Iš Cistanche Deserticola išskirtų oligosacharidų sudėties analizė ir imunologinis aktyvumas

Susisiekite: emily.li@wecistanche.com

Abstraktus.Oligosacharidas (CDOS) buvo gautas išCistanche deserticolaekstrahuojant šarmu (pH{0}}), nusodinant etanoliu ir frakcionuojant Sephadex G-100 į dvi išgrynintas frakcijas (ty CDOS-1 ir CDOS-2). ir Sephadex G-25 kolonėlės filtravimo chromatografija. CDOS monosacharidų sudėtis buvo ištirta didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC). Nustatyta, kad CDOS-1 buvo sudarytas tik iš sacharozės, o CDOS-2 daugiausia sudarytas iš sacharozės, ramnozės ir manitolio, o molinis santykis buvo 1:0,73:3,61. Imunologiniai tyrimai parodė, kad CDOS turėjo reikšmingą poveikį pelės blužnies indeksui, padidindamas makrofagų fagocitozės aktyvumą ir stimuliuodamas antikūnus gaminančių ląstelių proliferaciją. Tikimasi, kad CDOS bus išvystytas į funkcinį maistą ar vaistus.

Raktiniai žodžiai:Cistanchedeserticola, oligosacharidas, gryninimas, sudėtis, imunologinė veikla.

Cistanche deserticola turi daug efektų, spustelėkite čia, kad sužinotumėte daugiau

1. Įvadas

Cistanchedeserticola YCMa. (Orobanchaceae šeima) yra trumpas parazitinis augalas, kilęs iš šiaurės vakarų Kinijos. Visas džiovintas augalas (be žiedų) yra žinomas kaip tonikas ir vadinamas "Rou Congrong". Rytietiškoje medicinoje jis klasifikuojamas kaip saldus ir sūrus skonis, šiltas, priskiriamas inkstų ir storosios žarnos kanalams. funkcijagaivinantisįinkstasir papildo esenciją, drėkina žarnyną ir atpalaiduoja vidurius [1]-[3]. Šiuolaikinis farmakologinis tyrimas parodė, kad jis gali paskatinti DNR sintezę ir sulėtinti senatvės procesą, padidinti antioksidacinį poveikį [4], užkirsti kelią ir gydyti širdies ir kraujagyslių ligas [3]. Be to, tai taip pat gali sukelti analgetiką iranti-uždegiminispoveikis [5], gerina mokymąsi ir atmintį, skatindamas nervų augimo faktorius [6]. Kai kurie tyrimai parodė, kad C. deserticola ekstraktai gali suaktyvinti pelių intraabdominalinių makrofagų fagocitinę funkciją [7]–[9] irsustiprintikūnas's imunitetas[10]. Remiantis ankstesniais tyrimais, šiame augale yra daug aktyvių sudedamųjų dalių, įskaitant feniletanoidinius glikozidus, iridoidus, lignanus, sacharidus, alkaloidus ir kt. [11] Kaip C.deserticolafeniletanoidasglikozidaiir polisacharidai yra pripažinti pagrindiniais aktyviais komponentais, per pastaruosius dešimtmečius daugybė tyrimų buvo sutelkti į jų struktūras ir biologinį aktyvumą [12]–[17]. Kalbant apie vertingus oligosacharidusC. deserticola, ataskaitų yra gana nedaug. Oligosacharidai, trumpos grandinės sacharidai, kurių sudėtyje yra homo- arba heterocukrų, yra gerai žinomi dėl savo teigiamo poveikio žmogaus gyvenimui ir buvo plačiai naudojami ilgą laiką [18]. Funkciniai oligosacharidai, turintys fiziologinę funkciją, pavyzdžiui, mažą kariogeniškumą ir bifidobakterijų augimo faktorių [19], gerina žmonių ir gyvūnų sveikatą. Jie buvo naudojami kaip maisto ingredientas. Pastaruoju metu buvo pranešta apie naujas oligosacharidų funkcijas, kurios turi galimybę moduliuoti žmonių, gyvūnų ir žuvų imuninę sistemą [20]. Šiame darbe pateikiame pirmąją tyrimo programos rezultatų dalį – frakcionavimą. visų oligosacharidų, gautų iš C. deserticola šarminio ekstrakto ultrafiltracijos ir gelinio pralaidumo chromatografijos deriniu būdu, ir jų sudėties analizė naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją (HPLC). Be to, mes taip pat pristatome C. deserticola oligosacharidų imunologinę veiklą. Mūsų žiniomis, paskelbta nedaug pranešimų apie imunostimuliuojančios veiklos tyrimusC. deserticolaoligosacharidai.

2. Eksperimentinis

2.1. Medžiagos

C. deserticola buvo auginama ir surinkta iš Alxa League (Vidinė Mongolija, Kinija). Kunmingo pelės (II laipsnis, šešių savaičių amžiaus) buvo įsigytos iš Vidinės Mongolijos universiteto Farmakologijos eksperimentinio centro. Sephadex G-100, Sephadex G-25, trifluoracto rūgštis (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolonas (PMP), D-gliukozė, D- galaktozė, D-fruktozė, D-ksilozė, D-manozė, D-galakturono rūgštis, D-gliukurono rūgštis, sacharozė, ramnozė, manitolis, fukozė, ramnozė buvo įsigytos iš Sigma (St. Louis, MO, JAV). Vidutinis RPMI{12}} buvo įsigytas iš Gibco Invitrogen Co. (San Diegas, CA, JAV). Visos kitos cheminės medžiagos buvo analitinės kokybės.

2.2. Oligosacharidų ekstrahavimas

Išdžiovinti C. deserticola kūnai buvo supjaustyti į mažesnius gabalėlius ir toliau sumalti į miltelius malūnu, ekstrahuoti bevandeniu etanoliu (3 × 5000 ml) 70 laipsnių temperatūroje 3 valandas atmosferos slėgyje. Lipidams pašalinti buvo pritvirtintas grįžtamasis kondensatorius. Likusios liekanos buvo ekstrahuojamos šarmu (pH{4}}) 60 laipsnių temperatūroje 3 kartus (kiekvieną kartą po 2 val.). Po centrifugavimo (2000 g 15 min., 20 laipsnių temperatūroje), supernatantas sukoncentruotas iki dešimtosios tūrio rotaciniame garintuve sumažintame slėgyje 50 laipsnių temperatūroje ir filtruojamas. Tada filtratas buvo deproteinizuotas naudojant Sevag reagentą [21] ir pašalintas aktyvuota anglimi.

2.3. Oligosacharidų išskyrimas ir gryninimas

Liofilizuoti neapdoroti oligosacharidai buvo ištirpinti distiliuotame vandenyje, centrifuguoti, o po to supernatantas buvo išgrynintas Sephadex G -100 kolonėle (1 × 50 cm), subalansuota itin grynu vandeniu. Įdėjus mėginį, kolonėlė buvo eliuuojama itin grynu vandeniu 5 ml/min srauto greičiu. Įvairios frakcijos buvo renkamos naudojant mėgintuvėlius. Bendras angliavandenių kiekis kiekviename mėgintuvėlyje buvo išmatuotas esant 490 nm fenolio-H2SO4 metodu [22]. Vandeniu išplautas tirpalas buvo padalintas į dvi frakcijas CDOS{10}} ir CDO-2. Dvi frakcijos buvo atitinkamai išgrynintos Sephadex G-25 kolonėlėje (2,7 × 85 cm), naudojant ypač gryną vandenį (1 ml/min srauto greičiu). Surinkus išgrynintą frakciją, ji buvo liofilizuota.

2.4. Monosacharidų sudėties analizė

CDO monosacharidų sudėtis buvo nustatyta HPLC analize. CDO (2 mg) pirmiausia buvo hidrolizuojami bevandeniu metanoliu, turinčiu 2 M HCl, 80 laipsnių temperatūroje 16 valandų azoto atmosferoje, o po to 2 M TFA 120 laipsnių temperatūroje 1 valandą. Po to, kai TFA buvo pašalintas išgarinant, hidrolizatai vėliau buvo derivatizuoti su PMP pagal aprašytą metodą [23] ir analizuojami HPLC. HPLC atskyrimas atliktas naudojant EF-2002 HPLC sistemą (KNAUER įmonė, Vokietija). PMP dariniai buvo chromatografuoti naudojant Sugar-PAK tūrį (6,5 × 300 mm, vandens įmonės stiklai, Amerika), o absorbcija buvo išmatuota esant 245 nm. Įpurškimo tūris buvo 20 µL, o judrioji fazė, sudaryta iš PBS (tirpiklis A) ir acetonitrilas (tirpiklis B), buvo naudojama izokratiniam eliuavimui, esant 82 procentų (A) ir 18 procentų (B) tūrio santykiui. Bendras HPLC veikimo laikas buvo 40 min., o srautas 0,5 ml/min.

2.5. Imunobiologinė veikla

2.5.1. Monocitų-makrofagų fagocitinė funkcija

Šešiasdešimt Kunmingo pelių (II laipsnio, šešių savaičių amžiaus) buvo įsigytos iš Vidinės Mongolijos universiteto Farmakologijos eksperimentinio centro ir prieš naudojimą buvo aklimatizuotos 1 savaitę. Visos pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes, kurias sudarė fiziologinio tirpalo kontrolinė grupė, didelės CDO dozavimo grupės, vidutinės dozės grupės ir mažų CDO dozių grupės. Pelėms buvo švirkščiama į pilvaplėvės ertmę 0,5 ml oligosacharidų tirpalo kartą per dieną 5 dienas. Didelės, vidutinės ar mažos CDO dozių grupė gavo atitinkamai 10{{10}}, 50 arba 25 mg/kg/kg kūno svorio CDO; ir kontrolinei grupei buvo suleista 0,5 ml fiziologinio tirpalo. Septintą dieną, remiantis Hou [24], buvo atliktas anglies dalelių klirenso eksperimentas, išmatuotas blužnies indeksas ir užkrūčio liaukos indeksas. Trumpai tariant, 0, 05 ml / 10 g / bw Indijos rašalo buvo įšvirkščiama į kiekvieną pelę per vena caudalis, tada 3 ir 7 minutes po injekcijos iš vena orbitalis posterior buvo paimta 20 μl kraujo. Kraujo mėginiai buvo patalpinti į mėgintuvėlius su 2 ml 0,1 procento Na2CO3, o OD vertės buvo išmatuotos esant 600 nm. Klirenso indeksas (K), fagocitinis indeksas ( ) ir imuninių organų indeksas buvo apskaičiuoti taip (1), t2 ir t1 reiškia atitinkamai 7 minutes ir 3 minutes.

2.5.2. Antikūnus gaminančių ląstelių proliferacija

Kunmingo pelių grupės (penkios vienoje grupėje) buvo imunizuotos intraperitonine injekcija 2 x 107 SRBC į 1,0 ml PBS, pridėjus 50 ug tiriamosios medžiagos (kontrolinėje grupėje nebuvo). Po savaitės Kunmingo pelių splenocitai (106 ląstelės 2 ml viename šulinyje) buvo kultivuojami su tiriamosiomis medžiagomis arba be jų 72 valandas 10% RPMI 1640 terpėje, esant 5% CO2 ore, po tris kiekvienos kultūros egzempliorius. Nustatytas PFC prieš SRBC skaičius 106 splenocitams [25], [26].

2.6. Statistinė analizė

Duomenys buvo išreikšti kaip vidutinės vertės ± SD. Skirtumas tarp tiriamųjų grupių ir kontrolinės grupės buvo analizuojamas Stjudento t-testu. P < 0.05="" buvo="" laikomas="">

3. Rezultatai ir aptarimas

3.1. Oligosacharidų išskyrimas ir gryninimas

CDO buvo išskirtos iš džiovintų C. deserticola kūnų šarminio ekstrakto, išeiga 3.07 proc. Dvi CDOS-1 ir CDOS-2 frakcijos buvo išskirtos atitinkamai iš distiliuoto vandens eliuto naudojant Sephadex G-100 kolonėlę (1 pav.). Išgrynintos CDOS-1 ir CDOS-2 frakcijos parodė vieną smailę Sephadex G-25 stulpelyje, o tai rodo, kad mėginyje nebuvo jokių kitų oligosacharidų. Monosacharidų kompozicijų rezultatai parodė, kad CDOS-1 buvo sudarytas tik iš sacharozės (2 pav.), o CDOS-2 daugiausia sudarytas iš sacharozės, ramnozės ir manitolio (3 pav.), kurių molinis santykis. iš 1:0,73:3,61.

3.2. CDO imunobiologinė veikla

Daug įrodymų in vivo ir in vitro parodė, kad natūralūs oligosacharidai, stimuliuodami ir ląstelinį, ir humoralinį, atliko imunomoduliuojančią funkciją.imuninis atsakymus[27], [28]. Šiame dokumente 100 mg/kg/kg kūno svorio CDO padidino pelės blužnies indeksą, bet reikšmingų skirtumų tarp gydytų ir kontrolinių grupių užkrūčio liaukos indeksas nebuvo (1 lentelė). Makrofagai yra svarbus šeimininko apsaugos nuo virusinės infekcijos komponentas, nes slopina intracelulinę virusų replikaciją ir naikina virusu užkrėstas ląsteles [29]. Kai jie aktyvuojami, iš makrofagų išsiskiria įvairūs deguonies arba azoto tarpiniai produktai ir citokinai, kurie dalyvauja įvairiose svarbiose biologinėse funkcijose, tokiose kaip priešuždegiminė ir priešnavikinė veikla [30]–[32]. Todėl makrofagų fagocitinis aktyvumas yra svarbus organizmo imuninių funkcijų rodiklis. Šiame tyrime vidutinės ir didelės CDO dozės padidino makrofagų fagocitozės aktyvumą (1 lentelė). CDO sukelta antikūnus gaminančių ląstelių proliferacija buvo tiriama tiriant hemolizinio PFC padidėjimą Kunmingo pelių, kurios buvo imunizuotos SRBC ir tiriamuoju mėginiu, blužnyje. Rezultatai parodė, kad vidutinės ir didelės CDO dozės žymiai padidina antikūnus gaminančių ląstelių proliferaciją (2 lentelė). Didelės CDO dozės labai reikšmingai padidino PFC skaičių (P <>

Nuorodos

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Mišraus biologinio signalo atpažinimas remiantis bangų analize. In: Y. Jiang ir kt. (red.). Proc. JK ir Kinijos sporto inžinerijos dirbtuvės. Liverpulis: Pasaulio akademinė sąjunga. 2007, p. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao ir kt. Retųjų žemių elementų poveikis Cistanche deserticola ląstelių augimui ir feniletanoidinių glikozidų gamybai. JB io-technol, 2003, 102 (2): 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian ir kt. Naujas natūralus produktas iš Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioksidacinis Cistanche glikozidų poveikis pelių audiniuose. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRAN Antinociceptinis ir priešuždegiminis aktyvumas, kurį sukelia Cistanche deserticola graužikams. J Etnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Mėnulis, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kimas, SY; O, MS Cistanches Herba skatina mokymąsi ir atmintį, skatindama nervų augimo faktorių. Elgesio smegenų tyrimas. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Cistanche deserticola YC Ma ir C, tubulosa (Shenk) Wight palyginimas apie kai kuriuos farmakologinius veiksmus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ ir kt. C. deserticola lytinio potencijos didinimo tyrimas. J Chin Med. 1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL ir kt. Cistanche deserticola YC Ma ir C.tubulosa svorio palyginimas dėl kai kurių farmakologinių veiksmų. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Cistanche deserticola YC Ma polisacharido imunomoduliuojantis poveikis. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Cistanche cheminių sudedamųjų dalių ir medicininės veiklos tyrimų pažanga. Kinijos laukinių augalų ištekliai, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Feniletanoidinių glikozidų išskyrimas ir identifikavimas iš Cistanche deserticola. Nat Prod R&D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Feniletanoidinių glikozidų nustatymas Cistanche deserticola makroretikulinės dervos spektrofotometrija. Nat Prod R&D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T ir kt. Azoto oksido slopinimas feniletanoidais aktyvuotuose makrofaguose.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan ir kt. Vandenyje tirpaus polisacharido SPA, išskirto iš Cistanche Deserticola Ma stiebo, struktūrinė analizė. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Cistanche deserticola polisacharidų imuninės farmakologijos ir absorbcijos tyrimas. 2011, Nr.S1, Medicina ir sveikatos mokslai, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Cistanche deserticola feniletanoidų hepatoprotekcinis aktyvumas. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Amilazių ir susijusių fermentų vadovas (sud. Japonijos amilazės tyrimų draugija), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (red.) 5-osios konferencijos dėl dantų ėduonies ir susiejimo cukraus (japonų k.) medžiaga, Nacionalinis sveikatos institutas, Tokijas (1980 m.)

[20] Kodo Otaka. Funkcinis oligosacharidas ir jo naujas aspektas kaip imuninis moduliavimas. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polisacharidai iš karšto vandens skrudintų Coffea arabica pupelių ekstraktų: išskyrimas ir apibūdinimas. Angliavandeniai. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrinis cukrų ir susijusių medžiagų nustatymo metodas. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Angelica polisacharidų monosacharidų komponentų analizė naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją. Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan ir kt. Lektino ištraukimas ir išgryninimas iš raudonųjų pupelių ir preliminarūs lektino ir keturių Kinijos žolelių polisacharidų imuninės funkcijos tyrimai. Biomedicinos ir biotechnologijų žurnalas, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ ir A. Szenberg. Tolesnis apnašų metodo, skirto atskirų antikūnus formuojančių ląstelių aptikimo, patobulinimas. Immunology.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura ir kt. Porino frakcijos, išskirtos iš Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J], imunobiologinis aktyvumas. Infekcija ir imunitetas. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Imunomoduliuojantis CVT-E002 aktyvumas: patentuotas Šiaurės Amerikos ženšenio (Panax quinque folium) ekstraktas. J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Trijų mitogeninių ir komplementą fiksuojančių elementų struktūros ir struktūros bei aktyvumo ryšiai pektinių arabinogalaktanų iš Malio priešopinių augalų Cochlospermum tinctorium A. Rich ir Vernonia kotschyana Sch Bip. buvęs Walpas. Biomakromolekulės. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim ir J.-K. Hwang, Arabinogalaktano ir fukoidano imunomoduliuojantis aktyvumas in vitro. Medicininio maisto žurnalas. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian ir kt. Keturių vandenyje tirpių Angelica Sinensis frakcijų imunoreguliacinio aktyvumo įvertinimas ir palyginimas in vitro ICR pelių pilvaplėvės makrofaguose. Tarptautinė imunofarmakologija. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park ir kt. Vandeniu ekstrahuoto Astragali radikso priešuždegiminė citokinų geno ekspresija ir azoto oksido reguliavimas RAW 264.7 makrofagų ląstelėse. Etnofarmakologijos žurnalas. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee ir YJ Jeon. Polisacharidas, išskirtas iš Poria cocos sclerotium, sukelia NF-κB / Rel aktyvaciją ir iNOS ekspresiją pelių makrofaguose. Tarptautinė imunofarmakologija. 2003, 3(10-11):1353–1362.