Terahercinė didelės skiriamosios gebos spektroskopija diabetinių ir nesergančių kraujo plazmos ir inkstų audinių granulių terminio skilimo dujų spektroskopija
Mar 28, 2022
Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstraktus
Reikšmė:Viena iš šiuolaikinių medicinos diagnostikos tendencijų yra pagrįsta metabolomika – metodu, leidžiančiu nustatyti metabolitus, kurie gali būti specifiniai ligos požymiai. Didelės skiriamosios gebos dujų spektroskopija leidžia ištirti dujų metabolitų kiekį biologinės kilmės mėginiuose. Pateikiame diabetinių ir nediabetinių biologinių mėginių, paruoštų granulių pavidalu, tyrimo metodo sukūrimą didelės raiškos terahercų (THz) spektroskopija.
Tikslas:Pagrindinė darbo idėja – ištirti diabetinių ir nediabetinių džiovintų produktų terminio skilimo dujų kiekį.kraujo plazmairinkstų audiniaiuž dujų žymenų rinkinį, kuris apibūdino diabetą THz didelės raiškos spektroskopijos metodu.
Metodas:Pateikiame metodą, kaip tirti sergančius diabetu ir nesergančiuskraujo plazma(žmonėms ir žiurkėms) irinkstų audiniai(žiurkėms), naudojant didelės skiriamosios gebos spektroskopiją, pagrįstą nestacionariu THz dažnių diapazono efektu. Sukurti kraujo ir inkstų audinių mėginių paruošimo granulėmis ir mėginių išgarinimo metodai.
Rezultatai:Garų sukimosi sugerties spektrų matavimai kaitinant granules, paruoštas iš kraujo irinkstų audinysbuvo atliekami nuo 118 iki 178 GHz dažnių diapazone. Buvo aptiktos ir identifikuotos sugerties linijos, atsirandančios mėginio garų spektruose. Terminio skilimo produktų molekuliniai kiekiai skyrėsi nediabetinių ir diabetinių mėginių; pvz., pagrindinis žymeklis yra acetonas, esantis diabeto (žmogaus ir žiurkių) kraujyje ir diabetu sergančių pacientų kraujyje.inkstų audinys.
Išvados: Straipsnyje iliustruojamas potencialus gebėjimas nustatyti metabolitų kiekį biologiniuose mėginiuose diagnostikos tikslais ir ligų prognozę klinikinei medicinai. © Autoriai. Paskelbė SPIE pagal Creative Commons Attribution 4.0 Neperkelta licencija. Norint platinti arba atgaminti visą ar iš dalies šį kūrinį, būtina visiškai priskirti originalų leidinį, įskaitant jo DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Raktiniai žodžiai: didelės skiriamosios gebos terahercinė spektroskopija; terminis skilimas; audinys;kraujo plazma; diabetas; liofilizavimas.
Raktiniai žodžiai:didelės skiriamosios gebos terahercinė spektroskopija; terminis skilimas; kraujo plazma; diabetas; liofilizacija, inkstų audinys.
1. Įvadas
Šiais laikais socialiai svarbių ligų (diabeto, vėžio ir kt.), įskaitant ankstyvosios stadijos, diagnostikos problema sulaukia didelio pasaulio mokslo grupių dėmesio.Vienas iš naujų požiūrių, atveriančių naujas galimybes įvairių ligų diagnostikoje ir gydyme, yra metabolomika. Metabolomika – mokslo sritis, tirianti biologinės sistemos (ląstelės, organų ar viso organizmo) galutinius ir tarpinius medžiagų apykaitos produktus. Metabolomika gali atskleisti metabolitus, kurie gali būti specifiniai ligos požymiai ir atlikti svarbų vaidmenį diagnozuojant ir prognozuojant ligą. Terpės, kuriose yra galutinių ir tarpinių medžiagų apykaitos produktų žmogaus organizme ir naudingos su ligomis bei patologijomis susijusiems metabolitams atskleisti, yra iškvepiamas kvėpavimas, kraujas, šlapimas, seilės ir kt.
Viena iš socialiai svarbių ligų, keliančių grėsmę žmonių gyvenimo kokybei, yra diabetas. 2 tipo cukrinis diabetas anksčiau buvo vidutinio amžiaus liga, o dabar diagnozuojamas suaugusiems, jauniems žmonėms ir vaikams. Žmogaus metabolizmo duomenų bazėje (HMDB) pateikiami cukriniu diabetu sergančių pacientų nuo 18 metų bei vaikų nuo 1 iki 13 metų kraujo ir šlapimo mėginių metabolominių tyrimų rezultatai.1 Daugiausia kraujas (21 cheminė medžiaga, įskaitant izomerus), šlapimas ( Ištirta 30 cheminių medžiagų, įskaitant izomerus, ir smegenų skystis (1 cheminė medžiaga). Pavyzdžiui, (R)-3-hidroksisviesto rūgštis buvo aptikta visų trijų tipų skysčiuose. Kai kurios medžiagos (acetoacto rūgštis, D-fruktozė ir D-gliukozė) buvo aptiktos abiejuose skysčiuose (kraujyje ir šlapime). Labiau būdingas diabeto požymis (acetonas, CH3COCH3) buvo tik šlapime. Skysčių mėginiai, tyrimų rezultatai pateikti HMDB, ištirti įvairiais metodais – dujų chromatografija; 2 dujų chromatografija su masės spektrometrija; 3,4 dujų ir skysčių chromatografija su masės spektrometrija; 5 didelės skiriamosios gebos branduolio spektroskopija. protonų magnetinis rezonansas;6 ir metodai, naudojant specialius prietaisus cukriniu diabetu sergančio paciento būklei stebėti, nuolatinę gliukozės kiekio stebėjimo sistemą.
Lėtinės inkstų ligos išsivystymas yra pagrindinė cukrinio diabeto komplikacija. Nors glikuoto albumino nustatymas yra įprastas atrankos metodas, inkstų pažeidimas gali prasidėti dar gerokai anksčiau nei atsiranda kliniškai reikšmingi šlapimo albumino pokyčiai. Atsižvelgiant į daugiafaktorinę lėtinės inkstų ligos patogenezę, jos atrankai buvo atsižvelgta į įvairius žymenis.8,9 Tačiau jų diagnostinė vertė be inkstų biopsijos pasirodė abejotina.
Spektroskopinis metodas gali suteikti informacijos apie biologinių mėginių turinį, kuris gali būti naudojamas medicininei diagnostikai. Terahercų (THz) dažnių diapazonas yra labai svarbus tiriant gyvų organizmų dujas, skysčius ir audinius. Yra keletas apžvalgų, skirtų THz dažnių diapazono metodų taikymui, įskaitant THz laiko srities spektroskopiją, THz reflektometriją ir THz vaizdavimą biologijos ir medicinos srityse.10
THz laiko srities spektroskopija leidžia aptikti spektrus, kuriuose absorbcijos koeficientas arba lūžio rodiklis turi tam tikrų spektrinių ypatybių, atitinkančių kai kurių biomolekulių (baltymų, cukrų ir kt.) buvimą mėginiuose arba įvairias jų koncentracijas.11
Molekulinės sugerties spektroskopija ir ypač THz dujų spektroskopija yra labai perspektyvus būdas tirti įvairios kilmės daugiakomponentinius dujų mišinius12. Skystos ir kietos būsenos mėginiai gali būti tiriami garuojant arba termiškai skaidant. Socialiai svarbių ligų (cukrinio diabeto, vėžio ir kt.) metabolitai – žymenys gali būti atskleisti pagal jo spektrines linijas absorbcijos spektruose, atliekamuose spinduliuotei perduodant per dujų mėginius.
Acetono lygis iškvepiamo kvėpavimo ir šlapimo mėginiuose, paimtuose iš diabetu sergančių pacientų (12 žmonių), buvo matuojamas naudojant terahercinį diapazono spektrometrą su veikiančios spinduliuotės fazės poslinkiu. Eksperimentai buvo atlikti bendradarbiaujant su Almazovo nacionaliniu medicinos tyrimų centru. Matavimai buvo atlikti acetono sugerties linijomis, kurių centriniai dažniai yra 150,537 ir 151,647 GHz. Matavimai atlikti be šildymo. Vienalaikis cukriniu diabetu sergančių pacientų iškvepiamo kvėpavimo ir šlapimo mėginių analizė parodė, kad acetono kiekis šlapime buvo daug didesnis nei iškvėptame, kai kuriais atvejais didesnis.13,14
THz didelės skiriamosios gebos dujų spektroskopijos tyrimų rezultataikraujo plazmapacientų ir žiurkių (sąlygiškai sveikų ir sergančių diabetu), taip pat žiurkiųinkstų audinys(sveiki ir sergantys cukriniu diabetu) pristatomi džiovinti ir presuoti iki granulių. Audiniai arbakraujo plazmagyvų organizmų, be jokio paruošimo, turi būti ištirti iš karto po mėginių paėmimo. Paruošimas granulėmis leidžia tirti praėjus pakankamai ilgai po kraujo paėmimo ar inkstų biopsijos.
2 Eksperimentai ir metodika
2.1 Kraujo plazmos granulių ir inkstų granulių paruošimo metodas
Nacionalinio Almazovo medicinos tyrimų centro Endokrinologijos skyriuje buvo paimtas II tipo cukriniu diabetu sergančių pacientų ir sąlyginai sveikų dalyvių veninis kraujas; centre teikiama medicininė pagalba diabetu sergantiems pacientams. Trys pacientai ir du dalyviai buvo vyrai, vienodo amžiaus (nuo 39 iki 43 metų). Visi šiame tyrime naudojami eksperimentiniai protokolai buvo peržiūrėti ir patvirtinti pacientų ir dalyvių bei Medicinos centro Naudojimo komisijos. Veninis kraujas buvo paimtas ryte po 8–12 valandų badavimo mėgintuvėlyje su antikoaguliantu K3EDTA (Vacutest Kima, Italija). Plazma buvo paimta biocheminiams parametrams analizuoti, centrifuguojant visą kraują 3000 aps./min. greičiu 15 min. laboratorinėje centrifugoje (Eppendorf 5702R, Vokietija) þ4 laipsnių temperatūroje. Biocheminių parametrų reikšmėskraujo plazmamėginiai ir atskaitos intervalai pateikti 1 lentelėje (glikuoto hemoglobino lygis nustatytas visame kraujyje). Iš 1 lentelės matyti, kad diabetu sergančio paciento mėginiuose gliukozės, trigliceridų ir glikuoto hemoglobino koncentracija padidėja atitinkamai 1,5, 2 ir 2,3 karto.
Remiantis Eksperimentinės medicinos instituto Almazovo nacionalinio medicinos tyrimų centro Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komisijos patvirtintu eksperimentinių tyrimų protokolu, tyrimas taip pat buvo atliktas su 8 savaičių amžiaus ir 180–200 g svorio Wistar žiurkių patinais. Gliukozės lygis eksperimentinės grupės gyvūnams buvo 21 mmol ∕ l po 120 minučių po gliukozės pakrovimo. Nepažeistos žiurkės buvo naudojamos kaip kontrolinė grupė. Veninis kraujas buvo paimtas iš apatinės tuščiosios venos prieš eutanaziją. Taip pat buvo paimtas inkstas. Kraujo mėginiai buvo paimti į mėgintuvėlius, kuriuose yra antikoaguliantų.
Bandomieji mėginiai buvo užšaldyti –80 laipsnių temperatūroje (žemos temperatūros šaldytuvas DW-86L388A, Haier, Kinija). Tada jis buvo liofilizuotas šaldant džiovinant Vaco 2 (ZirBus, Vokietija) esant –50 laipsnių temperatūrai ir 3 Pa slėgiui. Šaldymas atliekamas prieš liofilizavimą, nes liofilizacijos metu, veikiant aukštam vidiniam slėgiui, gali būti biologiniai komponentai. būti sunaikinti. Džiovinti mėginiai buvo kempinė, sudaryta iš biologinių kristalų. Kempinė buvo sunaikinta metaline mentele ir susmulkinta iki kelių dešimčių mikrometrų dydžio kristalų. Skiedinio ir grūstuvės naudojimas buvo neįmanomas, nes susmulkinus mėginių sudėtyje esančius baltymus, jie nepageidaujamai sukibtų ir susidarytų apvalios granulės.
Liofilizuoti mėginių milteliai buvo pasverti (analitiniai svarstyklės OHAUS Discovery, Šveicarija) ir sudėti į plieninę presavimo formą. Naudojant laboratorinius presus (Angkor, Rusija ir Specac, JK) esant tam tikram liejimo slėgiui,kraujo plazmabuvo gautos granulės ir inkstų granulės. Kiekviename granulių kristale yra tam tikras procentas riebalų (trigliceridų), baltymų (albumino) ir fibrinogeno - visi jie yra normalūs arba glikuoti (diabeto atveju). Kontrolinės grupės mėginių granulės toliau vadinamos "nesergančiomis diabetu granulėmis", o mėginių granulės išdiabeto grupė toliau vadinama "diabetine granule".
2,2 THz didelės raiškos spektroskopijos eksperimentinė sąranka
Didelės skiriamosios gebos THz spektroskopija, pagrįsta nestacionariais efektais, leidžia analizuoti dujų ir garų daugiakomponentių dujų mišinių komponentinę sudėtį. Spektrometrai užtikrina jautrumą, artimą teorinei ribai, o skiriamąją gebą riboja tik Doplerio efektas, ir gali įrašyti greitus procesus. Jautrumas išsaugomas net labai sumažėjus dujų slėgiui ir yra maždaug 0,2 ppb nuskaitymo režimu kai kurioms dujoms (pvz., amoniakui matuojant sugerties liniją, artimą 572 GHz dažniui). Be to, tai leidžia labai patikimai nustatyti dujų mišinio komponentinę sudėtį.12 Atliktas granulių terminio skilimo produktų tyrimas THz nestacionarios dujų spektroskopijos 118–178 GHz diapazone metodu. Spektrometras naudoja fazės užrakinimo kilpą automatiniam atgalinės bangos lempos dažnio ir fazės poslinkio valdymui, registracijai laiko srityje, vidurkiavimui ir spektroskopinio pereinamojo signalo apdorojimui. Įrenginys registruoja signalą laiko srityje. Mėginių garai buvo analizuojami naudojant tokią procedūrą. Granulės buvo dedamos į mėgintuvėlį, vakuuminiu siurbliu, palaipsniui kaitinamas mėgintuvėlis (iki 240 laipsnių) ir gautas mėginio terminio skilimo produktų mišinys įleidžiamas į matavimo kamerą. Duomenų faile paprastai yra pasirinkto arba viso spektrometro veikimo diapazono įrašai. Todėl medžiagas galima identifikuoti pagal absorbcijos linijas, atsirandančias bendrame mėginio spektre, o koncentracijų mišinyje dinamiką galima atsekti palyginus keletą duomenų rinkmenų. Medžiagos buvo identifikuotos ieškant jų atvirojo kodo MW, mmw ir THz duomenų bazėse.15,16
3 kraujo plazmos garų ir inkstų garų analizė naudojant didelės skiriamosios gebos terahercinį spektrometrą
Naudodami savo THz-TDS sistemas matavome granulių pralaidumą spektriniame diapazone nuo 0,2 iki 1,4 THz,17, tačiau žinome, kad biomolekulės ir ypač jų skilimo produktai dujinėje būsenoje turi informatyvų atsaką (sukimosi absorbcija). spektrai) šiais ir žemesniais dažniais, todėl atlikome papildomą tyrimą THz didelės skiriamosios gebos dujų spektrometru. Diabetu sergančio žmogaus aptiktos medžiagų absorbcijos linijoskraujo plazmasutampa su nesergančio žmogaus medžiagomiskraujo plazma, išskyrus acetoną. Spektrometro darbiniame dažnių diapazone (nuo 118 iki 178 GHz) yra daug acetono sugerties linijų. Paprastai pakanka aptikti kokią nors vienos medžiagos absorbcijos liniją, kad būtų galima vienareikšmiškai nustatyti medžiagos buvimą daugiakomponentiniame dujų mišinyje. Sugerties spektro dalių įrašymo su acetono sugerties linija pavyzdys parodytas 1 pav. Acetonas gali atsirasti kraujyje esant angliavandenių apykaitos sutrikimui. Kaip rašoma literatūroje, cukriniu diabetu sergančių pacientų kraujyje buvo -OH-butirato ir acetoacetato, tačiau vėliau šios medžiagos suskyla į acetoną ir anglies dioksidą.18 Anglies dioksidas neturi dipolio momento; todėl jis neturi sukimosi perėjimų. Padidėjęs jo kiekis gali būti aptiktas tik tiriant mėginio virpesių spektrą IR diapazone.
Plazmos garų medžiagos, tokios kaip karbonilo sulfidas (OCS), sieros dioksidas (SO2), skruzdžių rūgštis (HCOOH), izociano rūgštis (HNCO) ir amoniakas (NH3), buvo aptiktos tiek žmogaus diabetu sergančio, tiek nesergančio žmogaus mėginiuose. Kai kuriais atvejais mėginio spektruose aptinkama viena eksperimentinė linija, atitinkanti daugiau linijų nei vienai vienai medžiagai (pvz., izociano rūgščiai) katalogo duomenyse (žr. 2 lentelę).15,16
Tai paaiškinama tuo, kad kataloguose yra duomenų apie itin smulkias medžiagų struktūras, kurios šiame eksperimente neišspręstos, nes linijų plotis yra keli šimtai kHz. Gautos tirtų medžiagų sugerties linijos sutampa su kapiliarinio kraujo garų sugerties spektrais irkraujo plazmapacientų, sergančių cukriniu diabetu, ir sąlyginai sveikų dalyvių, kurie buvo publikuoti ankstesniame darbe.19 Aptiktos dujinės medžiagos galėjo susidaryti ruošiant mėginį kaip aminorūgščių cheminės transformacijos produktai. Reikia ištirti, ar šie junginiai turi diagnostinę vertę. Klinikinėje diabetologijos praktikoje šių medžiagų kiekio analizė dar netaikoma.
Garai iškraujo plazmasveikų žiurkių buvo karbonilo sulfido (OCS), metantiolio (CH3SH), butironitrilo (C3H7CN), acetaldehido (CH3CHO) ir skruzdžių rūgšties (HCOOH). Pavyzdys iškraujo plazmaDiabetu sergančių žiurkių skaičius skyrėsi pagal acetono buvimą. Be propionitrilo (C2H5CN) absorbcijos linijų, buvo aptiktas metilo formiatas (CH3OCHO).
Sveikų ir diabetu sergančių žiurkių džiovintų granulių garų mėginiaiinkstų audiniaibuvo tiriami. Garai išinkstų audinyssveikų žiurkių yra karbonilo sulfido (OCS), sieros dioksido (SO2), skruzdžių rūgšties (HCOOH), izociano rūgšties (HNCO), etilo formiato (C2H5OCHO) ir propilenglikolio (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Diabetinės žiurkės garų kiekisinkstų audinysnuo sveikos žiurkės skyrėsi ne tik karbonilo sulfido (OCS), bet ir jo izotopologo OCS-34 buvimu. Acetaldehidas (CH3CHO), metantiolis (CH3SH), etileno sulfidas (C2H4S), metanolis (CH3OH) ir glikolaldehidas (CH2ðOHÞCHO) taip pat buvo aptikta diabetinės žiurkės granulių garuose.inkstų audinys(žr. 2 pav. ir 3 pav.).
Sieros junginių, tokių kaip metantiolis, buvimą galima nurodyti terminiu sieros aminorūgščių (metionino, cisteino ir cistino) skaidymu kraujo baltymų sudėtyje. Metioninas yra nepakeičiama aminorūgštis, kuri nėra sintezuojama žmogaus organizme. Jis gaunamas iš maisto ir yra sieros šaltinis cisteino biosintezei. Kaitinant sieros aminorūgštis iki maždaug 240 laipsnių temperatūros, šių medžiagų masių spektre buvo aptiktas metantiolis ir etileno sulfidas (metionino skilimas).
4. Išvada
Žmogaus ir žiurkės molekulinis kiekiskraujo plazmair žiurkęinkstų audinysbandinių terminio skilimo metu buvo tiriamas naudojant THz didelės skiriamosios gebos spektrometrą. Pateiktas biologinių mėginių paruošimo granulėmis metodas. Šis metodas suteikia galimybę laikyti ir transportuoti mėginius. Didelės skiriamosios gebos dujų spektroskopija leidžia nustatyti bet kokios kilmės daugiakomponentių dujų mišinių, įskaitant ir biologinius, kiekį su dujų komponentų pėdsakų koncentracija. Acetonas buvo aptiktas sergant cukriniu diabetukraujo plazmapavyzdžiai. Informacija apie diabeto ir sveiko turinio skirtumąkraujo plazmavyrų ir žiurkių bei diabetu sergančių ir sveikų žiurkiųinkstų audiniaibuvo gautas iš garų sugerties sukimosi spektrų. Naudojant THz didelės skiriamosios gebos spektroskopiją, galima kokybiškai analizuoti komponentų kiekį kraujo garų mėginiuose irinkstų audiniaigranulės. Galimybė atlikti svarbių diabeto dujų žymenų koncentracijų kiekybinį įvertinimą, atsižvelgiant į paciento būklę.turėtų būti tiriami atliekant tolesnius tyrimus.
