Aksominio rago polipeptido senėjimą stabdantis poveikis priklauso nuo žarnyno mikrobiotos moduliacijos ir PPAR/APOE4 kelio reguliavimo 1 DALIS

Ištyrėme aksominio rago polipeptido senėjimą stabdantį poveikį D-galaktozės (D-gal) sukeltai senėjimo pelėms. D-gal sukeltos senstančios pelės buvo sukurtos ir atsitiktinai suskirstytos į penkias grupes: kontrolinę, modelio, vitamino E (VE), aksominio rago polipeptido mažos dozės ir aksominio rago polipeptido didelės dozės grupes. Morriso vandens labirinto testas buvo naudojamas senstančių pelių mokymosi ir atminties gebėjimams įvertinti. Hipokampo neuronai buvo stebimi naudojant hematoksilino-eozino dažymą ir perdavimo elektronų mikroskopiją. Biocheminiais metodais buvo nustatytas superoksido dismutazės, malonaldehido ir kitų fermentų aktyvumas bei įvertinta aksominio rago polipeptido įtaka senstančių pelių antioksidaciniam gebėjimui. Naudodami 16S rRNR genų sekos nustatymo ir meristemų technologiją, įvertinome aksominio rago polipeptido poveikį senstančių pelių žarnyno florai ir riebalų rūgščių metabolizmui. Eksperimentiniai rezultatai parodė, kad aksominio rago polipeptidas gali žymiai pagerinti senstančių pelių mokymosi ir pažinimo gebėjimus bei padidinti superoksido dismutazės, glutationo peroksidazės ir katalazės aktyvumą serume, kad sumažėtų malonaldehido kiekis. Žarnyno mikroekologinė analizė parodė, kad aksominio rago polipeptidas gali žymiai padidinti naudingų bakterijų genties laktobacilų gausą. Western blot analizė taip pat parodė, kad aksominio rago polipeptidas gali skatinti riebalų rūgščių metabolizmą, aktyvindamas peroksisomų proliferatoriaus aktyvuojamą receptorių (PPAR) ir padidindamas pasroviui esančių fermentų karnitino-palmitoiltransferazės -1 A ir acil-CoA oksidazės 1 ekspresiją, tuo pačiu sumažindamas reguliavimą. apolipoproteino E4 (APOE4), taip sumažinant riebalų rūgščių kaupimąsi ir padidinant adenozino trifosfato (ATP) gamybą. Todėl aksominio rago polipeptidas pagerina žarnyno mikroekologiją ir aktyvina PPAR / APOE4 kelią, reguliuojantį riebalų rūgščių metabolizmą.

Cistanche glikozidas taip pat gali padidinti SOD aktyvumą širdies ir kepenų audiniuose ir žymiai sumažinti lipofuscino ir MDA kiekį kiekviename audinyje, efektyviai pašalindamas įvairius reaktyvius deguonies radikalus (OH-, H2O₂ ir kt.) ir apsaugodamas nuo DNR pažeidimo. OH-radikalais. Cistanche feniletanoidiniai glikozidai pasižymi stipriu laisvųjų radikalų šalinimo gebėjimu, didesne redukcine galia nei vitaminas C, pagerina SOD aktyvumą spermos suspensijoje, mažina MDA kiekį ir turi tam tikrą apsauginį poveikį spermos membranos funkcijai. Cistanche polisacharidai gali sustiprinti SOD ir GSH-Px aktyvumą eksperimentiškai senstančių pelių eritrocituose ir plaučių audiniuose, kuriuos sukelia D-galaktozė, taip pat sumažinti MDA ir kolageno kiekį plaučiuose ir plazmoje bei padidinti elastino kiekį. geras sugeriantis poveikis DPPH, pailgina senstančių pelių hipoksijos laiką, pagerina SOD aktyvumą serume ir lėtina fiziologinę plaučių degeneraciją eksperimentiškai senstančiose pelėse Dėl ląstelių morfologinės degeneracijos, eksperimentai parodė, kad Cistanche pasižymi geru antioksidaciniu gebėjimu. ir gali būti vaistas, skirtas odos senėjimo ligų prevencijai ir gydymui. Tuo pačiu metu Cistanche esantis echinakozidas turi didelį gebėjimą sunaikinti DPPH laisvuosius radikalus ir geba pašalinti reaktyviąsias deguonies rūšis ir užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeltam kolageno skaidymui, taip pat turi gerą atkuriamąjį poveikį timino laisvųjų radikalų anijonų pažeidimams.

Spustelėkite Cong Rong Cistanche

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Raktažodžiai

Aksominio rago polipeptidas; D-galaktozė; Senėjimas; Žarnyno mikroekologija; Mokymasis; Kognityvinis sutrikimas; PPAR /APOE4 kelias; Mikrobiota

1. Įvadas

Aksominio rago polipeptidas (VAP) sudaro 50–60 procentų šlapio aksominio rago svorio ir yra viena iš pagrindinių jo veikliųjų medžiagų [1]. VAP yra daug baltymų, amino rūgščių, fosfolipidų, cholesterolio ir kalcio jonų ir daro įvairius sveikatą stiprinančius poveikius, įskaitant antioksidantus [2], atsparumą osteoporozei [3] ir imuninės sistemos reguliavimo [4] poveikį. Siekiant geriau suprasti VAP vaidmenį neurodegeneracinių ligų prevencijoje ir gydyme, ankstesni mūsų tyrimų grupės tyrimai taip pat patvirtino, kad VAP gali sumažinti gliukokortikoidų receptorių, mineralokortikoidų receptorių ir kortikotropiną atpalaiduojančio hormono kiekį. Taip pat buvo pastebėtas VAP poveikis talamo-hipofizės-antinksčių ašiai ir jo gebėjimas slopinti neuronų apoptozę [5].

Smegenų senėjimas yra natūralus fiziologinis procesas, kuriam būdingas oksidacinis stresas (OS), oksidacinio pažeidimo molekulių kaupimasis ir neuronų struktūros bei funkcijos pokyčiai, galiausiai sukeliantys pažinimo nuosmukį ir atminties praradimą [6]. Tarp šių veiksnių OS laikoma pagrindine su senėjimu susijusių neurodegeneracinių ligų priežastimi [7]. Kai organizmas yra veikiamas žalingų dirgiklių, atsiranda disbalansas tarp laisvųjų radikalų susidarymo ir pašalinimo, todėl laisvųjų radikalų kiekis padidėja iki tokio lygio, kuris viršija antioksidacinį organizmo pajėgumą. Pažymėtina, kad per didelis laisvųjų radikalų kiekis yra citotoksinis, todėl tiesiogiai pažeidžia centrinę nervų sistemą [8, 9]. Žmogaus smegenys sudaro tik 2–3 procentus žmogaus kūno svorio. Vis dėlto centrinei nervų sistemai (CNS) tenka 20 procentų viso žmogaus organizmo aprūpinimo deguonimi. Todėl neuronų laisvųjų radikalų kiekis CNS yra didelis, todėl kyla didelė OS rizika [10].

Žmogaus žarnyno mikrobiotą, kurią sudaro daugiau nei 100 rūšių, sudaro maždaug 10-kartai daugiau bakterijų nei žmogaus ląstelės [11]. Firmicutai yra gausiausia žmogaus žarnyno mikrobiotos rūšis, kuri sudaro 60 procentų visų bakterijų, po to seka Bacteroidetes (15 procentų) ir kiti komponentai, kurių dalis yra nedidelė. Žarnyno mikrobiota yra dinaminėje pusiausvyroje su žmogaus kūnu, o žarnyno mikrobai vaidina svarbų vaidmenį žmogaus medžiagų apykaitos, endokrininės sistemos ir imuninės sistemos reguliavime. Todėl, sutrikus žarnyno mikrobiotos struktūrai, gali išsivystyti neurodegeneracinės ligos, širdies ir kraujagyslių ligos, nutukimas [12]. Žarnyno mikroorganizmų kiekio ir įvairovės pokyčiai taip pat gali paveikti žarnyno ir centrinę nervų sistemas. Šios sąveikos yra žinomos kaip mikrobiota-žarnyno-smegenų ašis, kuri yra svarbi kūno funkcijai [13, 14]. Nors žarnyno mikrobiotos profilių pokyčiai nebūtinai turi įtakos sveikatai, pagrindinės mikrobiotos įvairovės praradimas yra susijęs su sumažėjusia pažinimo funkcija ir atmintimi [15]. Iš tiesų, didėjant amžiui, bakterijų floros pokyčiams pirmiausia būdinga įvairovės, probiotikų, fakultatyvinių anaerobų ir bendros trumpos grandinės riebalų rūgščių sumažėjimas [16].

Nors daugybė tyrimų patvirtino, kad su VAP susijęs antioksidacinis ir senėjimą stabdantis poveikis silpnina senėjimą, tikslus šios veiklos mechanizmas liko neaiškus. Todėl šiame darbe VAP senėjimą stabdantis poveikis buvo įvertintas in vivo pelėms naudojant Morriso vandens labirinto (MWM) testą, biocheminę analizę, dažymą hematoksilinu-eozinu (H&E) ir perdavimo elektronų mikroskopiją (TEM). Be to, įvertinome žarnyno mikroekologijos pokyčius senstančių pelių modeliuose, apdorotuose VAP, naudojant 16S ribosominės RNR (rRNR) genų sekos nustatymo technologiją. Mūsų tikslas buvo išsiaiškinti VAP veiklos mechanizmą senėjimo kontekste ir suteikti teorinį pagrindą naujų anti-senėjimo terapinių metodų kūrimui.

2. Medžiagos ir metodai

2.1 Eksperimentinė medžiaga

VAP was provided by the Molecular Pharmacology Laboratory, Changchun University of Chinese Medicine. Dgalactose (D-gal) and VE (purity >90 proc.) buvo nupirkti iš Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Šanchajus, Kinija). Komerciniai superoksido dismutazės (SOD), malonaldehido (MDA), katalazės (CAT) ir glutationo peroksidazės (GSH-Px) rinkiniai buvo įsigyti iš Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd. (Nandzingas, Kinija). Visos cheminės medžiagos ir reagentai buvo analitinės kokybės.

„Morris“ vandens labirinto (MWM) vaizdo stebėjimo ir analizės sistema buvo įsigyta iš Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd. (Čengdu, Kinija). Perdavimo elektronų mikroskopas buvo įsigytas iš Tecnai Corporation (Hillsboro, OR, JAV). Didelio našumo sekos nustatymo platformą (MiSeq PE300) pateikė „Illumina“ (San Diegas, CA, JAV).

2.2 Eksperimentai su gyvūnais

Iš Changchun Yisi Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (sertifikato Nr. SCXK(Ji) -2018-0007) pirkta šešiasdešimt sveikų ICR pelių (SPF klasės, pusė patinų ir pusė patelių, sveriančių 22–26 g). Pelės buvo auginamos atskiruose narvuose 12 valandų šviesos / tamsos ciklais ir standartine temperatūra (22 ± 2 ◦ C), tiekiant maistą ir vandenį ad libitum. Visos pelės buvo pritaikytos prie šių sąlygų mažiausiai vieną savaitę prieš pradedant eksperimentus. Visos pelės buvo suskirstytos į penkias grupes: kontrolinę, modelio, vitamino E (VE), VAP mažos dozės (VAP1) ir VAP didelės dozės (VAP2) grupes. VE, VAP1 ir VAP2 grupėms 10 dienų buvo skiriama atitinkamai VE (100 mg/kg), VAP (200 mg/kg) ir VAP (400 mg/kg), o kontrolinė ir pavyzdinė grupė gavo distiliuoto vandens. (tas pats tūris ir tuo pačiu intragastriniu būdu). Nuo 11 dienos kontrolinei grupei buvo po oda suleidžiamas normalus fiziologinis tirpalas. D-gal (1000 mg / kg) buvo švirkščiama po oda į kitų grupių pelių kaklą, o modelio vartojimas buvo tęsiamas 60 dienų.

2.3 Morriso vandens labirintas

MWM testas buvo atliktas praėjus 1 valandai po D-gal vartojimo 57 dieną. Trumpai tariant, platforma buvo pastatyta vandens labirinto viduryje. Vanduo buvo pilamas į platformą, kol jis viršijo 1 cm, ir palaikoma maždaug 25 ◦C. Pelės buvo nuolat treniruojamos 1 savaitę, o MWM testas buvo oficialiai atliktas pagal standartinę vandens labirinto veikimo procedūrą. Prieš oficialią eksperimento pradžią į vandenį buvo įpilta titano dioksido, kad pelės negalėtų suvokti konkrečios platformos padėties. Pelių galvos buvo nudažytos geltonai, kad būtų galima sekti ir rinkti duomenis. „Morris“ vandens labirinto vaizdo stebėjimo analizės programinė įranga užfiksavo pelių plaukimo kelią, buvimo viduriniame žiede procentą ir vidurinio žiedo judėjimo atstumo procentą.

2.4 H&E dažymas

Visos pelių smegenys buvo fiksuotos 4 procentų paraformaldehido tirpale ir įdėtos į parafiną. Po 24 valandų smegenų audiniai buvo supjaustyti, deparafinuoti, rehidratuoti ir nudažyti H&E. Tada pjūviai buvo stebimi optiniu mikroskopu, kad būtų užfiksuoti patologiniai pokyčiai.

2.5 PREKĖS

Po perfuzijos hipokampo audiniai buvo atskirti, fiksuoti 2 procentų paraformaldehido ir 2,5 procento glutaraldehido fosfato buferiniu tirpalu, dehidratuoti naudojant alkoholio gradientą, išvalyti etoksipropanu, įterpti, supjaustyti griežinėliais ir nudažyti uranilo acetatu ir švino citratu. Hipokampo neuronų ultrastruktūra buvo stebima transmisijos elektronų mikroskopu.

2.6 Biocheminės analizės

Pelės kraujo mėginiai buvo paimti ir centrifuguojami 3000 aps./min. greičiu 15 min 4 ◦C temperatūroje, po to buvo surinktas supernatantas. MDA kiekis serume ir SOD, GSH-Px ir CAT aktyvumas buvo nustatyti pagal rinkinio instrukcijas.

2.7 Išmatų mėginių mikrobiotos profiliavimas

Bendra DNR buvo išgauta iš išmatų mėginių ir naudojama kaip šablonas, skirtas PGR amplifikuoti bakterijos 16S rRNR geno V3–V4 sritį. Neapdorotų duomenų rinkinys yra saugomas NCBI BioProject PRJNA731623 su BioSample prisijungimo numeriais SAMN19291644 – SAMN19291668. PGR produktai buvo kiekybiškai išanalizuoti, o 16S rRNR genų seka buvo atlikta naudojant Illumina MiSeq platformą (Illumina, San Diego, JAV). Neapdoroti duomenys pagrįsti minimaliu 10 bp persidengimo ilgiu, o didžiausias leistinas neatitikimo santykis persidengimo srityje yra 0,2 (numatytasis). Kiekvieno mėginio rodmenys buvo sujungti, o žymos, kurių ilgis buvo mažesnis nei 75 procentai žymos ilgio po kokybės kontrolės, buvo filtruojamos. Chimeros (tai yra, jei dviejų tėvų seka yra daugiau nei 80 procentų panaši į užklausos seką, tada užklausa laikoma chimera) buvo pašalintos, kad būtų gautos aukštos kokybės žymų sekos. Tyrimų programinė įranga (Sonoma, JAV) [17] buvo naudojama žymenims sugrupuoti 97 procentų panašumo lygiu, operaciniams taksonominiams vienetams (OTU) klasifikuoti, rūšių klasifikacijai pagal OTU sekos sudėtį gauti ir mėginio skiedimo [18] bei Šenono indekso kreivių nubrėžimui. . PICRUSt (Halifax, CAN) [19] buvo naudojamas kiekvieno mėginio funkcinei genų sudėčiai nustatyti lyginant rūšies sudėties informaciją pagal 16S rRNR genų sekos rezultatus. Tokiu būdu būtų galima nustatyti funkcinius skirtumus tarp skirtingų mėginių ar grupių. Gausumas, keliai, EB informacija ir OTU gausa kiekvienos funkcinės kategorijos kontekste buvo gauti naudojant Kioto genų ir genomų enciklopediją [20].

2.8 Vakarų blotavimas

Bendras baltymas buvo išgautas iš smegenų audinio, o baltymų koncentracijai įvertinti buvo naudojamas Coomassie briliantinio mėlynumo metodas. Tada, po SDS-PAGE elektroforezės, baltymai perkeliami į membraną, kuri vėliau buvo inkubuojama su pirminiais antikūnais prieš tikslinius baltymus apolipoproteiną E (APOE4), acil-CoA oksidazę 1 (ACOX1), peroksisomų proliferatoriaus aktyvuotą receptorių (PPAR). karnitino-palmitoiltransferazė-1 A (CPT1A) ir gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazė (GAPDH) per naktį 4 ◦C temperatūroje. Vėliau membrana buvo nuplaunama ir inkubuojama su antriniu antikūnu kambario temperatūroje 1 valandą. Išplovus membraną Tris buferiniu fiziologiniu tirpalu ir Tween 20 (TBST), buvo pridėtas sustiprintas chemiliuminescencinis (ECL) tirpalas. Skenuojančiai fotografijai naudojama visiškai automatinė gelio atvaizdavimo sistema (Aplegen, Pleasanton, JAV).

2.9 Laisvųjų riebalų rūgščių (FFA) lygio nustatymas smegenų audinyje

Buvo surinkti pelių smegenų audiniai ir pridėtas atitinkamas kiekis normalaus fiziologinio tirpalo. Tada mėginiai buvo centrifuguojami 4 ◦ C temperatūroje 3000 aps./min., 10 min., o supernatantai buvo surinkti. FFA lygiai smegenų audiniuose buvo nustatyti pagal rinkinio instrukcijas.

2.10 ATP kiekio nustatymas smegenų audinyje

Pelės smegenų audiniai buvo surinkti ir lizuojami smegenų audinyje: lizės buferio santykis 1:5. Tada mėginiai buvo centrifuguojami 12, 000 × g 4 ◦ C temperatūroje 5 minutes, o supernatantai buvo surinkti. ATP kiekis smegenų audiniuose buvo nustatytas pagal rinkinio instrukcijas.

2.11 Statistinė analizė

Duomenų analizei buvo naudojamas SPSS 19.0 (Čikaga, IL, JAV). Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (x ± s). Grupėms palyginti buvo naudojamas studento t testas, o skirtumai buvo laikomi reikšmingais, kai P < 0.05 arba P < 0,01.

3. Rezultatai

3.1 Senstančių pelių, gydomų VAP, pažinimo, mokymosi ir atminties gerinimas

MWM testas remiasi gyvūnų išgyvenimo instinktu, kad surastų pabėgimo platformą ir apima su atmintimi susijusios erdvinės padėties paiešką. Fig. 1 parodytas tipiškas pelių, kurioms paskutinę dieną buvo atliktas MWM testas, pėdsakai. Modelių grupės pelių elgesio trajektorijos diagrama buvo sudėtingesnė ir netaisyklingesnė, o pelės platformos nerado. Pažymėtina, kad pelių elgesio trajektorijos diagrama VAP1 ir VAP2 grupėse buvo paprasta ir buvo rasta platforma. Palyginti su kontroline grupe, išlaikymo laiko procentas viduriniame žiede ir atstumo, kurį perkelia vidurinis žiedas, modelio grupėje buvo žymiai sumažintas (P < 0.01). Palyginti su modelių grupe, sulaikymo trukmės procentas viduriniame žiede ir atstumo, kurį perkelia vidurinis žiedas, procentas žymiai padidėjo VE, VAP1 ir VAP2 grupėse (P < 0.05, P < 0,01). Šie rezultatai rodo, kad VAP skyrimas pagerino D-gal sukeltų senėjimo pelių pažinimo gebėjimus.

3.2 Apsauginis VAP poveikis senstančių pelių hipokampo neuronams

H&E dažymas buvo naudojamas stebėti patologinę smegenų audinių morfologiją senstančiose pelėse, siekiant ištirti, ar VAP gali pagerinti D-gal sukeltą neuronų patologinį pažeidimą (2A pav.). Kontrolinės grupės hipokampo CA1 ląstelės buvo gausios, normalios ląstelių struktūros, visiškos morfologijos ir akivaizdžių branduolių. Priešingai, CA1 ląstelių skaičius hipokampuose iš modelio grupės sumažėjo ir parodė netaisyklingą morfologiją, o mikroskopu nepastebėta jokių akivaizdžių branduolių. Hipokampo CA1 srities neuronai buvo gana normalūs, o VE grupėje branduolio susitraukimas buvo mažesnis, palyginti su modelio grupe. Pažymėtina, kad CA1 sritis hipokampuose iš VAP1 ir VAP2 grupių labai skyrėsi nuo stebėtos modelio grupėje ir panaši į kontrolinės grupės. Struktūra buvo gana normali, ląstelės buvo glaudžiai išdėstytos ir taisyklingos, o morfologija buvo baigta.

TEM buvo toliau naudojamas stebėti senstančių pelių hipokampo neuronų ultrastruktūrą ir suprasti, ar atvirkštinis VAP poveikis mokymosi ir atminties mažėjimui buvo susijęs su neuronų mikrostruktūros reguliavimu smegenyse (2B pav.). Kontrolinės grupės hipokampo neuronai parodė nepažeistą morfologiją, vienodą chromatino pasiskirstymą ir gausius organelius citoplazmoje. Esant dideliam padidinimui, mitochondrijos buvo elipsės formos, su skaidria dviguba išorine membrana ir nepažeistomis kristomis. Priešingai, modelio grupės hipokampo srities neuronai buvo nenormalūs; buvo pastebėti ankstyvi apoptoziniai pokyčiai, tokie kaip chromatino kondensacija; lipofuscino kraujo kūneliai buvo dažnesni; sinapsinė struktūra buvo neaiški; buvo išsibarstę lipidų lašeliai, buvo aptiktas į pūsleles panašus Golgi komplekso išsiplėtimas ir sumažėjęs šiurkštus endoplazminis tinklas. Pažymėtina, kad, palyginti su modelių grupe, VAP1 ir VAP2 grupės turėjo hipokampo neuronus, kurių struktūra ir morfologija buvo normali, su lygiomis branduolio membranomis, normaliais branduoliais ir gausiomis organelėmis. Pažymėtina, kad buvo pastebėta daugiau sinapsių, sinapsinės pūslelės priekinėje membranoje neturėjo nenormalios agregacijos, intracitoplazminio Golgi kūno ir mitochondrijų morfologija buvo normali, o lipofuscinas buvo retas.

3.3 VAP poveikis su oksidaciniu pažeidimu susijusiems fermentams

Neigiamas OS poveikis yra laisvųjų radikalų gamyba organizme, viena iš pagrindinių senėjimo ir ligų priežasčių (3 pav.). Palyginti su kontroline grupe, SOD, CAT ir GSH-Px aktyvumas pelių, kurioms buvo skirtas D-galadas, serume reikšmingai sumažėjo (P < 0.01, P < {{7) }}.{{10}}5), o MDA turinys buvo žymiai padidintas (P < 0.05), o tai rodo sėkmingą modeliavimą. Lyginant su modelių grupe, SOD, CAT ir GSH-Px aktyvumas VE grupėje buvo reikšmingai padidintas (P < 0.01, P < 0.05) . Lyginant su modelių grupe, SOD ir GSH-Px aktyvumas VAP1 grupėje buvo reikšmingai padidėjęs (P < 0,05, P < 0,01). Priešingai, CAT buvo šiek tiek padidintas, bet reikšmingai nesiskyrė. Lyginant su modelių grupe, SOD, CAT ir GSH-Px aktyvumas VAP2 grupėje buvo reikšmingai padidėjęs (P < 0,05, P < 0,01). Palyginti su modelio grupe, pelių MDA kiekis serume VAP1 ir VAP2 grupėse buvo žymiai sumažintas (P < 0,05). Aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad senėjimą stabdantis VAP poveikis yra susijęs su serumo antioksidantų fermentų aktyvumo didinimu senstančiose pelėse ir lipidų peroksidacijos mažinimu.

3.4 VAP poveikis pelių žarnyno mikrobiotos sudėčiai ir įvairovei

16S rRNR genų sekos nustatymo rezultatai davė 1 999 460 PE nuskaitymus, o išfiltravus ir pašalinus chimeras, buvo gauti 1 776 708 veiksmingi žymenys. Kontrolinės, modelio, VE, VAP1 ir VAP2 grupių mėginių vidutiniai sekos ilgiai buvo atitinkamai 417,2, 416,2, 418,2, 421,0 ir 420,4 bp. Skaitymų, kurių Phred kokybės balas didesnis nei 30 (Q30), santykis svyravo nuo 94,15 iki 95,71 proc.

Vėliau, naudodami 16S rRNR geno skaitymus, nustatėme žarnyno mikrobiotos sudėtį. Žymos, gautos taikant didelio našumo seką, buvo sugrupuotos 97 procentų panašumo lygiu ir buvo sukurta Venno diagrama (4A pav.). Kiekviena grupė turėjo 490 OTU ir iš esmės nebuvo jokių konkrečių OTU. Norėdami patikrinti, ar sekos nustatymo gylis atitiko rūšių identifikavimo reikalavimus, visiems mėginiams nubrėžėme Shannon ir retėjimo kreives (4B pav., C). Abi kreivės visuose mėginiuose buvo arti prisotinimo plokščiakalnio, o tai parodė didelę aprėptį (99 proc.). Šie duomenys rodo, kad didžioji dalis informacijos apie mikrobų įvairovę mėginiuose buvo išgauta ir kad galima tiksliai nustatyti bakterijų bendruomenės struktūrą ir įvairovę.

Alfa įvairovė atspindi rūšių gausą (turtingumą) ir rūšių įvairovę. Šenono ir Simpsono indeksai naudojami rūšių įvairovei matuoti ir jiems įtakos turi rūšių gausa imties bendrijoje bei rūšių tolygumas (bendruomenės tolygumas). Kuo didesnė Šenono indekso reikšmė, tuo mažesnė Simpsono indekso reikšmė, o tai rodo, kad imties rūšių įvairovė yra didesnė [21]. 4D pav. pateikti rezultatai nerodo reikšmingų skirtumų tarp pelių floros Shannon indekso vertės tarp grupių.

Palyginti su kontroline grupe, modelio grupės Simpsono indekso reikšmė reikšmingai nesiskiria. Reikšmingo skirtumo tarp modelio grupės ir kiekvienos gydymo grupės nepastebėta. Šie rezultatai nerodo reikšmingo skirtumo tarp pelių žarnyno floros įvairovės tarp grupių.

PCA buvo atliktas su pelių žarnyno flora (4E pav.), kur PC1 ir PC2 yra dvi būdingos vertės, kurios sukelia didžiausią skirtumą tarp mėginių. Rezultatai parodė, kad atitinkamai 32,94 ir 19,74 procento įtakos laipsnio sudarė PC1 ir PC2. Kuo toliau taškai, tuo didesnis skirtumas. Penkios pavyzdžių grupės yra suskirstytos į tris kategorijas, o modelių grupių pavyzdžiai yra paskirstyti viršutiniame kairiajame paveikslo kampe, toli nuo kitų grupių. Kontrolinės, VE ir VAP2 grupės parodė daugiau sutapimų, o trys mėginių grupės buvo arti viena kitos. Viršutinis 4E paveikslo vidurys rodo, kad po VAP intervencijos pelių VAP2 grupės žarnyno floros panašumas į kontrolinių pelių.

Bakterijų gausumo skirtumai kontroliniame modelyje, VE, VAP1 ir VAP2 grupėse buvo įvertinti 20 geriausių genčių (4F pav.). Lachnospiraceae_NK4A136_grupės ir Lactobacillus gausa skyrėsi tarp kontrolinių ir pavyzdinių gyvūnų, kur Lactobacillus gausa pavyzdinėje grupėje buvo žymiai sumažėjusi. Priešingai, likusių genčių gausa žymiai padidėjo. Pažymėtina, kad Lactobacillus nariai yra probiotikai, turintys senėjimą stabdantį ir priešuždegiminį poveikį [22, 23]. Todėl šie rezultatai nenustebino. Pažymėtina, kad Lactobacillus gausa žymiai padidėjo VAP1 ir VAP2 grupėse, palyginti su modelio grupe, o tai rodo, kad VAP gali padidinti naudingų bakterijų kiekį žarnyne, užkertant kelią senėjimui.

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】