Zikos viruso nestruktūrinis baltymas 4B sąveikauja su DHCR7, kad palengvintų virusinę infekciją

SANTRAUKA

Zikos virusas (ZIKV) vysto nestruktūrinius baltymus, kad išvengtų imuninio atsako ir užtikrintų veiksmingą replikaciją šeimininko ląstelėse. Neseniai buvo pranešta, kad cholesterolio metabolizmo fermentas 7-dehidrocholesterolio reduktazė (DHCR7) turi įtakos įgimtam imuniniam atsakui sergant ZIKV infekcija. Tačiau gyvybiškai svarbus nestruktūrinis baltymas ir mechanizmai, susiję su DHCR7-sukeliamu viruso vengimu, nėra gerai išaiškinti. Šiame tyrime parodėme, kad ZIKV infekcija palengvino DHCR7 ekspresiją. Pažymėtina, kad sureguliuotas DHCR7 savo ruožtu palengvino ZIKV infekciją, o blokuojantis DHCR7 slopino ZIKV infekciją. Mechaniškai ZIKV nestruktūrinis baltymas 4B (NS4B) sąveikavo su DHCR7, kad sukeltų DHCR7 ekspresiją. Be to, DHCR7 slopino TANK surišančios kinazės 1 (TBK1) ir interferono reguliavimo faktoriaus 3 (IRF3) fosforilinimą, dėl kurio sumažėjo interferono-beta (IFN-) ir interferonu stimuliuojamų genų (ISG) gamyba. Todėl siūlome, kad ZIKV NS4B prisijungtų prie DHCR7, kad slopintų TBK1 ir IRF3 aktyvaciją, o tai savo ruožtu slopina IFN ir ISG, taip palengvinant ZIKV vengimą. Šis tyrimas praplečia įžvalgas apie tai, kaip virusiniai nestruktūriniai baltymai antagonizuoja įgimtą imunitetą, kad palengvintų virusinę infekciją per cholesterolio metabolizmo fermentus ir tarpinius produktus.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

1. Įvadas

Kaip uodų platinamas flavivirusas, Zikos virusas (ZIKV) iš pradžių buvo identifikuotas iš rezus makakų Ugandoje 1947 m. Pasaulyje patyrė keletą protrūkių, o ZIKV epidemija tapo visuotine grėsme sveikatai dėl sprogimo plitimo uodų keliais, visame pasaulyje keliaujant besimptomiai pernešėjai ir lytinis perdavimas. Dauguma ZIKV infekcijų praeitų epidemijų metu buvo besimptomės arba lengvos (Wang ir kt., 2016), tačiau per pastarąsias kelias epidemijas ZIKV infekcija sukėlė niokojančias ligas, įskaitant neurologines pasekmes nėštumo metu (mikrocefaliją ir vaisiaus mirtį) ir neurologinius sutrikimus. (Guillain-Barre sindromas) suaugusiems (Cao-Lormeau ir kt., 2016; Pierson ir Diamond, 2020; Rasmussen ir kt., 2016). Įgimta imuninė sistema yra pirmoji ir kritinė šeimininko imuninės gynybos nuo virusinės infekcijos linija. Po ZIKV infekcijos virusinę RNR atpažino intracelulinis retinoinės rūgšties indukuojamas genas I (RIG-I) (Chazal ir kt., 2018; Hertzog ir kt., 2018; Kato ir kt., 2006), kuris inicijavo pasroviui įgimtą imuninę sistemą. atsakas, įskaitant TANK surišančios kinazės 1 (TBK1) aktyvavimą, interferono reguliacinio faktoriaus 3 (IRF3) fosforilinimą ir vėliau I tipo interferonų (IFN-I) gamybą (Fitzgerald ir kt., 2003; Grant ir kt., 2016); Xia ir kt., 2018) ir dešimčių interferonu stimuliuojamų genų (ISG), turinčių įvairų antivirusinį poveikį, ekspresija (Savidis ir kt., 2016; Schneider ir kt., 2014). Šeimininko imuninė sistema gamina IFN ir ISG, kad apribotų virusinę infekciją, tačiau pats ZIKV sukūrė įvairius pabėgimo mechanizmus, kad užtikrintų sėkmingą išgyvenimą ir replikaciją šeimininko ląstelėje, pavyzdžiui, koduoja specifinius nestruktūrinius (NS) baltymus. ZIKV genominė RNR generuoja septynis nestruktūrinius baltymus, įskaitant NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ir NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 įdarbina šeimininką deubikvitinazę USP8, kad stabilizuotų kaspazę-1 ir susilpnina I tipo IFN signalus, kad būtų naudinga ZIKV infekcija (Zheng ir kt., 2018). Buvo pranešta, kad mutantas NS1 jungiasi prie TBK1 ir sumažina TBK1 fosforilinimą, todėl sumažėja IFN gamyba (Xia ir kt., 2018). ZIKV NS3 jungiasi su žmogaus karkaso baltymais (14-3-3ε ir 14-3-3η) ir išskiria juos (Riedl ir kt., 2019), o NS4A sąveikauja su MAVS, kad susilpnintų RIG-I ir MDA{50} }tarpininkaujantys įgimti imuniniai atsakai (Ma ir kt., 2018). Pažymėtina, kad ZIKV NS5 suriša ir pablogina signalo keitiklį ir transkripcijos 2 aktyvatorių (STAT2), kad susilpnintų I tipo IFN signalizaciją (Grant ir kt., 2016; Kumar ir kt., 2016). Be to, buvo įrodyta, kad NS5 sąveikauja su RIG-I ir slopina su K63- susietą RIG-I poliubikvitinaciją, taip slopindama IFN gamybą (Li ir kt., 2020). Be to, buvo įrodyta, kad ZIKV NS2A, NS2B, NS4A ir NS4B nuslopina IFN gamybą, nukreipdami į atskirus elementus RIG-I kelyje (Xia ir kt., 2018). Norint pasiekti veiksmingą replikaciją žinduolių ląstelėse, ZIKV taip pat priklauso nuo šeimininko ląstelių lipidų metabolinių komponentų, kad sudarytų apvalkalą ir užbaigtų virusinių dalelių rinkinį (Chen ir kt., 2020; Leier ir kt., 2020). Cholesterolis yra vienas iš lipidinių ląstelių membranų komponentų ir dalyvauja daugelyje biologinių funkcijų (Ikonen, 2008). Ląstelių cholesterolio homeostazę glaudžiai moduliuoja cholesterolio sintezė, įskaitant absorbciją iš lipoproteinų dalelių ir išsiskyrimą į ekstraląstelinius akceptorius. Beveik visos žinduolių ląstelės priklauso nuo cholesterolio metabolizmo (Luo ir kt., 2020). Sukaupti įrodymai rodo, kad cholesterolio metabolizmas dalyvauja įgimtame imuniniame atsake prieš virusinę infekciją (Blanc ir kt., 2013; Petersen ir kt., 2014; York ir kt., 2015). Po virusinės infekcijos cholesterolio sintezė buvo žymiai pakeista ir kartu sustiprėjo IFN-I ir ISG ekspresija makrofaguose (Li ir kt., 2017; Liu ir kt., 2008; York ir kt., 2015). Cholesterolio -25-hidroksilazė (CH25H), kaip pagrindinis cholesterolio metabolizmo fermentas, paverčia cholesterolį 25-hidroksicholesteroliu (25HC), kuris buvo nustatytas kaip biologinis produktas, prisidedantis prie įgimto imuninio atsako prieš didžiąją daugumą. virusų, įskaitant žmogaus imunodeficito virusą 1 (ŽIV-1), vezikulinio stomatito virusą (VSV), herpes simplex virusą 1 (HSV-1), Ebolos virusą (EBOV), ZIKV, pelių gama herpeso virusą ( MHV68), Rifto slėnio karštligės virusas (RVFV) ir Rusijos pavasario-vasaros encefalito virusas (RSSEV) (Blanc ir kt., 2013; Li ir kt., 2017; Liu ir kt., 2013). Dabartiniai tyrimai yra riboti tiriant, kaip cholesterolio metabolizmo produktai (pvz., 25HC) gali manipuliuoti signalo perdavimu ir dalyvauti įgimtame imunitete. Iki šiol fermentai arba tarpiniai produktai, esantys prieš cholesterolio biosintezę, vis dar nėra gerai išaiškinti. Kaip gyvybiškai svarbus cholesterolio metabolizmo fermentas, 7-dehidrocholesterolio reduktazė (DHCR7) gali ištrinti dvigubą C (7–8) jungtį sterolių B žiede ir katalizuoti cholesterolį iš 7-dehidrocholesterolio ({100} }DHC) (Luu ir kt., 2015). 7-DHC taip pat yra vitamino D pirmtakas, o DHCR7 mutacijos yra susijusios su didesniu vitamino D kiekiu, o tai rodo, kad DHCR7 turi sudėtingą biologinį poveikį cholesterolio ir vitamino D konversijai (Kuan ir kt., 2013; Prabhu ir kt. , 2016a). Gerai pristatytas tyrimas parodė, kad DHCR7 tyla gali suaktyvinti PI3K-AKT3 kelią, sukeldama IRF3 Ser385 fosforilinimą ir skatinti IFN gamybą, kad būtų slopinama daugybinė virusinė infekcija in vitro ir in vivo (Xiao ir kt., 2020). Tačiau supratimas apie DHCR{116}}tarpininkaujantį cholesterolio metabolizmą ZIKV NS baltymų sukeltas imuninės sistemos vengimas yra menkai apibrėžtas. Čia paaiškiname aiškų mechanizmą, kurį ZIKV NS4B nukreipia į DHCR7, pagrindinį cholesterolio sintezės fermentą, kad susilpnintų IFN-I atsaką ir palengvintų ZIKV infekciją. Mes nustatėme, kad ZIKV infekcija padidino DHCR7 ekspresiją. Įdomu tai, kad sustiprintas DHCR7 skatina ZIKV infekciją, o DHCR7 numušimas arba nukreipimas inhibitoriais gali slopinti ZIKV infekciją. Be to, ZIKV NS4B gali surišti DHCR7 ir taip sukelti DHCR7 ekspresiją, kuri slopino TBK1 ir IRF3 aktyvaciją ir sumažino IFN ir ISG gamybą. Todėl siūlome, kad ZIKV NS4B prisijungimas prie DHCR7 sumažintų IRF3 aktyvaciją, o tai savo ruožtu slopina IFN ir ISG, kad palengvintų ZIKV vengimą. Šis tyrimas išplečia naujas įžvalgas apie tai, kaip ZIKV nestruktūrinis baltymas panaikina įgimtą imunitetą, kad palengvintų virusinę infekciją sąveikaujant su cholesterolio metabolizmo fermentais.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Ląstelių linijos

U251 ląstelės buvo įsigytos iš Kinijos tipo kultūros kolekcijos centro (CCTCC) (Uhanas, Kinija). Cercopithecus aethiops inkstų (Vero) ląstelės, žmogaus embriono inksto (HEK 293T) ląstelės ir žmogaus plaučių adenokarcinomos (A549) ląstelės buvo įsigytos iš Amerikos audinių kultūros kolekcijos (ATCC). Ląstelės buvo laikomos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM) (Gibco), papildytoje 10% galvijų vaisiaus serumu (FBS) (Gibco), penicilinu (100 V/ml) ​​ir streptomicino sulfatu (100 ug/ml) 37 ir 5 °C temperatūroje. % CO2. Aedes albopictus (C6/36) ląstelės buvo kultivuojamos minimalioje esminėje terpėje (MEM), papildytoje 10 % FBS, penicilinu (100 V/mL) ir streptomicino sulfatu (100 ug/ml) 28 C temperatūroje su 5 % CO2.

2.2. ZIKV amplifikacija, titravimas ir infekcija

ZIKV izoliatas z16006 (GenBank prisijungimo numeris, KU955589.1) buvo kultivuojamas C6/36 ląstelėse, o ZIKV buvo padalytas į šaldymo buteliukus ir laikomas 80 C temperatūroje. ZIKV titrai buvo išmatuoti apnašų tyrimu. Ląstelės buvo užkrėstos ZIKV nurodytu infekcijos dažniu (MOI) 2 valandas, po to plaunamos fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS), po to kultivuojamos, surenkamos ir tiriamos.

2.3. Plazmidės ir reagentai

Ekspresijos plazmidė pcDNA3.1(þ)-3 Flag buvo naudojama atskiriems ZIKV genams klonuoti iš atitinkamų ZIKV kDNR fragmentų. Norint sukurti pGEX6p-1-NS4B, ZIKV NS4B buvo subklonuotas į pGEX6p-1 vektorių, naudojant ClonExpress II vieno žingsnio klonavimo rinkinį (Vazyme Biotech, Nankinas, Kinija). Žmogaus DHCR7, RIG-I, TBK1 ir IRF3 koduojančios kDNR, klonuotos į pCAGGS-HA vektorių arba pcDNA3.1 (þ)-3 Flag vektorių, buvo sukurtos standartiniu molekulinio klonavimo metodu. DHCR7 missense mutacija G410S buvo sukurta naudojant į vietą nukreiptos mutagenezės metodą. Monokloninis triušio anti-ZIKV vokas (GTX133314) buvo įsigytas iš GeneTex (Irvine, CA, JAV). Triušio polikloninis anti-DHCR7 (A8049), triušio monokloninis anti-ISG15 (A2416), triušio monokloninis anti-TBK1 (A3458), triušio monokloninis anti-P-TBK1 ties Ser172 (AP1026), triušio polikloninis anti-IRF3 (A1118) -triušio IgG (ac005) ir anti-pelės IgG (ac011) buvo įsigyti iš ABclonal Technology (Uhanas, Kinija). Antipelės FITC ir anti-triušio Cy3 antriniai antikūnai buvo įsigyti iš Abbkine (Uhanas, Kinija). Triušio monokloninis anti-P-IRF3 Ser396 (29047S) ir triušio monokloninis anti-ISG56 (14769S) buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology (CST, Bostonas, MA, JAV). Pelės monokloninis anti-Flag (F3165), triušio monokloninis anti-HA (H6908) ir pelės monokloninis anti-GAPDH (G9295) buvo įsigyti iš Sigma (St Louis, MO, JAV). Pelės monokloninis antiFlavivirus grupės antigenas-antikūnas (MAB10216) buvo įsigytas iš Millipore (Mass, JAV). Lipofectamine 2000 (11668-027) ir Trizol (15596018) buvo įsigyti iš Invitrogen Corporation (Karlsbadas, CA, JAV). Poly (I: C) buvo įsigytas iš InvivoGen (San Diegas, CA, JAV).

2.4. Plokštelių tyrimas

ZIKV turintis supernatantas buvo skiedžiamas DMEM be serumo ir užkrėstos Vero ląstelės 12-šulinėlių plokštelėje 2 valandas, po to du kartus plaunamas 1 ml PBS. DMEM, turintis 2% FBS ir 2% žemos lydymosi temperatūros agarozės, buvo gerai sumaišytas tūrio santykiu 1:1, ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 1 ml mišinio. Užkrėstos ląstelės buvo kultivuojamos 37 C temperatūroje su 5% CO2 5–7 dienas. Ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 1 val. ir 30 min. dažytos 0,5% krištolo violetine spalva. 12-Šulinio plokštelė buvo nuplaunama vandeniu ir apskaičiuotos plokštelės.

2.5. Lentiviruso gamyba ir infekcija

Žmogaus DHCR7 nukreiptos shRNR sekos buvo tokios: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Vektorius pLKO.1, turintis sumaišytą shRNR neigiamai kontrolei (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) arba specifinė tikslinė seka, buvo transfekuotas į HEK293T ląsteles kartu su psPAX2 ir pMD2.G su Lipofectamine 2{19} }00. Virusinės dalelės, kuriose yra supernatantų, buvo surinktos praėjus 36 valandoms po transfekcijos, o po to centrifuguojamos 210 g 10 minučių. Supernatanto fazė be ląstelių buvo filtruojama per 0, 45 μm filtrą, kad būtų pašalintos ląstelių nuolaužos. U251 ląstelės buvo užkrėstos lentivirusinėmis dalelėmis, esant 8 ug/mL polibreno. Po 48 valandų auginimo U251 ląstelės buvo atrinktos puromicinu (2 ug/ml, Sigma). Sh-DHCR7 numušimo efektyvumas buvo nustatytas RT-PCR ir Western blot analize.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

2.6. Western blot

Ląstelės buvo lizuojamos RIPA buferiu, papildytu proteazės inhibitoriais ir fosfatazės inhibitoriais ant ledo 1 val., po to centrifuguojamos 4 C, 13, 000 g temperatūroje 1{{10}} min., kad būtų surinkta ląstelė. lizatas. Baltymų koncentracija ląstelių lizate buvo matuojama bicinchonino rūgšties (BCA) baltymų tyrimu. Baltymas buvo atskirtas SDS-PAGE ir po to perkeltas ant polivinildifluorido (PVDF) membranos. PVDF membrana buvo užblokuota imunoblotavimo blokuojančiu buferiu TBST (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl ir 0,05% Tween-20), turinčiu 5% BSA, 1 val. Po plovimo TBST membrana buvo inkubuojama su pirminiais antikūnais ir antraisiais antikūnais, o vėliau aptikta naudojant chemiliuminescencinę vaizdo sistemą (Bio-Rad).

2.7. Bendrojo cholesterolio tyrimas

Bendras cholesterolio kiekis ląstelėse buvo aptiktas naudojant „Applygen Technologies Inc.“ (Pekinas, Kinija) audinių bendrojo cholesterolio tyrimo rinkinį. 5 mmol/l cholesterolio standartas buvo nuosekliai skiedžiamas bevandeniu etanoliu, kad būtų nubrėžta standartinė kreivė, o bendrojo cholesterolio kiekis ląstelėse buvo apskaičiuotas pagal standartines kreives. Eksperimentas buvo atliktas pagal gamintojo pateiktą procedūrą.

2.8. Bendro imunoprecipitacijos tyrimai

HEK293T ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis plazmidėmis. Ląstelės buvo surinktos ir lizuojamos RIPA lizės buferiu, papildytu proteazės inhibitoriais. Po centrifugavimo 18, 000 g 15 min 4 C temperatūroje, ląstelių lizatai buvo surinkti ir imunoprecipituoti Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, JAV) 4 valandas 4 C temperatūroje. Surišti baltymai buvo eliuuojami 2 įkrovimo buferiu ir analizuojami imunoblotingu.

2.9. Realaus laiko PGR

Visos RNR buvo išskirtos iš ląstelių naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen Life Technologies), o cDNR buvo pagaminta naudojant M-MLV atvirkštinės transkriptazės rinkinį (Promega, Madison, WI, JAV). RT-PGR buvo atlikta naudojant SYBR RT-PCR rinkinius (DBI Bio-science) Roche LC480. Gliceraldehido -3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) mRNR buvo nustatyta kaip endogeninė nuoroda, skirta normalizuoti mRNR, o genų ekspresijos lygiai buvo apskaičiuoti naudojant 2 ΔΔCT metodą. RT-PCR pradmenų sekos parodytos papildomoje S1 lentelėje. 2.10. Konfokalinė mikroskopija

U251 ląstelės buvo transfekuotos plazmide ir kultivuojamos 3 0 h, po to tris kartus plaunamos PBS. Ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 15 minučių ir 5 minutes persmelktos PBS, turinčiu 0,1% TritonX-100. Po plovimo PBS ląstelės buvo uždarytos PBS, turinčiu 5% BSA, 30 min. Ląstelės tris kartus plaunamos PBS ir inkubuojamos su anti-HA, anti-FLAG ir anti-flavivirus, po to inkubuojamos su anti-pelės FITC ir anti-triušio Cy3 antriniais antikūnais. Ląstelės buvo nudažytos 40 6-diamidino-2-fenilindolo dihidrochloridu (DAPI) ir atliktos naudojant Olympus konfokalinį mikroskopą.

2.11. GST išskleidžiamieji tyrimai

Plazmidė pGEX6p-1-NS4B buvo transfekuota į Escherichia coli (E. coli) padermę BL21. GST ir GST-NS4B buvo indukuoti IPTG, kurios galutinė koncentracija buvo 0,5 mmol/L, ir kultūros buvo auginamos dar 6–8 valandas 37 C temperatūroje. Tada GST baltymas ir GST- NS4B baltymas buvo išgrynintas iš E. coli bakterijų. GST arba GST-NS4B baltymas buvo inkubuojamas su glutationo Sepharose granulėmis (Novagen) ir tris kartus plaunamas PBS. GST ir GST-NS4B baltymai buvo inkubuojami su eukariotų sulietu baltymu HA-DHCR7, kilusiu iš plazmidžių, koduojančių HA-DHCR7-išreikštus HEK293T ląstelių lizatus, 4 valandas 4 C temperatūroje. Nuosėdos penkis kartus plaunamos, virinamos 2 SDS įkrovimo buferis ir aptiktas Western blot metodu su anti-GST ir anti-HA antikūnais.

2.12. HA-DHCR7 nukreipta mutagenezė

Buvo susintetintos atitinkamos mutageninių pradmenų poros (papildoma S1 lentelė) ir panaudotos mutavusiam konstruktui generuoti PGR. HA-DHCR7 buvo naudojamas kaip PrimeSTAR® HS Premix (Takara) šablonas. Po PGR laukinio tipo plazmidė, likusi PGR produkte, buvo selektyviai virškinama DpnI (New England Biolabs). Suvirškintas PGR produktas buvo transfekuotas į E. coli padermę DH5. Norimas mutantas buvo patvirtintas Sanger sekos analize.

cistanche augalą stiprinanti imuninė sistema

2.13. Statistinė analizė

Visi eksperimentai buvo pakartoti mažiausiai tris kartus su panašiais rezultatais. Duomenys išreiškiami kaip vidutinis standartinis nuokrypis (SD). Kintamumo reikšmingumas buvo nustatytas pagal Studento dviejų krypčių nesuporuotą t-testą dviejų grupių arba vienpusei ANOVA su Dunnett daugkartinių palyginimų testu arba dvipusio ANOVA su Sidak kelių palyginimų testu kelių grupių palyginimui naudojant GraphPad Prism programinę įrangą. (8 versija.{6}}.1). Vertė P < 0.{{10}}5 buvo laikoma statistiškai reikšminga, o P > 0.05 buvo nustatyta kaip statistiškai nereikšminga. Visiems duomenims reikšmingumas buvo pateiktas kaip *P < 0,05, **P < 0,01 ir ***P < 0,001.

3. Rezultatai

3.1. ZIKV infekcija sukelia DHCR7 ekspresiją

Sukaupti įrodymai parodė, kad cholesterolio metabolizmas daro įtaką įgimtam šeimininko imuniniam atsakui prieš flavivirusinę infekciją, tokią kaip ZIKV ir Dengės karštligės virusas (DENV) (Leier ir kt., 2020; Randall, 2018). DHCR7 koduoja fermentą, kuris 7-DHC paverčia cholesteroliu – paskutiniu cholesterolio biosintezės žingsniu (Moebius ir kt., 1998). Pirmiausia aptikome DHCR7 ekspresiją po ZIKV infekcijos. Žmogaus astrocitas U251 buvo užkrėstas ZIKV, kuris priklausomai nuo dozės padidino DHCR7 ekspresiją tiek mRNR, tiek baltymuose (1A-C pav.). Norėdami patvirtinti reiškinį, mes toliau ištyrėme DHCR7 ekspresiją Vero ląstelėse ir nustatėme, kad ZIKV infekcija iš esmės sukėlė DHCR7 ekspresiją (1D pav. – F), kuri atitiko U251 ląstelių rezultatus.

cistanche nauda - stiprina imuninę sistemą

3.2. Taikymas DHCR7 sukelia kritinį anti-ZIKV aktyvumą

Norint įvertinti DHCR7 poveikį ZIKV infekcijai, U251 ir A549 ląstelės buvo transfekuotos HA-DHCR7 koduojančia plazmide ir po to užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1). Rezultatai parodė, kad per didelė DHCR7 ekspresija žymiai padidino ZIKV mRNR ekspresiją (2A ir B pav.). Pažymėtina, kad su DHCR7 baltymo kaupimu, ZIKV struktūrinio baltymo E ekspresija taip pat padidėjo (2 pav. C ir D). Be to, mes toliau atlikome apnašų tyrimą, naudodami supernatantą iš 2 pav. C ir nustatėme, kad DHCR7 ekspresija žymiai padidino apnašas formuojančius vienetus, palyginti su kontroline grupe (2 E ir F pav.). Buvo pranešta, kad DHCR7 missense mutacija G410S panaikina fermentų aktyvumą (Fitzky ir kt., 1998; Shim ir kt., 2004; Witsch-Baumgartner ir kt., 2000). Norėdami toliau nustatyti DHCR7 poveikį ZIKV infekcijai, mes sukūrėme neaktyvų DHCR7 mutantą (G410S). Palyginti su laukinio tipo DHCR7, G410S mutantas gali žymiai slopinti ZIKV infekciją (2G pav.). Mes taip pat atlikome konfokalinės mikroskopijos tyrimą, kad patvirtintume stebėjimą. Kaip parodyta 2H pav., per didelė DHCR7 ekspresija padidino ZIKV infekciją. Norėdami nustatyti, ar endogeninio DHCR7 fermento aktyvumas yra labai svarbus ZIKV infekcijai, sukūrėme dvi trumpo plaukų segtuko RNR (shDHCR7-1 ir sh-DHCR7-2), kurios konkrečiai nukreiptos į DHCR7, ir sukūrėme DHCR7-nutildytą U251 ląstelę. linijos su shRNR sistema (3A pav.). Galiausiai pasirinkome sh-DHCR{38}} dėl didesnio nutildymo efektyvumo. Palyginti su ląstelių linijos transdukuota kontroline shRNR, šios DHCR7 numuštos ląstelės buvo mažiau jautrios ZIKV infekcijai (3B ir C pav.). Toliau naudojome selektyvų DHCR7 inhibitorių AY9944, kuris neleidžia 7-DHC virsti cholesteroliu (Xu ir kt., 2011), kuris, kaip įrodyta, slopina DHCR7 fermentinį aktyvumą (Horlick, 1966; Moebius ir kt., 1998). Palyginti su kontrole, AY9944 skyrimas priklausomai nuo dozės slopino ZIKV infekciją U251 ląstelėse (3D pav. – F). Apnašų tyrimas taip pat buvo atliktas Vero ląstelėse, siekiant toliau įvertinti DHCR7 poveikį ir parodyti, kad AY9944 gali žymiai slopinti ZIKV infekciją (3G ir H pav.). Pažymėtina, kad konfokalinė mikroskopija parodė, kad ZIKV E baltymas buvo žymiai sumažintas esant AY9944 (3I pav.). Šie rezultatai parodė, kad nukreipimas į DHCR7 gali slopinti ZIKV infekciją.

1 pav. ZIKV infekcija sukelia DHCR7 ekspresiją. A–F U251 ir Vero ląstelės buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 0, 1 ir 2) 24 valandas, o ZIKV (A, D) ir DHCR7 (B, E) tarpląstelinės RNR lygiai buvo nustatyti RT-PGR su GAPDH kaip vidine kontrole. Santykinis baltymų kiekis DHCR7 ir ZIKV apvalkaluose buvo aptiktas Western blot (C, F) metodu. Duomenys gauti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų (vidutinis SD) arba reprezentatyvių duomenų (C, F). Statistinis reikšmingumas buvo apskaičiuotas naudojant vienpusę ANOVA su Dunnett daugkartinio palyginimo testu (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, standartinis nuokrypis.

3.3. DHCR7 slopina TBK1 ir IRF3 aktyvaciją, kad sumažintų IFN ir ISG gamybą

Kadangi DHCR7 yra gyvybiškai svarbus fermentas, paverčiantis 7-DHC į cholesterolį (Moebius ir kt., 1998), o ZIKV infekcija gali padidinti DHCR7 ekspresiją, mes išmatavome cholesterolio lygį užsikrėtus ZIKV. Mes atskleidė, kad ZIKV infekcija turi mažai įtakos cholesterolio sintezei U251 ir Vero ląstelėse (4 pav. A ir B), nors DHCR7 buvo padidėjęs (1 pav. A – D). Atsižvelgiant į sustiprintą DHCR7 po ZIKV infekcijos ir pagrindinius IFN vaidmenis kovojant su ZIKV infekcija, toliau nustatėme DHCR7 poveikį IFN-I signalizacijos keliui. Kontrolės ir DHCR{11}}nutildančios U251 ląstelės buvo užkrėstos ZIKV arba transfekuotos poli(I:C), ir buvo tiriama IFN ekspresija. Palyginti su kontroline grupe, ZIKV infekcija arba gydymas poli(I:C) žymiai padidino IFN ekspresiją DHCR{15}}nutildančiose U251 ląstelėse (4C ir D pav.). ISG yra interferono veikimo veiksniai ir vaidina svarbų vaidmenį įgimtoje imuninėje gynyboje nuo ZIKV infekcijos. Mes taip pat parodė, blokuoja DHCR7 gali žymiai sustiprinti ISG15 ir ISG56 ekspresiją tiek mRNR ir baltymų lygiais (4 pav. E-J). Nuosekliai gydymas DHCR7 inhibitoriumi AY9944 gali sukelti IFN-, ISG15 ir ISG56 ekspresiją (4K pav., L). Svarbu tai, kad neaktyvus mutantas G410S gali iš dalies pakeisti slopinamąjį DHCR7 poveikį IFN ir ISG ekspresijai (4M pav., N). TBK1 ir IRF3 aktyvinimas yra būtinas IFN-ISG indukcijai, todėl toliau ištyrėme DHCR7 poveikį TBK1 ir IRF3 ekspresijai ir aktyvacijai. Mes parodėme, kad DHCR7 ne tik priklausomai nuo dozės slopina baltymų lygį, bet ir slopino TBK1 ir IRF3 fosforilinimo lygį (5A-C pav.). Be to, neaktyvus mutantas G410S nevisiškai panaikino slopinamąjį DHCR7 poveikį IRF3 ir TBK1 fosforilinimui (5D pav.). Nesuderinama su DHCR7 per didelės ekspresijos išvadomis, gydymas AY9944 gali sukelti IRF3 ir TBK1 aktyvaciją U251 ląstelėje (5E pav.).

3.4. ZIKV NS4B sąveikauja su DHCR7, kad slopintų TBK1 ir IRF3 fosforilinimą

Vis daugiau įrodymų atskleidė, kad ZIKV sukūrė specifinius NS baltymus, kad palengvintų veiksmingą replikaciją ląstelėse-šeimininkėse, tiesiogiai išvengdamas šeimininko įgimto ir adaptyvaus imuniteto per daugybę atskirų mechanizmų. Atlikome bendro IP tyrimą, kad patikrintume atskirą ZIKV NS baltymą, kuris galėtų sąveikauti su DHCR7. HEK293T ląstelės buvo transfekuotos kartu su pCMV-DHCR7-HA ir plazmide, ekspresuojančia atskirą NS baltymą, sujungtą su vėliavėlės žyma. Kaip parodyta 6A pav., DHCR7 jungiasi tik su NS4B, bet nesąveikauja su kitais NS baltymais. Toliau buvo atlikti abipusiai bendro IP tyrimai, kurie parodė, kad NS4B baltymas sąveikavo su DHCR7 HEK293T ląstelėse (6B ir C pav.). Norėdami patvirtinti NS4B ir DHCR7 sąveiką, mes atlikome konfokalinį mikroskopą ir nustatėme, kad NS4B baltymas ir DHCR7 baltymas buvo kolokalizuoti citoplazmoje (6D pav.). GST išskleidžiamasis tyrimas dar labiau parodė NS4B ir DHCR7 sąveiką (6E pav.). Be to, trumpalaikė NS4B transfekcija U251 ląstelėse gali smarkiai sukelti DHCR7 ekspresiją (6F pav.). Svarbu tai, kad NS4B gali priklausomai nuo dozės blokuoti tiek TBK1, tiek IRF3 fosforilinimą, o tai teigiamai koreliavo su sustiprintu TBK1 ir IRF3 aktyvavimu reaguojant į DHCR7 (6G ir H pav.). Tačiau per didelė NS4B ekspresija HEK293T ląstelėse žymiai sumažino TBK1 baltymų kiekį, tačiau turėjo mažai įtakos IRF3 baltymui (6G ir H pav.). Siekiant dar labiau patvirtinti šiuos pastebėjimus, NS4B buvo transfekuotas į DHCR7 numuštas U251 ląsteles ir parodė slopinamąjį poveikį endogeninių baltymų ir TBK1 ir IRF3 fosforilinimo lygiams (6 pav. I). Kartu šie rezultatai parodė, kad ZIKV NS4B sąveikavo su DHCR7 ir sustiprino DHCR7 ekspresiją, kad blokuotų TBK1 ir IRF3 aktyvaciją ir palengvintų ZIKV infekciją.

2 pav. Per didelė DHCR7 ekspresija skatina ZIKV replikaciją. A-D U251 ir A549 ląstelės buvo transfekuotos HA vektoriumi arba HA-DHCR7 nurodytomis koncentracijomis 12 valandų, o po to dar 36 valandas užkrėstos ZIKV. ZIKV RNR lygiai buvo aptikti RT-PGR naudojant GAPDH kaip vidinę kontrolę (A, B), o ZIKV apvalkalo, HA-DHCR7 ir GAPDH baltymų lygiai buvo aptikti Western blot (C, D). E, F Vero ląstelės buvo užkrėstos ZIKV turinčiu supernatantu iš 2C pav. 48 valandas, kad būtų nustatytos ZIKV kopijos apnašų tyrimu. G U251 ląstelės buvo transfekuotos HA vektoriumi, HA-DHCR7 arba HA-DHCR7 (G410S) 12 valandų ir užkrėstos ZIKV 36 val., o ZIKV apvalkalo, HA-DHCR7 ir baltymų lygis. GAPDH buvo aptiktas Western blot metodu. H U251 ląstelės buvo transfekuotos HA-vektoriu arba HA-DHCR7 (1 ug) 12 valandų, užkrėstos ZIKV 36 valandas, o vėliau inkubuojamos su pelių anti-flaviviruso ir triušio anti-HA antikūnais, po to dažytos FITC konjuguotu antipeliu ir Cy3-konjuguoti antriniai antikūnai prieš triušius. Branduoliai buvo nudažyti DAPI. Vaizdai buvo vizualizuoti konfokaline mikroskopija. Mastelio juosta ¼ 100 μm. Duomenys gauti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų (vidutinis SD) arba reprezentatyvių duomenų (C, D, E, G, H). Statistinis reikšmingumas buvo apskaičiuotas naudojant Stjudento dvipusį nesuporuotą t-testą (F) arba vienpusį ANOVA su Dunnett daugybinių palyginimų testu (A, B). *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, standartinis nuokrypis.

4. Diskusija

I tipo IFN ir jų pasroviui esantys ISG susiduria su daugybe patogenų ir vaidina lemiamą vaidmenį šeimininko imuninėje gynyboje nuo ZIKV (Lazear ir kt., 2016). Siekdamas išvengti IFN tarpininkaujamos priežiūros ir pasiekti pakankamą replikaciją, ZIKV vysto NS baltymus, nukreiptus į įvairius IFN signalizacijos kelio taškus, kad pabėgtų nuo ląstelių įgimtos imuninės sistemos (Lee ir kt., 2021). Montavimo tyrimai parodė, kad ZIKV NS1, NS3, NS4A ir NS5 slopina skirtingus RIG-I / IFN-I kelio modulius ir palengvina virusinę infekciją, naudojant nepriklausomus ir įvairius mechanizmus (Grant ir kt., 2016; Kumar ir kt., 2016). Ma ir kt., 2018; Riedl ir kt., 2019; Xia ir kt., 2018; Zheng ir kt., 2018). Tačiau specifinis ZIKV NS4B mechanizmas, neutralizuojantis imuninį apribojimą, yra menkai apibrėžtas. ZIKV NS4B yra itin hidrofobinis baltymas, susidedantis iš 251 aminorūgšties ir yra endoplazminėje tinklinėje membranoje su N-galu (Zou ir kt., 2014). NS4B IFN-I signalizacijos kelio slopinimas buvo nustatytas skirtinguose flavivirusuose (Ding ir kt., 2013; Munoz-Jordan ir kt., 2003, 2005; Shan ir kt., 2021; Yi ir kt., 2016; Zhang ir kt. al., 2021). Neseniai atliktas tyrimas pranešė, kad ZIKV INMI1 padermė, išskirta Brazilijoje, naudoja NS4B, kad slopintų IFN-I signalizacijos kelią pasroviui, sutraiškydama STAT1 fosforilinimą ir dėl to nutraukdama STAT1 branduolinį transportavimą (Fanunza ir kt., 2021). Šiame tyrime mes nustatėme aiškų mechanizmą, pagal kurį ZIKV NS4B panaikino IFN gamybą, slopindamas TBK1 ir IRF3 fosforilinimą, IFN-I signalizacijos kelio komponentą. Pažymėtina, kad ZIKV NS4B buvo aptiktas aminorūgščių pakaitalas (G18R), kuris prisidėjo prie sumažėjusios IFN gamybos ir susilpnėjusios ISG ekspresijos, todėl palengvino virusinę infekciją pelėms, o tai rodo NS4B, kaip patogenezės determinanto, reikšmę (Gorman ir kt. ., 2018). Atsirandantys įrodymai rodo, kad cholesterolio metabolizmas, dalyvaujantis įgimtame imuniniame atsake, yra labai svarbus (Akula ir kt., 2016; Dang ir kt., 2017; Reboldi ir kt., 2014; York ir kt., 2015). Nors buvo patvirtinta, kad kai kurie tarpiniai cholesterolio metabolizmo produktai turi platų antivirusinį poveikį (Blanc ir kt., 2013; Li ir kt., 2017; Liu ir kt., 2013; Xiao ir kt., 2020), mūsų tyrimas parodė naują mechanizmą. kad cholesterolio metabolizmo fermentas DHCR7 dalyvavo ZIKV infekcijoje, susilpnindamas TBK1 ir IRF3 aktyvaciją, kad palengvintų virusinę infekciją. Kaip pagrindinis fermentas, dalyvaujantis desmosterolio ir cholesterolio apykaitoje, DHCR7 reiškia 7-DHC pavertimą vitaminu D odos ląstelėse, kurias veikia UVB (Prabhu ir kt., 2016b). Be to, DHCR7 yra ne tik Bloch kelio vartuose, bet ir Kandutsch-Russell kelio pabaigoje (Prabhu ir kt., 2016a, 2016b), kuris atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį kontroliuojant cholesterolio sintezę. DHCR7 skersinis pokalbis ir jo sąveika su kitais fermentais keliais būdais gali suteikti įvairių funkcijų įvairiuose ląstelių tipuose ar organuose. Ankstesnis tyrimas atskleidė, kad blokuojant DHCR7, gali sumažėti desmosterolio, tiesioginio cholesterolio biosintezės pirmtako, kiekis, taip užtikrinant pakankamą apsaugą nuo HCV infekcijos (Luu ir kt., 2015; Rodgers ir kt., 2012). Svarbu tai, kad Xiao ir kt. parodė, kad VSV infekcija sumažina DHCR7 ekspresiją, todėl sumažėja cholesterolio kiekis, tačiau daug daugiau 7-DHC kaupiasi makrofaguose ir kepenyse (Xiao ir kt., 2020). Makrofagai, apdoroti 7-DHC, padidino antivirusinį atsaką; o cholesterolio pridėjimas parodė nedidelę apsaugą. DHCR7 inhibitoriai ir 7-DHC skyrimas gali būti naudingi metodai kovojant su virusinėmis infekcijomis, tokiomis kaip HIN1, HSV ir VSV. Šiame tyrime mes nustatėme, kad DHCR7 inhibitorius AY9944 gali slopinti ZIKV infekciją. Tačiau mūsų tyrimas atskleidė, kad ZIKV infekcija sukėlė DHCR7 ekspresiją, tačiau turėjo mažai įtakos cholesterolio biosintezei glijos ląstelėse. Netyrėme 7-DHC ekspresijos lygio po ZIKV infekcijos, tačiau verta toliau tirti, ar 7-DHC ir AY9944 turi sinerginį terapinį veiksmingumą gydant pacientus, užsikrėtusius ZIKV. infekcija smegenyse. Per didelis DHCR7 ekspresija skatino ZIKV infekciją, o gydymas selektyvaus DHCR7 inhibitoriumi (AY9944) stipriai padidino IFN gamybą prieš ZIKV infekciją. TBK1 ir IRF3 aktyvinimas yra gyvybiškai svarbus norint pradėti IFN-I signalizaciją. Ankstesnis tyrimas parodė, kad DHCR7 nutildymas arba 7-DHC gydymas suaktyvino PI3K-AKT3 kelią, kad būtų fosforilintas IRF3, bet ne TBK1 makrofaguose (Xiao ir kt., 2020). Nepaisant to, mūsų išvados parodė, kad DHCR7, priklausomai nuo dozės, sumažino IRF3 ir TBK1 ekspresiją, taip pat IRF3 ir TBK1 fosforilinimą. Šie tyrimai parodė, kad DHCR7 gali prisidėti prie ZIKV infekcijos nuo cholesterolio metabolizmo nepriklausomame smegenų mechanizme. Buvo gerai išaiškinta, kad ZIKV naudojo NS baltymus, kad tiesiogiai sąveikautų su skirtingais RIG-I / IFN-I kelio komponentais, kad išvengtų imuninio atsako ir palengvintų viruso replikaciją. Anksčiau pranešėme apie ZIKV NS5 sąveiką su RIG-I, kad susilpnintų IFN gamybą (Li ir kt., 2020). Kiti parodė, kad ZIKV NS1 ir NS2B buvo nukreipti į TBK1, NS3 nukreipti į RIG-I ir MDA5, kad sumažintų IFN-I ir ISG gamybą (Lee ir kt., 2021; Riedl ir kt., 2019). Tačiau ZIKV NS baltymų, nukreiptų į cholesterolio metabolizmą, funkcija iš esmės lieka sunkiai suprantama. Šiame tyrime taip pat iliustravome nepaskelbtą sąveiką tarp cholesterolio metabolinio fermento DHCR7 ir ZIKV NS baltymų. Mes parodėme, kad DHCR7 yra konkrečiai prijungtas prie NS4B, o ne su kitais NS baltymais. Pateikėme kritinius įrodymus, kad ZIKV NS4B sąveikavo su DHCR7 ir iš esmės sukėlė jo ekspresiją, o tai atitiko U251 ląstelių rezultatus po ZIKV infekcijos. Svarbu tai, kad, be tiesioginio DHCR7 ir ZIKV NS4B įsitraukimo, mes taip pat nustatėme, kad ZIKV NS4B padidino DHCR7 ekspresiją, kad slopintų TBK1 ir IRF3 fosforilinimą ir palengvintų ZIKV infekciją. Remiantis mūsų rezultatais, neseniai atliktas tyrimas atskleidė, kad DHCR7 trūkumas gali suaktyvinti IRF3 ir IFN signalizaciją, kad slopintų VSV ir kitus virusus makrofaguose.

3 pav. DHCR7 numušimas sumažina ZIKV infekciją U251 ląstelėse. U251 ląstelės buvo transdukuotos lentivirusinėmis dalelėmis, turinčiomis shRNR prieš DHCR7 (shDHCR{5}} ir sh-DHCR7-2) arba netikslinę seką (sh-NTC), po to 14 dienų buvo atrenkamas puromicinas. Numušimo efektyvumas buvo nustatytas RT-PGR. B, C DHCR{11}}nutildančios U251 (sh-DHCR7) ir sh-NTC U251 ląstelės buvo užkrėstos arba ZIKV užkrėstos (MOI ¼ 1) 36 valandas. Intraląstelinis ZIKV RNR lygis buvo aptiktas RT-PGR naudojant GAPDH kaip vidinę kontrolę (B), o ZIKV apvalkalo, DHCR7 ir GAPDH baltymų lygiai buvo aptikti Western blot (C). D, E U251 ląstelės buvo apdorotos DHCR7 inhibitoriumi AY9944 nurodytoje koncentracijoje 2 valandas, tada 48 valandas buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1). Ląstelėms buvo atlikta RT-PCR, kad būtų galima aptikti ZIKV RNR (D). Baltymų lygiai ZIKV apvalkale, DHCR7 ir GAPDH buvo aptikti Western blot (E). F U251 ląstelės buvo apdorotos DHCR7 inhibitoriumi AY9944 nurodytoje koncentracijoje 36 valandas, o DHCR7 ir GAPDH buvo aptikti Western blot. G, H Vero ląstelės buvo užkrėstos ZIKV turinčiu supernatantu iš 3E pav. 48 valandas, kad būtų nustatytos ZIKV kopijos apnašų tyrimu. I U251 ląstelės buvo apdorotos nurodytos koncentracijos AY9944 2 valandas, po to 36 valandas buvo užkrėstos ZIKV esant MOI ¼ 1. Vaizdai buvo vizualizuoti konfokaline mikroskopija. Mastelio juosta ¼ 100 μm. Duomenys gauti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų (vidutinis SD) arba reprezentatyvių duomenų (C, E, F, G ir I). Statistinis reikšmingumas apskaičiuojamas naudojant vienpusę ANOVA su Dunnett daugkartinio palyginimo testu (A, D, H) arba dvipusę ANOVA su Sidako daugkartinio palyginimo testu (B). ***P < 0,001. SD, standartinis nuokrypis.

4 pav. DHCR7 slopina IFN ir ISG gamybą. A, B U251 ir Vero ląstelės buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 ir 1) 24 valandas, o ląstelių cholesterolis buvo matuojamas naudojant audinių bendro cholesterolio tyrimo rinkinį. C-H DHCR{9}}nutildančios U251 (sh-DHCR7) ir sh-NTC U251 ląstelės buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1) arba apdorotos Poly (I: C) (1 ug/ml) 6 valandas. Bendra ląstelių RNR buvo ekstrahuota ir atlikta RT-PCR, kad būtų galima ekspresuoti mRNR, naudojant GAPDH kaip vidinę kontrolę. Santykinės IFN ir ISG išraiškos buvo normalizuotos pagal sh-NTC mėginių raišką imitacinėje grupėje, o raukšlių pokyčiai buvo nenormalūs. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) ir ISG56 (G, H). I, J DHCR7-nutildančios U251 (sh-DHCR7) ir sh-NTC U251 ląstelės buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1) arba transfekuotos Poly (I: C) (1 ug/mL) 24 valandas, ISG15, ISG56 ir GAPDH baltymų lygiai buvo nustatyti Western blot metodu. K U251 ląstelės buvo apdorotos nurodyta AY9944 doze 2 valandas, po to 6 valandas užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1). IFN-RNR lygis buvo aptiktas RT-PGR, naudojant GAPDH kaip vidinę kontrolę. L U251 ląstelės buvo apdorotos nurodyta AY9944 doze 2 valandas, o po to 24 valandas užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1). ISG15, ISG56 ir GAPDH baltymų lygis buvo aptiktas Western blot metodu. M U251 ląstelės buvo transfekuotos HA-vektoriumi, HA-DHCR7 arba HA-DHCR7 (G410S) 24 valandas ir užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1) 6 valandas. IFN-RNR lygiai buvo nustatyti RT-PGR, naudojant GAPDH kaip vidinę kontrolę. N U251 ląstelės buvo transfekuotos HA vektoriumi, HA-DHCR7 arba HA-DHCR7 (G410S) 24 valandas, o po to 24 valandas užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1). ISG15, ISG56 ir GAPDH baltymų lygis buvo aptiktas Western blot metodu. Duomenys gauti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų (vidutinis SD) arba reprezentatyvių duomenų (I, J, L, N). Statistinis reikšmingumas apskaičiuojamas naudojant vienpusę ANOVA su Dunnett daugkartinio palyginimo testu (A, B, K, M) arba dvipusę ANOVA su Sidako daugkartinio palyginimo testu (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, standartinis nuokrypis.

5 pav. DHCR7 slopina TBK1 ir IRF3 aktyvaciją. A, B HEK293T ląstelės buvo transfekuotos kartu su TBK1- koduojančia plazmide kartu su DHCR7- ekspresuojančia plazmide arba tuščiu vektoriumi (A). HEK293T ląstelės buvo transfekuotos IRF{10}}koduojančia plazmide, RIG-I koduojančia plazmide, kartu su DHCR{12}}išreiškiančia plazmide arba tuščiu vektoriumi (B). Ląstelės buvo surinktos praėjus 24 valandoms po transfekcijos ir atliktos Western blot su nurodytais antikūnais [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396), anti-HA ir anti-GAPDH ]. C U251 ląstelės buvo transfekuotos nurodyta DHCR7 ekspresuojančios plazmidės arba tuščio vektoriaus doze 24 valandas. Tada ląstelės buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1), surinktos praėjus 6 valandoms po užsikrėtimo, ir atliktos Western blot su nurodytais antikūnais [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 ( S396), anti-HA ir anti-GAPDH]. D U251 ląstelės buvo transfekuotos HA vektoriumi, HA-DHCR7 arba HA-DHCR7 (G410S) 24 valandas. Tada ląstelės buvo užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1), surinktos praėjus 6 valandoms po užsikrėtimo, ir atliktos Western blot su nurodytais antikūnais [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396) , anti-HA ir anti-GAPDH]. E U251 ląstelės buvo apdorotos nurodyta AY9944 doze 2 valandas ir užkrėstos ZIKV (MOI ¼ 1) 6 valandas, tada buvo atlikta Western blot su nurodytais antikūnais [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti. -IRF3, anti-P-IRF3(S396) ir anti-GAPDH]. Duomenys gauti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų ir parodyti kaip reprezentatyvūs duomenys (A–E).

6 pav. ZIKV NS4B sąveikauja su DHCR7, kad slopintų TBK1 ir IRF3 fosforilinimą. A HEK293T ląstelės buvo kartu transfekuotos plazmidėmis, koduojančiomis HA-DHCR7, ir plazmidėmis, koduojančiomis ZIKV nestruktūrinius baltymus (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B ir FLAG-NS5) arba tuščia kontroline plazmide 3. 0 val. Ląstelių lizatai buvo imunoprecipituoti anti-Flag antikūnais, o po to analizuojami imunoblotingu su nurodytais antikūnais. B, C HEK293T ląstelės buvo bendrai transfekuotos plazmidėmis, koduojančiomis HA-DHCR7, plazmidėmis, koduojančiomis FLAG-NS4B, arba tuščia kontroline plazmide 30 val. Ląstelių lizatai buvo imunoprecipituoti anti-HA antikūnu (B) arba anti-FLAG antikūnu (C), o po to analizuojami imunoblotingu su nurodytais antikūnais. D U251 ląstelės buvo transfekuotos FLAG-NS4B plazmide kartu su plazmidėmis, koduojančiomis HA-DHCR7. FLAG-NS4B (žalia), HA-DHCR7 (raudona), branduolio žymeklio DAPI (mėlyna) ir susiliejimo lokalizacija buvo ištirta konfokaline mikroskopija. Mastelio juosta ¼ 10 μm. E ląstelių lizatai iš HEK293T ląstelių, transfekuotų HA-DHCR7, buvo inkubuojami su GST baltymu arba GST-NS4B baltymu, kuris buvo inkubuotas su glutationo-Sepharose granulėmis. Mišiniai buvo aptikti Western blot metodu su anti-HA ir anti-GST antikūnais (viršuje). Lizatai iš transfekuotų HEK293T ląstelių ir išgryninti baltymai buvo aptikti Western blot metodu su anti-HA ir anti-GST antikūnais (apačioje). F U251 ląstelės buvo transfekuotos plazmide, koduojančia FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). Santykiniai DHCR7, FLAG-NS4B ir GAPDH baltymų kiekiai buvo nustatyti Western blot metodu. G, H HEK293T ląstelės buvo transfekuotos kartu su NS4B ekspresuojančia plazmide arba tuščiu vektoriumi, kartu su TBK1-koduojančia plazmide (F), IRF3- ekspresuojančia plazmide ir plazmidėmis, koduojančiomis RIG-I (G). . Ląstelės buvo surinktos praėjus 24 valandoms po transfekcijos ir atliktos Western blot su nurodytais antikūnais [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG ir antiGAPDH ]. I DHCR{83}}nutildančios U251 (sh-DHCR7) ir sh-NTC U251 ląstelės buvo transfekuotos NS4B ekspresuojančia plazmide arba tuščiu vektoriumi. Ląstelės buvo surinktos praėjus 6 valandoms po transfekcijos ir atliktos Western blot su nurodytais antikūnais [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG ir antiGAPDH ]. Duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus.

5. Išvados

Apibendrinant galima pasakyti, kad ankstesnis tyrimas atskleidė, kad cholesterolio metabolizmo fermentas DHCR7 dalyvauja įgimtame imuniniame atsake prieš įvairias virusines infekcijas. Mūsų tyrimas parodė, kad ZIKV NS4B sąveikavo su DHCR7 ir sukėlė DHCR7 ekspresiją. Padidėjęs DHCR7 labai slopina TBK1 ir IRF3 aktyvaciją ir sumažina IFN ir ISG gamybą, o tai palengvina ZIKV infekciją glijos ląstelėse. Šie atradimai atskleidė naują viruso imuninio pabėgimo mechanizmą, pagal kurį ZIKV įveikia imuninį atsaką tiesiogiai nukreipdamas DHCR7 su NS4B.

Nuorodos

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Įgimto imuninio atsako kontrolė mevalonato keliu. Nat. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. Flavivirusų apribojimas. Virol. Nuodėmė. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Transkripcijos faktorius STAT-1 susieja 25-hidroksicholesterolio makrofagų sintezę su interferono antivirusiniu atsaku. Imunitetas 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Guillain-Barre sindromo protrūkis, susijęs su Zikos viruso infekcija Prancūzijos Polinezijoje: atvejis -kontrolinis tyrimas. Lancetas 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I atpažįsta 5' dengės karštligės ir Zikos viruso genomų regionas. Cell Rep. 24, 320–328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolic Zikos viruso perprogramavimas išprovokuoja žmogaus placentos uždegimą. Nat. Komun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Cholesterolio sintezės oksisterolio suvaržymas apsaugo nuo AIM2 uždegiminio aktyvavimo. 171 langelis, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Hepatito C virusas NS4B blokuoja STING ir sąveiką TBK1, kad išvengtų šeimininko įgimto imuniteto. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 m. INMI1 Zikos virusas NS4B antagonizuoja interferono signalizaciją, slopindamas STAT1 fosforilinimą. Virusai 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε ir TBK1 yra esminiai IRF3 signalizacijos komponentai kelias. Nat. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations in the Δ{{ 3}}sterolio reduktazės genas pacientams, sergantiems Smith-Lemli-Opitz sindromu. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaicevas, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3rd, KH, Ruckert, C ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Imunokompetentingos pelės Zikos virusinės infekcijos modelis. Ląstelių šeimininkas mikrobas 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Zikos virusas nukreiptas į žmogaus STAT2, kad slopintų I tipo interferono signalizaciją. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Užsikrėtus Brazilijos Zikos viruso izoliatu, susidaro RIG-I stimuliuojanti RNR, o viruso NS5 baltymas blokuoja I tipo IFN indukciją ir signalizaciją. Euras. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Naujo cholesterolio biosintezės inhibitoriaus (AY 9944) poveikis žiurkės serumo ir audinių steroliams. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Ląstelinio cholesterolio prekyba ir skyrimas. Nat. kun. Mol. Cell Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Skirtingi MDA5 ir RIG-I vaidmenys helikazės atpažįstant RNR virusus. Gamta 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. DHCR7 mutacijos, susijusios su aukštesne vitamino D būkle, leido žmogui anksti migruoti į šiaurines platumas. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Zikos virusas slopina I tipo interferono gamybą ir pasroviui signalizacija. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Zikos viruso patogenezės pelės modelis. Ląstelių šeimininko mikrobas 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Slėpti ir ieškoti: Zikos viruso ir šeimininko imuninio atsako sąveika. Priekyje. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Pasaulinis lipidų žemėlapis apibrėžia tinklą, būtiną Zikos viruso replikacijai. Nat. Komun. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. Kad Zikos virusas galėtų apriboti RIG-I signalizaciją, reikalinga konservatyvi NS5 vieta. Priekyje. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hidroksicholesterolis apsaugo šeimininką nuo Zikos viruso infekcijos ir su juo susijusios mikrocefalijos pelės modelyje. Imunitetas 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Cholesterolio biosintezės inhibitorius blokuoja Staphylococcus aureus virulentiškumą . Mokslas 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferonu indukuojama cholesterolio-25-hidroksilazė plačiai slopina viruso patekimą gamindama 25- 25-hidroksicholesterolį. Imunitetas 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Cholesterolio homeostazės mechanizmai ir reguliavimas. Nat. kun. Mol. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Galutiniai cholesterolio sintezės fermentai DHCR24 ir DHCR7 sąveikauja fiziškai ir funkciškai. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Zikos viruso nestruktūrinis baltymas 4A blokuoja RLR-MAVS signalizaciją. Priekyje. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Molekulinis klonavimas ir žmogaus delta{0}}sterolio reduktazės ekspresija. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Alfa/beta interferono signalizacijos slopinimas flavivirusų NS4B baltymu. J. Virolis. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Interferono signalizacijos slopinimas dengės karštligės virusu. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Pagrindinis ląstelių sterolių reguliavimo kelias reikalingas Andų viruso infekcijai. PLoS Patogas. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Nuolatinė naujų flavivirusų grėsmė. Nat. Microbiol. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: gyvybiškai svarbus fermento perjungimas tarp cholesterolio ir vitamino D gamybos. Prog. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Cholesterolio sukeltas 7-dehidrocholesterolio reduktazės skaidymas pakeičia cholesterolio pusiausvyrą prie vitamino D sintezės. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. Lipidų lašelių metabolizmas dengės karštligės viruso infekcijos metu. Trends Microbiol. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zikos virusas ir apsigimimai – priežastingumo įrodymų peržiūra. N. Engl. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Uždegimas. 25-Hidroksicholesterolis slopina interleukino{2}}sukeliamą uždegimą po I tipo interferono. Mokslas 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zikos virusas NS3 imituoja ląstelę { {2}}surišimo motyvas, stabdantis RIG-I ir MDA{5}}tarpininkaujantį įgimtą imunitetą. Ląstelės šeimininko mikrobas 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Lipidų metabolitų profiliavimas identifikuoja desmosterolio metabolizmą kaip naują antivirusinį hepatito C viruso taikinį. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITMs slopina Zikos viruso replikaciją. Cell Rep. 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferonu stimuliuojami genai: sudėtingas šeimininko gynybos tinklas. Annu. Rev. Immunol. 32, 513–545.