Kaip kalcis gydo luorido sukeltą inkstų pažeidimą?
Mar 16, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
Raktiniai žodžiai: Kalcis, Inkstas, Apoptozė
SANTRAUKA
Ilgalaikis per didelis fluoro (F) vartojimas gali sukelti kaulų ir nekaulinių pažeidimų. Theinkstasyra pagrindinis fluoro išskyrimo organas iš organizmo. Šiuo tyrimu buvo siekiama išsiaiškinti, ar dietiniskalciopapildymas gali palengvintiinkstasfluorozės padarytą žalą ir toliau tirti jos poveikįKalcisdėl švelninimo mechanizmoinkstasląstelėapoptozėsukėlė F. Mes įvertinome histopatologinę struktūrą,inkstasfunkcijos rodikliai ir genų bei baltymų ekspresijos lygiai, kuriuos sukelia mirties receptoriaiapoptozėbūdai Sprague Dawley (SD) žiurkėms, gydomoms natrio fluoridu (NaF) ir (arba)kalciokarbonatu (CaCO3) 120 dienų. Rezultatai parodė, kad 100 mg/l NaF sukėlėinkstashistopatologinis pažeidimas irapoptozė, padidino kreatinino (CRE), šlapimo rūgšties (UA), karbamido azoto (BUN), kalio (K), fosforo (P) ir F (p < {0}}.05)="" koncentraciją="" ,="" ir="" sumažinti="" magnio="" (mg)="" kiekį="" serume="" (p="">< 0,05).="" be="" to,="" naf="" padidino="" fas="" ląstelių="" paviršiaus="" mirties="" receptoriaus="" (fas),="" naviko="" nekrozės="" faktoriaus="" (tnf),="" susijusio="" su="" tnf="" mrnr="" ir="" baltymų="" ekspresijos="">apoptozė-indukuojantis ligandas (TRAIL), kaspazė 8, kaspazė 3 ir poli-ADP-ribozės polimerazė (PARP) (p < 0,01),="" kuri="" galiausiai="" suaktyvino="" mirties="" receptorių="" kelią.="">Kalcispapildymas panaikino F sukeltą CRE, BUN, UA, F ir P lygių sumažėjimą, sumažino histopatologinius pažeidimus irapoptozė, ir sumažino su mirties receptorių keliu susijusių žymenų genų ir baltymų ekspresijos lygius. Apibendrinant, 1 procKalcispalengvina F sukeltąinkstasapoptozėper FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL signalizacijos kelius.
Įvadas
Fluoro yra daug dirvožemyje, vandenyje ir maiste. Tačiau kai kurie natūralūs veiksniai (mineralų ir uolienų oras, susidarymaskalcioir magnio druskos, infiltracija į gruntinius vandenis ir kt.) ir žmogaus veikla (pramonės nuotekos, agrochemijos produktai, buities produktai ir kt.) sukelia aplinkos taršą fluoru (Daiwile ir kt., 2019). Šiuo metu didžiausias fluoro (F) poveikio veiksnys yra geriamasis vanduo, o Pasaulio sveikatos organizacijos rekomenduojama F koncentracija geriamajame vandenyje yra mažesnė nei 1,5 mg/l (Geriamojo vandens kokybės gairės, 2017). Epidemiologiniai įrodymai rodo, kad didesnė nei ši koncentracija padidina dantų fluorozės riziką, o didėjanti koncentracija didins skeleto fluorozės riziką (Geriamosios vandens kokybės gairės, 2017; Nacionalinė tyrimų taryba, 2006). Ilgalaikis didelės fluoro koncentracijos poveikis gali padidinti organizmo fluoro absorbciją per kvėpavimo takus
ir virškinamieji traktai. Per didelis F suvartojimas gali pakenkti kauliniams ir nekauliniams kūno organams. Minkštųjų audinių pažeidimas už kaulo ribų paprastai vadinamas ne kauliniu pažeidimu. Šiuo metu nustatyta, kad F sukeltas ne kaulinio audinio pažeidimas apima virškinamąjį traktą, kepenis,inkstas, smegenys ir kt. (Jha ir kt., 2011; Perumal ir kt., 2013).
Theinkstas, pagrindinis organizmo šalinimo organas, atsakingas už toksinių medžiagų ir egzogeninių toksinų apykaitą organizme. Tyrimai parodė, kad apie 50–80 procentų organizmo suvartojamo fluoro yra filtruojama ir absorbuojama.inkstus, o likęs fluoras kaupiasi kituose audiniuose ir organuose (Chen ir kt., 2013; Dharmaratne, 2019). Daugelio rūšių literatūra parodė, kad 50 ir 100 mg/LF ekspozicija gali sukelti inkstų kapsulės ertmės padidėjimą, inkstų atrofiją.inkstaskanalėlių, netaisyklingo papiliarinių ląstelių išsidėstymo, spindžio susiaurėjimo, dėl koapoptozėapieinkstasląstelių ir biocheminių funkcijų, tokių kaip kreatininas (CRE), šlapimo rūgštis (UA), pablogėjimas,kalcio(Ca) ir fosforo (P) (Song ir kt., 2014; HW Wang ir kt., 2020; Wei ir kt., 2018a).
Apoptozė, tam tikra genų kontroliuojama ląstelių mirtis, kuri skirstoma į endogeninęapoptozėir egzogeninisapoptozė. Naujausi pranešimai tai parodėapoptozėDidelio F sukeliami procesai daugiausia apima mitochondrijas, endoplazminį tinklą sukelia stresą ir mirties receptorius (Wei ir kt., 2018a). Ankstesni mūsų grupės eksperimentai parodė, kad NaF sukelia kaulus ir kepenisapoptozėper intraląstelinį endoplazminį tinklą (ER) ir mitochondrijų kelią (Li ir kt., 2021; J. Wang ir kt., 2020; Wang ir kt., 2019). Be to, tyrimai taip pat parodė, kad mitochondrijų kelias yra susijęs su NaF sukeltam procesuapoptozėpelėsinkstus(Wei ir kt., 2018b). Tačiau nėra sistemingo F sukelto mirties receptorių sukelto kelio tyrimoinkstasapoptozė. Mirties receptorių kelias dominuoja kiekviename egzogeninio etapeapoptozė, įskaitant Fas ląstelių paviršiaus mirties receptorių (FAS) kelią, naviko nekrozės faktoriaus (TNF) kelią ir su TNF susijusįapoptozė-indukuojančio ligando (TRAIL) kelias (Grunert ir kt., 2012; Lu ir kt., 2017; Wang ir Su, 2018). FAS kelias yra primityvi signalų perdavimo sistema, kuri tarpininkaujaapoptozė. FAS turi membraninio receptoriaus savybes ir susijungęs su FAS ligandu (FAS-L) sudaro trimerį. Tada specifinis trimero domenas jungiasi su atitinkamo konneksino molekulės FAS-susijusio mirties domeno baltymo (FADD) mirties domenu (DD), kad sudarytų mirties sukeltą signalų kompleksą (DISC) (Wang ir Su, 2018). Toliau pateiktame biologinio signalo perdavimo procese FADD gali aktyvuoti Caspase 8 ir Caspase šeimą tuo pačiu metu ir galiausiai sukeltiapoptozėdalyvaujant kaspazei 3 ir poli-ADP-ribozės polimerazės (PARP) efektui (Kischkel ir kt., 2000; Meynier ir Rieux-Laucat, 2019). Naujausi tyrimai parodė, kad tarpininkauja FAS keliasapoptozėT ląstelėse ir metuinkstascisplatinos sukeltas gedimas (Djiadeu ir kt., 2017; Linkermann ir kt., 2011). Be to, tyrimas taip pat pranešė, kad NaF sukeliaapoptozėpelėms per FAS kelią (Sun ir kt., 2017). TRAIL yra pripažintas citokinas TNF superšeimoje. Jis jungiasi prie savo homologinių agonistų receptorių, būtent mirties receptorių (DR4 ir DR5). Jo ląstelių srityje yra DD. DD yra būtinas adaptyvaus baltymo FADD įdarbinimui. FADD savo ruožtu skatina kaspazių išsiskyrimą į citoplazmą, aktyvuota kaspazė 3 skaldo PARP ir slopina jo DNR atkūrimo potencialą, todėlapoptozė(Bodmer ir kt., 2000; Micheau, 2018). Buvo manoma, kad TRAIL / DR5 kelias yra susijęs su NaF sukeltam poveikiuapoptozėpelėms (Song ir kt., 2021). Osteoprotegerinas (OPG) yra laisvai tirpus receptorius, neturintis transmembraninio domeno. Tai gali suvaržyti TRAIL tarpininkaujantapoptozėslopinant TRAIL ir kitų mirties receptorių prisijungimą (Duiker ir kt., 2006; Kiraz ir kt., 2016; Micheau, 2018). TNF ir TNF receptorių (TNF-R1) prisijungimas gali suaktyvinti su TNFR susijusio mirties domeno (TRADD) baltymo įdarbinimą per jo DD. Po to TRADD sąveikauja su FADD, todėl įdarbinama pro-kaspazė 8, kuri proteolitiniais fermentais suskaidoma į aktyvią kaspazę 8. Tada kaspazė 8 aktyvuoja kaspazę 3, kuri yra atsakinga už ląstelęapoptozė(Kiraz ir kt., 2016; Sedger ir McDermott, 2014). Pranešama, kad NaF indukuoja hepatocitusapoptozėpelėms per TNF-R1 signalo kelią (Lu ir kt., 2017)
Kalcisvaidina įvairius vaidmenis kaulų ir dantų sudėtyje, taip pat gali kontroliuoti nervų perdavimą ir medžiagų išsiskyrimą (Cao ir kt., 2016), dalyvauti sisteminėjekalciohomeostazę (Carmeliet ir kt., 2003; Yang ir kt., 2016), keisti membranų pralaidumą (Lappe ir kt., 2017), suaktyvinti įvairių fermentų ir hormonų sekreciją (Kim ir kt., 2012) ir kt. Daugelyje ankstesnių tyrimų buvo nustatyta, kad F ir Ca turi antagonistinį poveikį biologijoje (Dure-Smith ir kt., 1996; Nobrega ir kt., 2019). Kai F absorbuojamas organizme, jis pateks į kraują ir susidarys netirpios CaF2 nuosėdos. Jei Ca tiekimas su maistu yra nepakankamas ir Ca kraujyje nepasiekia reikiamo lygio, atsiras patologinių pokyčių, tokių kaip hipokalcemija ir osteolizė, todėl maisto papildas Ca vaidina svarbų vaidmenį užkertant kelią fluorozei ir ją gerinant (Dure-Smith ir kt. al., 1996; Li ir kt., 2021; Yang ir kt., 2021). Mūsų grupė patvirtino, kad dietakalciogali palengvintiapoptozėkaulų ir kepenų per PI3K-AKT signalo kelią, ER kelią ir mitochondrijų kelią (Li ir kt., 2021; J. Wang ir kt., 2020; Wang ir kt., 2019; Yang ir kt., 2021). Siekiant dar labiau įrodyti, arKalcissumažina F nefrotoksiškumą per mirties receptoriusapoptozėkelią, sukūrėme žiurkės didelio fluoro dietos modelįkalcioir įvertinoinkstassužalojimo indeksas, laipsnisapoptozė, ir žymeklio geno bei baltymų ekspresijos pokyčius sukeltuose mirties receptoriuoseapoptozėkelias.
medžiagos ir metodai
Chemikalai ir instrumentai
Distiliuotą vandenį paruošė „Heal Force“ vandens valymo sistema (Šanchajus, Kinija). Radijo imunoprecipitacijos tyrimo (RIPA) lizės buferį ir natrio fluoridą (NaF) pateikė Sigma-Aldrich (Šanchajus, Kinija). 10 procentų formalino, glicino, natrio dodecilo sulfato (SDS), TRIS, fenilmetilsulfonilfluorido (PMSF), CaCO3, nitroceliuliozės (NC) membranos, bicinchonino rūgšties (BCA) rinkinio ir hematoksilino-eozino (H&E) dažymo rinkinio buvo gauti iš Solarbio Technology Co. ., Ltd. (Pekinas, Kinija). Trizol reagentas buvo įsigytas iš Takara Biological Engineering Company (Dalian, Kinija). CRE, UA, kraujo karbamido azoto (BUN), magnio (Mg), P ir kalio (K) rinkiniai buvo įsigyti iš Nanjing Jiancheng Bioinžinerijos instituto (Nandzingas, Kinija). Savo vietojeapoptozėaptikimo rinkinys, FAS triušio polikloninis antikūnas (BA0484) ir FAS-L triušio polikloninis antikūnas (PB0042) buvo įsigyti iš Boster Biotechnology (Uhanas, Kinija). -aktino triušio polikloninis antikūnas (20536-1-AP), FADD triušio polikloninis antikūnas (14906-1-AP), kaspazės 8 triušio polikloninis antikūnas (13423-1-AP), kaspazės 3 triušio polikloninis antikūnas ({{9) }}AP) ir HRPkonjuguotas Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H plius L) (SA00001–2) buvo įsigyti iš Proteintech Group (Uhanas, Kinija). TRAL triušio polikloninis antikūnas (bs-1214R), TNF alfa triušio polikloninis antikūnas (bs2081R), PARP triušio polikloninis antikūnas (bs-55164R) buvo nupirktas iš Bioss (Pekinas, Kinija). Elektrocheminė liuminescencija (ECL) ir 3,3′-diaminobenzidinas (DAB) buvo įsigyti iš KeyGen Biotech (Jiangsu, Kinija). „PrimeScript® RT Master Mix“ ir „SYBR® Premix Ex Taq™ II“ rinkinį pateikė „Promega Biotechnology“ (Pekinas, Kinija).
Gyvūnai ir gydymas
Keturiasdešimt sveikų {0}}savaičių Sprague-Dawley (SD) žiurkių patinų (120 ± 20 g) buvo gauti iš Šansi medicinos universiteto (Šansi, Kinija) Eksperimentinio gyvūnų centro. Žiurkės buvo aklimatizuotos vieną savaitę, atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes (10 žiurkių grupėje): kontrolinė grupė (C), NaF grupė (F), NaF plius 0,5 proc. CaCO3 grupė (F plius 0,5 proc. Ca), NaF plius 1 proc. CaCO3 grupė (F plius 1 procKalcis) ir traktuojami kaip 1 lentelė. Visos žiurkės buvo laikomos plastikiniuose narvuose 22–25 ◦C temperatūroje (55 ± 5 proc. drėgmė, 12 h šviesos/tamsos ciklas), maistas ir geriamasis vanduo yra laisvai prieinami.
Po 17 savaičių auginimo žiurkės nevalgė 24 valandas, o vanduo galėjo gerti. Tada žiurkės buvo anestezuotos natrio pentobarbitaliu ir paaukotos išnirstant gimdos kakleliui, paėmus kraują iš akių obuolių. Šiek tiek kraujo buvo paimta iš mėgintuvėlių, kuriuose yra antikoagulianto heparino natrio druskos BUN tyrimui. Dalis kraujo buvo patalpinta į bendrus mėgintuvėlius, 2 valandoms patalpinta kambario temperatūroje, o po to 10 minučių centrifuguojama 3000 aps./min. greičiu, kad atskirtų serumą. Serumas buvo atskirtas CRE, UA, Mg, P, K ir F tyrimams. Aštuoni pavyzdžiaiinkstusiš kiekvienos grupės buvo atsitiktinai atrinkti ir greitai užšaldyti skystame azote, o po to laikomi –80 ◦C temperatūroje qRT-PGR ir Western blot eksperimentams. Kiti pavyzdžiaiinkstusbuvo fiksuoti 10 procentų formalinu histopatologiniam tyrimui ir galutinio deoksinukleotidilo transferazės sukelto dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) eksperimentams. Visos su gyvūnais susijusios eksperimentinės operacijos buvo griežtai įgyvendintos pagal Gyvūnų priežiūros institucijos ir Šansi žemės ūkio universiteto, Šansi, Kinija, naudojimo komiteto nuostatus.
Inkstaskoeficientas
Pirmiausia buvo pasvertos žiurkės; tadainkstasaudiniai buvo pašalinti ir pasverti. Theinkstaskoeficientas buvo gautas pagal šią formulę.
Inkstaskoeficientas=[inkstasšlapias svoris (g) / kūno svoris (g)] × 100 proc.
Histopatologinis tyrimas
Inkstaspavyzdžiai buvo įterpti į parafiną. Pjūvis (5 μm storio) išinkstasbuvo nudažytas H&E. Tada stikleliai buvo stebimi naudojant šviesos mikroskopą (Olympus, Tokijas, Japonija). Sunkumaiinkstassužalojimas buvo vertinamas pagal histopatologinį balą.Inkstaskanalėlių pažeidimas apibrėžiamas kaipinkstasatrofuojasi ir deformuojasi kraujo kūneliaiinkstaskapsulės ertmė išsiplėtė,inkstaskanalėlių, formuojančių gipsą, ir nukritusių epitelio ląstelių. 200 kartų padidinus, kepenų pažeidimo laipsniui įvertinti buvo naudojami šie kriterijai. 1: 0–25 procentų žala; 2: 25–50 procentų žala; 3: 50–75 procentų žala; 4: 75–100 procentų žala (Baranova ir kt., 2016).
Nustatymasinkstas– susiję rodikliai
F lygis buvo matuojamas F jonui būdingu elektrodu (Quadri ir kt., 2018). CRE, UA, BUN, Mg, P ir K lygiai buvo išmatuoti naudojant parduodamus rinkinius. Visos susijusios procedūros buvo atliktos pagal gamintojo instrukcijas.
Aptikimasapoptozėlygiu pagal TUNEL
Siekiant kiekybiškai įvertintiapoptozėininkstasląstelių, eksperimentinė analizė buvo atlikta naudojant situapoptozėaptikimo rinkinys. Theinkstassekcijos buvo deparafinuotos ir suardytos naudojant proteinazę K. Terminal deoksinukleotidiltransferazė gali pažymėti digoksinu pažymėtą dUTP (DIG-dUTP) iki 3′-OH galo, o DIG-dUTP prisijungia prie DNR lūžio taško po reakcijos su biomarkeriu anti. - kasti-Biotinas. Kartu su DAB buvo įtraukta į ekraną. Norėdami vizualizuoti
visi branduoliai, pjūviai buvo nudažyti hematoksilinu. Tamsiai rudi signalai rodo teigiamas ląsteles, o mėlyni – nereaguojančias ląsteles. Theapoptozėindeksas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę.
Apoptozinių ląstelių dalis=(apoptotinių ląstelių skaičius mazge / bendras ląstelių skaičius mazge) × 100 proc.
Kiekybinė realaus laiko PGR (qRT-PGR)
Bendra RNR išinkstasbuvo ekstrahuotas naudojant Trizol reagentą. RNR kokybei ir kiekiui patikrinti naudojome ND{0}} spektrofotometrą (nano lašas, JAV) ir agarozės gelio elektroforezę. Atvirkštinė transkripcija (RT) buvo atlikta 500 ng visos RNR naudojant PrimeScript® RT Master Mix. Specifinius pradmenis -aktinui ir FAS, TRAIL, TNF ir kitiems genams sukūrė Primer Premier 7.0 programinė įranga (2 lentelė) ir susintetino Sangon Biotech (Šanchajus, Kinija). RT-PGR buvo naudojama Quantstudio 7 flex realaus laiko PGR sistema (thermo-fisher, JAV) ir SYBR® Premix Ex Taq™ II rinkinys. PGR reakcijos tūris buvo 20 μL, o RT-PGR sąlygos buvo: 95 ◦C 10
min., 40 ciklų 95 ◦C 15 s, 55 ◦C 30 s, 72 ◦C 30 s ir galiausiai vienas ciklas 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 15 s, 95 ◦C 15 s. Visos reakcijos buvo kartojamos tris kartus. Santykinis 2-ΔΔCt metodas buvo naudojamas santykiniams mRNR ekspresijos lygiams apskaičiuoti, o -aktinas buvo naudojamas kaip kalibratorius. Šio proceso metu efektyvumo skirtumas yra mažesnis nei 5 procentai.
Bendras baltymų ekstrahavimas ir Western blot analizė
Theinkstasaudinys buvo plaunamas PBS, išdžiovinamas filtravimo popieriumi ir suskaidomas RIPA lizės metu (sudėtyje yra PMSF), esant 12, 000 aps./min., 4◦C 10 min. Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bicinchoninic Acid (BCA) rinkinį (Solarbio Science & Technology, Pekinas, Kinija). 35 ng baltymų mėginys buvo sėkmingai ekstrahuotas ir atskirtas 8 procentų SDS-poliakrilamido geliu elektroforezės būdu. Tikslinis baltymas buvo perkeltas į NC membraną, o NC membrana buvo užblokuota 5 procentų neriebiu pienu kambario temperatūroje 2 valandas. Po to NC membrana buvo inkubuojama su pirminiais antikūnais -aktinu (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), Caspase 8 (1:500), Caspase 3 (1:500) ir PARP (1:1000) 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Po 3 kartų plovimo PBST, NC membrana buvo inkubuojama su HRP konjuguotais antriniais ožkos anti-triušio IgG antikūnais (1:2000) kambario temperatūroje 2 valandas. ECL buvo naudojamas tikslinėms baltymų juostoms vizualizuoti. Optinis tankis buvo apskaičiuotas AlphaView programine įranga (versija: 3.2.2.0) FluorChem Q sistemoje (Alpha Innotech, CA, JAV).
Statistinė analizė
Eksperimentiniams duomenims tvarkyti ir analizuoti buvo naudojama GraphPadPrism{{0}} programinė įranga, o visi duomenys buvo pateikti vidurkiu ± SEM. Skirtumo tarp vidurkių reikšmingumas buvo nustatytas dispersijos analize (ANOVA), po kurios buvo atliktas Tukey testas, kai P < 0,05="" laikomas="">
Rezultatai
Pakeitimai vidujeinkstaskoeficientas ir biocheminės funkcijos rodikliai
Theinkstaskoeficientas ir F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K lygiai parodyti 1 pav. Palyginti su C grupe,inkstaskoeficientas reikšmingai sumažėjo F grupėje (p < 0,05).="" tačiau="" inkstų="" koeficientas="" f="" plius="" 1="">Kalcisgrupėje buvo reikšmingas padidėjimas, palyginti su F grupe (p < {0}}.05).="" f="" lygis="" f="" grupėje="" buvo="" žymiai="" didesnis="" nei="" c="" grupėje="" (p="">< 0,001).="" įdomu="" tai,="" kad="" lyginant="" su="" f="" grupe,="" f="" lygis="" f="" plius="" 1="" procentas="" ca="" grupėje="" buvo="" reikšmingai="" sumažėjęs="" (p=""><>
CRE, BUN ir UA buvo įvertinti, kad atspindėtų laipsnįinkstaspažeidimai ir funkciniai pokyčiai. CRE, BUN ir UA lygiai F grupėje buvo ryškiai padidėję, palyginti su C grupės rodikliais (p < 0,05).="" tačiau,="" palyginti="" su="" f="" grupe,="" pirmiau="" minėti="" trys="" rodikliai="" buvo="" pastebimi.="" sumažėjo="" f="" plius="" 1="">Kalcisgrupė (p < 0.05).="" mg,="" p="" ir="" k="" buvo="" elektrolitų="" rodikliai,="" glaudžiai="" susiję="">inkstasfunkcija. Palyginti su C grupe, Mg kiekis serume buvo reikšmingai sumažėjęs, P ir K kiekis smarkiai padidėjo F grupėje (p < 0,05).="" nepaisant="" to,="" pridėjus="" 1="">kalciodieta žymiai padidino Mg koncentraciją serume 15,3 proc. (p < 0.05)="" ir="" žymiai="" sumažino="" p="" koncentraciją="" serume="" 16,9="" proc.="" (p="">< 0,05).="" kraujo="" serume="" k="" kiekis="" mažėjo,="" o="" po="" gydymo="" 1="" proc.="" ca="" papildymu,="" be="" jokios="">
Pakeitimai įinkstasmorfologija
Morfologiniai pokyčiaiinkstasaudiniai buvo ištirti H&E (2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ pav.). C grupėje,inkstaskanalėlių ląstelės buvo kompaktiškai išsidėsčiusios, morfologija taisyklinga, o glomerulų morfologija nepažeista. Tačiau ribos tarp ląstelių buvo neaiškiosinkstaskraujo kūneliai buvo atrofuoti ir deformuotiinkstaskapsulės ertmė išsiplėtė,inkstaskanalėliai suformavo gipsą, o epitelio ląstelės atsiskyrė F grupėje. Palyginti su F grupe, padidėjusKalciskoncentracija, išdėstymasinkstasląstelės palaipsniui tapo tvarkingesnės, jų morfologijainkstaskraujo kūneliai palaipsniui atsigavo, o sužalojimo laipsnis palaipsniui mažėjo. Be to, žalą įvertinome naudodamiinkstasbalas (2Ⅴ pav.). F grupės balas buvo reikšmingai didesnis nei C grupės (p < 0,01);="" nepaisant="" to,="" balas="" f="" plius="" 1="">Kalcisgrupėje žymiai sumažėjo, lyginant su F grupe (p < 0,05).
TUNEL aptinkainkstasląstelėapoptozė
Mes atlikome TUNEL tyrimą, kad nustatytų ir analizuotume, arinkstasląstelės patyrėapoptozėšiame tyrime (3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ pav.).InkstasC grupės audiniai buvo tvarkingai išdėstyti, mažiau apoptozinių ląstelių (4,67 ± 1,15 proc.). F grupėje buvo daug TUNEL teigiamųinkstaskanalėlių epitelio ląstelės (48,17 ± 3,94 proc.). Priešingai, F plius 1 procKalcisgrupėje labai sumažėjo TUNEL teigiamų ląstelių skaičius (28,83 ± 4,81 proc.) (3Ⅴ pav.).
PoveikisKalcisapie F sukeltus su mirties receptorių keliu susijusių genų pokyčius
Santykiniai prieš srovę esančių faktorių mRNR ekspresijos lygiai, susiję su mirties receptorių sukeltu būduapoptozėkelias (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) buvo atskleistas 4a pav. Palyginti su C grupe, TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS ir FAS-L mRNR ekspresijos lygiai F gydytoms žiurkėms buvo žymiai sustiprinti (p < 0,01).="" priešingai,="" santykinė="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas="" ir="" fas-l="" mrnr="" ekspresija="" buvo="" žymiai="" sumažinta="" f="" plius="" 1="">Kalcisgrupė, palyginti su F grupe (p < {0}}.05).="" palyginti="" su="" c="" grupe,="" buvo="" pastebėtas="" akivaizdus="" opg="" mrnr="" ekspresijos="" lygio="" sumažėjimas="" f="" grupėje="" (p="">< 0,01).="" tačiau,="" palyginti="" su="" f="" grupe,="" opg="" yra="" f="">Kalcisgrupės buvo padidintos. Pasroviui faktoriai FADD, TRADD, kaspazės 8, kaspazės 3 ir PARP santykiniai mRNR ekspresijos lygiai parodyti 4b pav. FADD, TRADD, kaspazės 8, kaspazės 3 ir PARP baltymų ekspresija buvo akivaizdžiai sustiprinta F grupėje, palyginti su C grupe (p < 0,01),="" bet="" akivaizdžiai="" sumažėjo="" f="">Kalcisgrupėse, palyginti su F grupe (p < 0.05).
PoveikisKalcisdėl F sukeltų pakitimųapoptozė- giminingi baltymai
TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspazės 8, kaspazės 3 ir PARP baltymų ekspresija buvo aptikta Western blot metodu (5a, b pav.). Palyginti su C grupe, TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspazės 8, kaspazės 3 ir PARP baltymų ekspresija F grupėje buvo žymiai padidėjusi (p < 0.01).="" visų="" pirmiau="" minėtų="" veiksnių="" baltymų="" ekspresija="" buvo="" žymiai="" sumažinta="" f="" plius="" 1="">Kalcisgrupėje, lyginant su F grupe (p < 0.05).
Diskusija
Naujausi įrodymai įrodė, kad F gali sukelti minkštųjų audinių pažeidimus, o F pažeidimo laipsnis priklauso nuo F koncentracijos, poveikio trukmės ir organo tipo (Wei ir kt., 2019). Šiame tyrime 17 savaičių buvo naudojamas 100 mg/l NaF, siekiant sukurti geriamojo vandens poūmio NaF poveikio gyvūnų modelį. NaF dozė parenkama atsižvelgiant į aplinkos užterštumo F laipsnį ir skirtingų rūšių neapibrėžtus veiksnius. Atsižvelgiant į tai, kad vietiniame požeminiame vandenyje išmatuota natūrali F- koncentracija yra apie 4,5 mg/L, šiame tyrime naudotas distiliuotas vanduo su 100 mg/l NaF (F- koncentracija yra apie 45 mg/L) buvo apskaičiuotas pagal neapibrėžtą faktorių. Ekstrapoliacija tarp gyvūnų ir žmonių – 10 (Geriamojo vandens kokybės gairės, 2017; Mukherjee ir Singh, 2021; Wen ir kt., 2013; Zhang ir kt., 2020). Ankstyvieji tyrimai parodė, kad dietiniskalciogali turėti įtakos fluoro absorbcijai, skatinti fluoro išsiskyrimą iš organizmo, sumažinti fluoro absorbcijos greitį ir taip sumažinti F toksiškumą (Harrison ir kt., 1984; Larsen ir kt., 1981). Mūsų naujausi eksperimentiniai tyrimai parodė, kad Ca palengvina F sukeltą kaulų ir kepenų pažeidimą, nes slopina vidinįapoptozė(Li ir kt., 2021; J. Wang ir kt., 2020; Wang ir kt., 2019). Tačiau iki šiol Ca apsauginio poveikio F sukeltam nefrotoksiškumui ir su juo susijusiam mechanizmui tyrimai yra precedento neturintys. Čia pranešame, kad Ca palengvina F sukeltąinkstasžalą. Be to, mes taip pat nustatėme, kad Ca pakeičia F sukeltąinkstasląstelėapoptozėper mirties receptoriusapoptozėkelias (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL keliai). Ilgalaikis F kaupimasisinkstasgali sukelti audinių struktūros ir funkcinių pažeidimų. Šiame tyrime mes nustatėme, kad NaF poveikis sukėlėinkstasląstelėapoptozėžiurkėms, kartu su glomerulų atrofija ir deformacija,inkstaskapsulės ertmės išsiplėtimas,inkstaskanalėliuose susidaro gipsai ir nukrenta epitelio ląstelės. Tačiauinkstasžala buvo žymiai sumažinta papildžius 1 procentą Ca. Šie rezultatai buvo panašūs į rezultatus, gautus ankstesnėse ataskaitose (Cao ir kt., 2015; HW Wang ir kt., 2020).
CRE yra raumenų metabolitas, UA yra galutinis purinų apykaitos produktas, o BUN yra pagrindinis galutinis organizmo baltymų apykaitos produktas, kuris išsiskiria glomerulų filtracijos būdu ir dažniausiai naudojamas aptikti.inkstasfunkcija (Myers ir kt., 2006; HW Wang ir kt., 2020). Biocheminis aukšto F regiono tyrimas parodė, kad glomerulų filtracijos greitis žymiai sumažėjo, o F, UA ir BUN labai pasikeitė (Malin ir kt., 2019). Bandymai su gyvūnais parodė, kad serumo CRE,Kalcis, o P koncentracija buvo žymiai sumažinta pelėms, veikiamoms 100 mg/l NaF, o tai rodo, kad F sutriko.inkstasfunkcija, taip pat Ca ir P metabolizmas (HW Wang ir kt., 2020). F sukeltas nefrotoksiškumas yra susijęs suinkstasdisfunkcija. Kadainkstaspablogėja funkcija, sumažėja F išskyrimas į organizmą, todėl organizme kaupiasi per daug fluoro.inkstasir sustiprinantis F toksiškumą (Kido ir kt., 2017). Kaiinkstusyra labai sutrikę,
F išskyrimas su šlapimu mažėja, o F koncentracija serume toliau didėja (Dharmaratne, 2019). Šiame tyrime pastebėjome, kad BUN ir serumo CRE, UA, P, K lygiai žiurkėms, gydomoms 100 mg/l NaF, žymiai padidėjo, o tai rodo, kad didelė F ekspozicija sukėlė pokyčiusinkstasžiurkių biocheminiai rodikliai ir paskatinoinkstasnepakankamumas. Be to, mes taip pat nurodėme, kad įvairūs rodikliaiinkstaspo to būna normalūsKalcispapildymas. Tai rodo, kad Ca (ypač 1 procKalcis) turi reikšmingą F sukeltą lengvinantį poveikįinkstasžala žiurkėms.
Cistanchegali padėtiinkstasžalą.
Apoptozėyra autonominė ir tvarkinga genų kontroliuojama ląstelių mirtis, kuriai būdingas DNR skilimas be akivaizdžios ląstelių lizės. Šis tyrimas parodė, kad fluorozė sukėlėinkstasląstelėapoptozėžiurkėse. FAS vaidina svarbų vaidmenį atsiradusapoptozėir įvairios ligos. Naujausia literatūra atskleidė, kad FAS tarpininkaujaapoptozėvidujeinkstassukelta išemijos-reperfuzijos ir žmogaus leukocitųapoptozėsukeltas N-nitrozodimetilamino (Iwaniuk ir kt., 2019; Xu
ir kt., 2019). Kai FAS ir FAS-L susijungia ir sudaro trimerį, suveikia proapoptotinis signalas. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad F indukuoja ląstelęapoptozėper FAS/FAS-L kelią (Xu ir kt., 2011). Šiame tyrime F žymiai padidino FAS ir FAS-L mRNR ir baltymų ekspresijąinkstas. Padidėjęs FAS ir FAS-L lygių reguliavimas rodo, kad su FAS / FAS-L susiję apoptoziniai keliai gali būti susiję su F sukeltameapoptozė. FAS/FAS-L trimerį įdarbinus FADD, Pro-Caspase 8 suskaidoma, kad susidarytų aktyvi kaspazė 8, kuri savo ruožtu aktyvuoja Caspase 3 ir tadaapoptozė(Li ir kt., 2011; Xu ir kt., 2011). Šis tyrimas patvirtino, kad sukėlė 100 mg/l NaFapoptozėžiurkėjeinkstusper FAS/FAS-L kelią. Svarbiausias rezultatas yra tas, kad maisto papildai Ca susilpninaapoptozė- indukuojantis F poveikis, priskiriamas FAS / FAS-L aktyvacijos sumažėjimui ir antriniam kaspazių aktyvavimui.
TNF yra pleiotropinis citokinas, dalyvaujantis įvairiuose ląstelių atsakuose, įskaitant diferenciaciją, proliferaciją, uždegimą ir ląstelių mirtį. TNF signalas suaktyvina abuapoptozėir anti-apoptotiniai keliai. Daugelio rūšių literatūroje buvo pranešta, kad TNF dominuoja lipopolisacharidų sukeltameinkstaspažeidimai ir cisplatinos sukeltas ūminisinkstastraumos (Lee ir kt., 2016; Li ir kt., 2018). TNF prisijungia prie TNF-R1, jo DD įdarbina TRADD, o tada TRADD sąveikauja su FADD, todėl susidaro DISC (Kiraz ir kt., 2016; Sun ir kt., 2003). Tyrimai parodė, kad F gali sukelti kepenų, neuronų irinkstasleukocitųapoptozėper TNF signalizacijos kelią (Lu ir kt., 2017; Singh ir kt., 2017; Yan ir kt., 2016). Panašiai kaip ir šių ataskaitų rezultatai, šiame eksperimente reikšmingai padidėjo santykinė TNF, TNF-R1, TNF-R2 ir TRADD išraiška F grupėje. Priešingai, šių genų ekspresija žymiai sumažėjo po 1 procKalcispapildymas, siūlantis įsikišimąKalcisTNF kelyje.
TRAIL dalyvauja reguliuojantapoptozė, proliferacija, imuninis-uždegiminis atsakas ir kt. Šiuo metu manoma, kad TRAIL yra glaudžiai susijęs su ligos atsiradimu ir prognozeinkstasliga (Candido, 2014). Vis daugiau literatūros patvirtino, kad TRAIL reguliuojaapoptozėapieinkstaskanalėlių epitelio ląstelės sergant su HBV susijusiu glomerulonefritu irinkstasapoptozėsu uromodulinu susijusiuoseinkstasliga (Johnson ir kt., 2017; Yang ir kt., 2018). Be to, tyrimas pranešė, kad TRAIL ekspresija paprastai pasikeitė homeostazės metu ir įvairiinkstastraumų (Devarapu ir kt., 2017). TRAIL prisijungia prie mirties receptoriaus DR5 ir įdarbina FADD per DD sąveiką, o tada prisijungia prie pro-kaspazės 8 per mirties efekto domeną, esantį FADD, sudarydamas DISK (Yuan ir kt., 2018). Šis tyrimas parodė, kad F grupėje žymiai padidėjo TRAIL ir DR5 ekspresija. Po papildymo suKalcis, buvo slopinama TRAIL ir DR5 ekspresija. Siūloma, kadKalcisslopina TRAIL kelią, kad sumažintų F sukeltąapoptozė.
Išvada
100 mg/l NaF ekspozicija suaktyvino mirties receptoriusapoptozėkelias (FAS / FASL, TNFR / TNF, DR5 / TRAIL keliai) ir tada sukeltasinkstasląstelėapoptozėžiurkėms, sukeliainkstasmedžiagų apykaitos sutrikimai irinkstasnepakankamumas, dėl kurio atsirandainkstaskraujo kūneliai buvo atrofuoti ir deformuotiinkstaskapsulės ertmė išsiplėtė,inkstaskanalėliai suformavo gipsą. Tačiau pridėjus 1 procKalcisDieta sumažino fluoro kiekį kraujyje, dar labiau palengvinoinkstasmedžiagų apykaitos sutrikimas irinkstasnepakankamumas per mirties receptorių tarpininkaujantį kelią ir žymiai sumažinoinkstassužalojimas (komponentas 6 pav.).
Nuorodos
Šaltinis yra Haojie Li, Veterinarinės medicinos koledžas, Šansi žemės ūkio universitetas, Taigu 030801, Shanxi, PR Kinija ir kt.
