reikšmingumo laipsnį, kaip ir neutrofilų tyrimuose (4B pav.).

2 lentelė. Imunologijos genų rinkiniai neutrofiluose ir limfocituose

2 lentelėje pateikiami reikšmingiausiai pasikeitę imunologijos genų rinkiniai neutrofiluose (2 lentelė, A skydelis) ir limfocituose (2 lentelė, B skydelis). Šis tyrimas palygino genų ekspresiją neutrofiluose arba limfocituose tarp NLR_didelių mėginių ir NLR_mažų mėginių. Sveiki NLR_kontroliniai mėginiai nebuvo lyginami, nes jų ekspresijos lygiai sutapo su NLR_aukštu ir NLR_mažu pacientų mėginiais tiek visame transkripte, tiek reikšmingai skirtingai išreikštuose genų rinkiniuose. Be to, sveiki NLR{8}}kontroliniai mėginiai neatitiko amžiaus, ligos ir chirurginės būklės (papildomi 1 ir 2 paveikslai). Tiek neutrofilų (2 lentelė), tiek limfocitų (2 lentelė) duomenys parodė, kad su imunine sistema susijusių genų rinkinių ekspresija labai skyrėsi, kai NLR_Aukštas buvo lyginamas su NLR_Žema. . RNR sekoje kiekvienas ląstelių tipas turi tokias pačias išvadas kaip ir kitas ląstelių tipas. Abiejose plokštėse pagrindinių genų rinkinių reikšmingumo lygiai buvo maksimaliai padidinami esant P < 1E-24. Šie duomenys buvo labai reikšmingi, nepaisant to, ar buvo tiriamas neutrofilas, ar limfocitai. Siekiant sutelkti dėmesį į labai reikšmingą šio RNR-seq tyrimo turinio sritį, buvo ištirta reikšmingai skirtingai išreikšta imunoglobulino geno ekspresija. Pirma, pagrindinių neutrofilų genų komponentų analizės grafikas parodė, kad NLR_Aukštas ir NLR_Žemas, reikšmingai skirtingai išreikšti imunoglobulino genai buvo suskirstyti į 2 grupes (papildomas 3A paveikslas). Arba limfocitų genai NLR_High vs NLR_Low over lapped (papildomas 3A pav.). Tada buvo lyginamas kombinuotas su imunitetu susijusių genų ekspresijos šilumos žemėlapis tarp NLR_High ir NLR_Low neutrofiluose ir limfocituose (5 pav.). Apskritai, išnagrinėjus visą šilumos žemėlapį, akivaizdus visos imunoglobulinų genų šeimos reguliavimas neutrofilų NLR_Didelė grupėje, palyginti su NLR_Žemu. Dauguma genų (69/156, 44%) buvo susiję su imunoglobulinu. Tik 12 iš 156 (7,7 %) genų buvo susiję su komplementu: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD ir CD59. Limfocitų grupėje taip pat buvo sumažėjęs daugiausiai imunoglobulino genų, priklausančių NLR{50}}aukštai kategorijai.

Komplemento genų rinkiniai neutrofiluose ir limfocituose išsamiai aprašyti 3 lentelėje. Tiek neutrofiluose (3 lentelė), tiek limfocituose (3 lentelė) genų ekspresija 3 genų rinkiniuose, susijusiuose su komplemento sistema, labai reikšmingai skyrėsi (P < 1E{{ 5}}), kai NLR_Aukštos imtys buvo palygintos su NLR_Mažais mėginiais. Šis stebėjimas buvo toks pat, nesvarbu, ar buvo lyginama neutrofilų ar limfocitų RNR. 3 genų rinkiniai apima komplemento aktyvavimą, komplemento aktyvinimo klasikinį kelią ir komplemento aktyvacijos reguliavimą. Neutrofilų genų pagrindinių komponentų analizės grafikas dar kartą parodė, kad NLR_High vs NLR_Low, žymiai skirtingai išreikšti komplemento genai buvo suskirstyti į 2 grupes (papildomas 3B paveikslas). Arba limfocitų genai NLR_High vs NLR_Mažai sutampa (papildomas 3B paveikslas).

5 pav. Žymiai skirtingai išreikštų genų šilumos žemėlapis imunoglobulino geno rinkinyje neutrofiluose (kairėje) ir limfocituose (dešinėje). Kiekvieno šilumos žemėlapio dešinėje išvardyti genai yra imunoglobulino nariai

Su komplementu susijusių genų rinkinio neutrofilų ir limfocitų ekspresijos šilumos žemėlapis, lyginant NLR_Aukštą su NLR_Žemu, parodytas 6 paveiksle. Neutrofiluose buvo sumažintas didžiulis genų skaičius. NLR_Didelis gyventojų skaičius. Šiame genų rinkinyje, panašiai kaip imunoglobulino genų rinkiniuose, dauguma genų (69/ 86, 80 %) buvo susiję su imunoglobulinu. Tik 12 iš 86 (14 %) buvo komplemento komponento ir reguliavimo genai (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH ir CFD). Apskritai limfocitų grupėje buvo mažiau komplemento genų ekspresijos, o imunoglobulino genai buvo šiek tiek mažiau reguliuojami NLR_aukšto lygio grupėje. Kadangi komplemento sistemos genai yra geriau suprantami, palyginti su imunoglobulino sistemų genais, dėmesys buvo sutelktas į komplemento sistemą kaip potencialų kandidatą į tikslinius genus, susijusius su dideliu ir mažu NLR. Buvo parengtas sudėtinis šilumos žemėlapis, kuriame lyginamas NLR_High su NLR_Low, parodantis komplemento sistemos ir susijusių genų ekspresiją tiek neutrofilų, tiek limfocitų mėginiuose (7 pav.). Daugeliu atvejų limfocitai nėra komplemento sistemos rezervuaro ląstelių sistema. Dauguma komplemento genų limfocituose nėra reguliuojami. Buvo tik C1S, CR2, C5, C8G, C5 ir CFB, kurių ekspresija skiriasi tarp NLR_didelio ir NLR_žemo limfocitų (7 pav.). Limfocituose esantis CD81 yra B ląstelių tetraspaninas. Atrodo, kad C1S ir C8G ekspresija limfocitų NLR_didesnė nei limfocitų NLR_Maža, panaši į KLKB1, plazmos prekallikreino geną.

Priešingai, neutrofiluose NLR{0}}High parodė komplemento komponento genų C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 ir C3AR1 bei jų komplementą reguliuojančių (slopinančių) genų CD59, CFB ir CFI reguliavimą. . Tik C2 ir CFD genai buvo reguliuojami pacientams, kurių NLR_didelis{13}}N. CD59 ir C9 neutrofilų NLR_Žemas_N yra santykinai reguliuojami, palyginti su NLR_Didelis{19}}N. FGFR4 yra augimo faktoriaus receptorius. CFH buvo, bet atrodė, kad neutrofilų NLR_didelis arba NLR_mažas jam įtakos neturėjo. Jis labiau išreikštas limfocituose.

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Diskusija

Diferencinio leukocitų skaičiaus NLR tapo plačiai naudojamu paprastu žymekliu, leidžiančiu atpažinti galimus žalingus įvairių sutrikimų padarinius, įskaitant CVD, solidinius navikus ir uždegiminius sutrikimus, tokius kaip sisteminė raudonoji vilkligė ir sisteminė sklerozė. Atlikdami retrospektyvius tyrimus su pacientais, sergančiais aterosklerozine ŠKL, pastebėjome, kad pacientų, kuriems yra didelis NLR, yra didesnis vėlyvas mirtingumas po planinio aortos aneurizmos atstatymo, didesnis vėlyvojo insulto / mirties dažnis po profilaktinės miego arterijos endarterektomijos ir mažesnis išgyvenamumas be amputacijos planinė šlaunikaulio-papačios revaskuliarizacija, jei jų NLR yra padidėjęs.{1}} Šie tyrimai buvo pradėti siekiant rasti mechaninį aukšto NLR pagrindą. limfoma, dauginiai solidiniai navikai ir uždegiminiai sutrikimai, tokie kaip sisteminė raudonoji vilkligė ir sisteminė sklerozė. Atlikdami retrospektyvius tyrimus su pacientais, sergančiais aterosklerozine ŠKL, pastebėjome, kad pacientų, kuriems yra didelis NLR, yra didesnis vėlyvas mirtingumas po planinio aortos aneurizmos atstatymo, didesnis vėlyvojo insulto / mirties dažnis po profilaktinės miego arterijos endarterektomijos ir mažesnis išgyvenamumas be amputacijos planinė šlaunikaulio-papakalės revaskuliarizacija, jei jų NLR yra padidėjęs.{3}} Šie tyrimai buvo pradėti siekiant rasti mechaninį aukšto NLR pagrindą.

3 lentelė. Komplemento genų rinkiniai neutrofiluose ir limfocituose

Norėdami sukurti nešališką požiūrį į NLR skirtingo poveikio CV rezultatams mechanizmą (-us), atlikome RNR seką tiek tų pačių pacientų neutrofilams, tiek limfocitams. Šiam tyrimui visi pacientai, sergantys aortos liga, buvo perspektyviai surinkti ir suskirstyti į NLR kategorijas pagal jų rezultatus. Paskutiniai 6 mėginiai kiekviename iš 2 ląstelių tipų buvo atrinkti pagal aukščiausią jų RIN lygį paruoštoje suporuotų neutrofilų ir limfocitų mėginių RNR, neatsižvelgiant į lytį, amžių ar ankstesnes sveikatos būklę. Kaip matyti iš 1 lentelės, pacientai, priklausantys NLR_aukštai ir žemai NLR_, buvo gana panašūs ir išsiskyrė tik pagal savo NLR.

Šiame tyrime naudotos RNR kokybę parodo RIN ir visiškas genų ekspresijos modelio tarp neutrofilų ir limfocitų atskyrimas visose surinktose pacientų grupėse (aukštas NLR, mažas NLR ir kontrolė) (1 pav.). Pagrindinių komponentų analizės grafikas rodo, kad NLR_kontrolės duomenys šiame tyrime buvo nereikšmingi, nes pacientų NLR sutapo su NLR_dideliu ir NLR_mažu pacientų neutrofilų ir limfocitų populiacijomis. . GSEA analizė suteikė puikią įžvalgą apie tai, kurie genų rinkiniai buvo praturtinti biologinių procesų GO genų rinkiniais, o sklaidos burbulo diagrama tai aiškiai parodė, nubrėždama loginę reikšmę ir pakeistų genų skaičiaus santykį su bendru genų skaičiumi. genų rinkiniuose. Peržiūrėjus, genų rinkiniai, kurie atsiskiria nuo viso sąrašo, buvo humoralinio (imunoglobulino) imuniteto ir komplemento sistemos genų rinkiniai (2 ir 3 lentelės), pagrįsti santykiu ir statistiniu reikšmingumu taikant nešališką atradimo metodą.

Sunku dirbti su dideliu humoralinio imuniteto imunoglobulino genų skaičiumi, nes svarbūs šių genų skirtumai nėra gerai žinomi. Arba daug daugiau žinoma apie komplemento sistemą, o dėmesys klasikinei komplemento sistemai, kurią aktyvuoja imunoglobulinas, yra atpažįstamas uždegimo ir su imunoglobulinais susijusių ligų taikinys. Mūsų duomenys rodo, kad klasikinių komplemento komponentų genai C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 ir keli reguliuojantys genai (CD59, CFB CFI ir CFH) yra sumažėję pacientų neutrofiluose. su dideliu NLR (7 pav.). Šios išvados stebina dėl 3 priežasčių. Pirma, dalyvaujantys genai dažniausiai yra klasikinio komplemento kelio. Antra, pacientams, sergantiems dideliu NLR, šie komplemento genai dažniausiai yra mažiau reguliuojami, palyginti su mažais NLR pacientais. Galiausiai daugiau F12 išreiškiama neutrofiluose iš NLR_didelio, nei iš NLR_mažų mėginių. F12 baltyminio produkto fermentinės formos (XII faktorius [FXII]) suaktyvina klasikinį komplemento ir neutrofilų kelią.20 Priešingai, PLG, plazminogeno genas ir FXII aktyvatorius, yra sumažintas limfocitų ir neutrofilų iš pacientų, esančių NLR{ {21}}Didelis, o tai rodo, kad pats FXII aktyvinimas gali būti komplemento aktyvinimo reguliatorius.

Be to, buvo įrodyta, kad klasikinė komplemento sistema yra susijusi su pagreitėjusiu CVD. Komplemento komponentas 1q (C1q) yra pradinis komplemento kelio veiksnys, kuris atlieka svarbų vaidmenį tiek įgimtoje, tiek įgytoje imuninėje sistemoje.21 Įrodyta, kad C1q atlieka dvejopą vaidmenį – teigiamą ir neigiamą poveikį aterosklerozei.22 Klasikinėje Komplemento kelias, C1q atlieka apsauginį vaidmenį sergant ankstyvos stadijos ateroskleroze, reguliuodamas makrofagų molekulinį signalą nuo komplemento nepriklausomu keliu, moduliuodamas aterogeninių lipoproteinų įsisavinimą, tarpininkaudamas apoptozinėms ląstelėms ir ląstelių nuolaužų pašalinimui.23,24 Neseniai atliktas Jia tyrimas. et al23 rodo, kad sumažėjęs C1q serumas yra susijęs su CAD. Kitas Guo ir kt. tyrimas24 rodo, kad padidėjęs C1q aktyvumas yra susijęs su CAD. Galiausiai, naujausi tyrimai rodo, kad cukriniu diabetu sergančių pacientų, kurių C1q yra sumažėjęs, išgyvenamumas sutrumpėjo.25 Šie duomenys rodo, kad komplemento sistemos tyrimas gali būti svarbus siekiant suprasti uždegimo sukeltą ŠKL patogenezę.

6 pav. Žymiai skirtingai išreikštų genų šilumos žemėlapis komplemento geno rinkinyje neutrofiluose (kairėje) ir limfocituose (dešinėje). Kiekvieno šilumos žemėlapio dešinėje išvardyti genai yra komplemento genų rinkinio nariai. RNR yra iš neutrofilų arba limfocitų, surinktų iš pacientų, kurių NLR yra didelis (NLR_High) arba mažas (NLR_Low) NLR. Šeši atskiri mėginiai iš NLR_High lyginami su 6 atskirais NLR_Low mėginiais iš neutrofilų ir limfocitų.

7 pav. Sudėtinis komplemento ir susijusių genų šilumos žemėlapis iš neutrofilų arba limfocitų NLR_Didelis arba NLR_Žemas. Kiekvienoje kategorijoje sudėtinis šilumos žemėlapis buvo paruoštas iš 6 atskirų RNR-seq mėginių iš kiekvieno ląstelių tipo.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Nors lipidų kiekio mažinimas neturėjo įtakos NLR, priešuždegiminis gydymas kanakinumabu, interleukino 1 inhibitoriumi, sumažino NLR (P < 0,0001).26 Šie duomenys rodo, kad NLR gali būti ŠKL žymuo, nepriklausomas nuo lipidų ir statinų įtaka. Ši kelių perspektyvių atsitiktinių imčių tyrimų ad hoc analizė rodo, kad NLR gali būti nepriklausomas mirštamumo nuo ŠKL rizikos veiksnys.

Šiame tyrime yra tam tikrų apribojimų. Mūsų neutrofilų preparatai turėjo 4% limfocitų ir 2% monocitų užterštumą srauto citometrijos būdu. Kadangi nežinoma, kad neutrofilai sintetina imunoglobuliną, neutrofilų imunoglobino geno pokyčius gali sukelti užterštos B ląstelės. Atlikus EPIC analizę, NLR-Low mėginių užterštumas B ląstelėmis labai padidėjo. Šis stebėjimas rodo, kad imunoglobulino genų lygio padidėjimas NLR_mažo neutrofilų mėginiuose gali atsirasti dėl B ląstelių užteršimo. Taigi, sumažėjęs imunoglobulino genų kiekis NLR_Daugiuose mėginiuose gali būti dėl padidėjusio B ląstelių kiekio NLR_Mažai mėginių ir nebūtinai sumažėjusio imunoglobulino genų kiekio NLR_dideliuose mėginiuose. Taip pat nežinoma, kad neutrofilai yra komplementą gaminančios ląstelės. Dviejų procentų užterštumas monocitais gali būti komplemento genų šaltinis. Tačiau naudodamiesi RNR seq duomenimis, pastebėjome, kad NLR_Mažas ir NLR{11}}Aukštas neutrofilų preparatų užterštumas monocitais reikšmingai nesiskiria. Be to, atlikus RNR-seq duomenų EPIC analizę, paaiškėjo, kad buvo užterštas monocitais<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Apibendrinant galima pasakyti, kad esminė šio tyrimo išvada yra ta, kad esant didelėms NLR būsenoms, daugelis komplemento komponentų genų ir kai kurių jų reguliatorių yra sumažėję neutrofiluose. Neaišku, kokia bendra identifikuotų žemyn reguliuojamų komplemento genų reikšmė ir aktyvacijos būsena. Kadangi komplemento genų rinkiniai yra labai sumažėję, spėjame, kad asmenys, kurių NLR _didelis ir trumpesnis pooperacinis išgyvenamumas, praranda pagrindinius CV apsauginius mechanizmus, kuriuos užtikrina komplemento sistemos. Šis įvertinimas turi būti perspektyviai išnagrinėtas atliekant klinikinius tyrimus, siekiant nustatyti pagrindinį (-ius) šio rezultato mechanizmą (-us).

Nuorodos

1. Ross R. Aterosklerozė – uždegiminė liga. N Engl J Med. 1999; 340(2):115-126.

2. Getz GS. Teminė apžvalgų serija: imuninė sistema ir aterogenezė. Imuninė funkcija aterogenezėje. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Imuninė sistema sergant ateroskleroze. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Padidėjusio neutrofilų ir limfocitų santykio naudingumas prognozuojant ilgalaikį mirtingumą po perkutaninės koronarinės intervencijos. Esu J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Ryšys tarp neutrofilų ir limfocitų santykio ir baigčių pacientams, sergantiems ūminiu koronariniu sindromu. Esu J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH ir kt. Priešoperacinis neutrofilų ir limfocitų santykis ir vainikinių arterijų šuntavimo rezultatas. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S ir kt. Lyginamasis nebivololio ir metoprololio poveikis eritrocitų pasiskirstymo pločiui ir neutrofilų / limfocitų santykiui pacientams, kuriems naujai diagnozuota pirminė hipertenzija. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA ir kt. Lyginamasis valsartano ir amlodipino poveikis vWf lygiui ir N/L santykiui pacientams, kuriems naujai diagnozuota hipertenzija. Clin Exp hipertenzija. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S ir kt. Neutrofilų ir limfocitų santykio naudingumas prognozuojant ilgalaikius ūminio dekompensuoto širdies nepakankamumo rezultatus. Esu J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Neutrofilų limfocitų santykis sergant periferinėmis kraujagyslių ligomis: apžvalga. Ekspertas Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Neutrofilų ir limfocitų santykis prognozuoja vidutinės trukmės išgyvenamumą po planinės didelės kraujagyslių operacijos: skerspjūvio tyrimas. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Neutrofilų ir limfocitų santykis numato perioperacinį mirtingumą po atviro planinio pilvo aortos aneurizmų taisymo. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Neutrofilų ir limfocitų santykis numato ligos sunkumą ir baigtį po apatinių galūnių procedūrų. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC ir kt. Padidėjęs neutrofilų ir limfocitų santykis prognozuoja mirtingumą po planinio endovaskulinės aneurizmos atstatymo. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S ir kt. Padidėjęs neutrofilų ir limfocitų santykis yra susijęs su blogesniais rezultatais po miego arterijos endarterektomijos besimptomiams pacientams. J Insultas Cerebrovosc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH ir kt. Padidėjęs neutrofilų ir limfocitų santykis yra susijęs su sumažėjusiu išgyvenimu be amputacijos po femoropopliteal perkutaninės revaskuliarizacijos. Tarpt. Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Vienalaikis vėžio ir imuninių ląstelių tipų surašymas iš masinių naviko genų ekspresijos duomenų. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L ir kt. RNA-seq eksperimentų su TopHat ir Cufflinks diferencinė genų ir transkripto ekspresijos analizė. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Ląstelių tipo specifiniai leukocitų genų ekspresijos profiliai žmogaus periferiniame kraujyje. BMC genomika. 2006; 7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL ir kt. XII faktorius ir uPAR reguliuoja neutrofilų funkcijas, kad paveiktų žaizdų gijimą. J Clin Invest. 2018; 128 (3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Dainų WC. Komplementas ir jo vaidmuo įgimtuose ir adaptyviuose imuniniuose atsakuose. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Komplementas sergant ateroskleroze: draugas ar priešas? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y ir kt. Klinikinis kombinuoto serumo C1q ir hsCRP vaidmuo prognozuojant vainikinių arterijų ligą. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Serumo komplemento C1q aktyvumas yra susijęs su obstrukcine vainikinių arterijų liga. Priekinė Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A ir kt. Komplemento C1q naudingumas prognozuojant 10-metų mirtingumą tarp vyrų, sergančių cukriniu diabetu, kuriems atlikta koronarinė angiografija. Esu J Cardiol. 2018; 122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM ir kt. Neutrofilų ir limfocitų santykis ir atsitiktiniai ateroskleroziniai reiškiniai: penkių šiuolaikinių atsitiktinių imčių tyrimų analizė. Eur Širdis J. 2021;42(9):896-903.