Daugiafunkcinio kosmetinio kremo kūrimas naudojant Streptomyces bioaktyvias medžiagas

Ram Hari Dahal1 , Tuan Manh Nguyen1,2, Dong Seop Shim3, Joon Young Kim4, Jangyul Lee4 ir Jaisoo Kim1,*

Santrauka:Įvairios kosmetikos priemonės, turinčios vieną funkciją, vis dažniau naudojamos, tačiau daugiafunkcinės kosmetikos priemonės išlieka ribotos. Siekėme sukurti daugiafunkcį kosmetinį kremą, turintįantioksidantas, antitirozinazės, anti-senėjimo ir antimikrobinė veikla. Antimikrobinė veikla buvo atliekama disko difuzijos metodu. Ląstelių toksiškumas ir ląstelių proliferacija buvo įvertinti 96-šulinėlių plokštelėje su skirtingomis ląstelių linijomis, tokiomis kaip HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 ir B16F10. Buvo įvertintas grybų tirozinazės slopinimas, elastazės slopinimas ir 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalų šalinimo aktyvumas ir apskaičiuotas IC50. Mezoporinė silicio dioksido dalelė buvo susintetinta naudojant Pluronic P123 ir tetraetilo ortosilikatą (TEOS). Veido nuotraukas užfiksavo VISIA-CR (klinikinių tyrimų veido vaizdavimo sistema). Vaizdo šiurkštumas buvo analizuojamas PRIMOS programine įranga, o vaizdo ryškumas – Chromameter CR-400. Neapdorotas T65 padermės produktas slopino įvairias žmogaus patogenines bakterijas, tokias kaip Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ir Staphylococcus epidermidis. T65 neapdoroto produkto IC50 grybų tirozinazės, elastazės ir DPPH radikalų šalinimo aktyvumui buvo atitinkamai 58,73, 14,68 ir 6,31 ug/ml. T65 neapdorotas produktas padidino I tipo kolageną CCD-986Sk ląstelėse iki 145,91 proc. ± 9,11 proc. (vidurkis ± SD; vidurkis 24, 48 ir 72 val.), esant 250 pg/ml. Susintetintos mezoporinės dalelės (SBA-15) patvirtino tvarų veikimą kontroliuojant atleidimą tris dienas. Funkcinis kosmetinis kremas, kurio sudėtyje yra T65 įterpto SBA-15, žymiai sumažino odos šiurkštumą 4,670 proc. ir padidino odos šviesumą 0,472 proc. po 4 savaičių naudojimo. Neapdorotas T65 produktas slopino ir gramteigiamus, ir gramneigiamus patogenus. Susintetinta mezoporinė dalelė SBA-15 patvirtino, kad fiziologiškai aktyvi medžiaga buvo išleista tvaraus atpalaidavimo sąlygomis. T65 neapdorotas produktas buvo nepriekaištingas antimikrobinis,antioksidantas, senėjimą stabdančios ir balinančios veiklos, turinčios necitotoksinį poveikį skirtingoms ląstelių linijoms, susijusioms su žmogaus oda.

Raktiniai žodžiai: antioksidantas; citotoksiškumas; antitirozinazė; kovoti su senėjimu; antimikrobinis; mezoporinės silicio dioksido dalelės; kosmetikos preparatai; estetinis pritaikymas

cistanche prarastos imperijos žolelėstaip pat turi aodos balinimo efektas.

1. Įvadas

Oda yra didžiausias organas ir išorinis žmogaus kūno sluoksnis. Odos išvaizda leidžia įvertinti amžių, lytį, sveikatą, patrauklumą ir grožį [1,2]. Kosmetikos gaminiai plačiai naudojami siekiant pagerinti odos išvaizdą ir sumažinti odos senėjimą. Be to, vietinis kosmetikos naudojimas parodo, kaip padidinti patrauklumą manipuliuojant grožio veiksniais, susijusiais su veido kontrastu [3,4]. Kosmetikos pramonė nuolat ieško naujų ir natūralių bioaktyvių medžiagų, turinčių senėjimą stabdančių, antioksidacinių, antitirozinazės ir antimikrobinių savybių, skirtų kosmetikos preparatams, siekiant pagerinti odos priežiūros metodus [5,6].

Odos senėjimas yra sudėtingas biologinis procesas, kurį sukelia įvairūs vidiniai ir išoriniai veiksniai, sukeliantys fiziologinius sutrikimus ir struktūrinio odos vientisumo praradimą. Vidinis senėjimas, paprastai žinomas kaip natūralus odos senėjimas (chronologinis senėjimas), yra susijęs su hormoniniais pokyčiais pagal amžių, o išorinis senėjimas yra susijęs su raumenų judėjimu, tarša, nikotinu, saulės spindulių poveikiu, kofeinu, temperatūra, gyvenimo būdu, pvz. kaip dieta (mityba), miego trūkumas, stresas ir kitos sveikatos sąlygos [7–9]. Elastinas padeda odai grįžti į pradinę padėtį po judėjimo, o acinarinėse ląstelėse gaminama elastazė skaido elastiną ir skatina odos senėjimą [9]. Anti-elastazė slopina elastazę ir išlaiko elastiną pradinėje būsenoje, o tai neleidžia odai senti. Kosmetikos ar odos priežiūros produktai, turintys senėjimą stabdančių savybių, teigiamai veikia odos senėjimą [10–13].

Laisvieji radikalai dažniausiai susidaro vykstant ląstelių metabolizmui. Reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) ir reaktyvios azoto rūšys (RNS), tokios kaip anijonų radikalas, superoksidas, peroksidas, hidroksilo radikalas, azoto oksidas (NO), peroksinitritas ir hipochloro rūgštis, yra atsakingi už oksidacinę žalą ląstelėms, lipidams, baltymams, ir DNR, sukeliančios aterosklerozę, kancerogenezę, širdies ir kraujagyslių ligas, ląstelių senėjimą, lėtinį uždegimą, diabetą, hipertenziją, mutagenezę, neurodegeneracijas, reumatoidinį artritą, insultą, septinį šoką ir kitas degeneracines ligas [7,14–17]. Antioksidantai užkerta kelią baltymų oksidacijai ir ROS bei RNS susidarymui, kurie gali sumažinti laisvųjų radikalų žalą normaliems audiniams, kovodami su oksidaciniu stresu [17–19].

Oda gamina tamsų pigmentą, žinomą kaip melaninas. Melanino gamyba apsaugo odą nuo UV spindulių sukeltų pažeidimų [9]. Tačiau per didelė melanino gamyba ir kaupimasis sukelia odos hiperpigmentaciją, dėl kurios atsiranda estetinių komplikacijų, tokių kaip melasma, strazdanos, senatviniai lentiginiai, nevus ir epelis [9, 20]. Tirozinazė yra glikoproteinas, randamas melanosomų membranose, kurios yra atsakingos už melanino biosintezę hidroksilinant l-tirozinazę į 3,4-dihidroksifenilalaniną (l-DOPA) ir vėliau l-DOPA oksiduojant į dopachinoną [21]. Dėl spontaniškos polimerizacijos dopachinonas galiausiai virsta melaninu [22]. Norint išlaikyti odos vientisumą, reikia kontroliuoti melanino perteklių. Štai kodėl naujų tirozinazės inhibitorių atradimas kosmeceutinių preparatų kūrimui sulaukė didelio susidomėjimo [23–25].

Antimikrobiniai konservantai dedami į kosmetikos gaminius, kad būtų išlaikytas mikrobiologinis grynumas per visą jų naudojimo laikotarpį [26]. Vietoj kosmetikos konservantų, tokių kaip metilparabenas, natūralūs antimikrobiniai junginiai, turintys kitas funkcijas, yra geresni ir naudingesni žmonių sveikatai [27–29]. Antriniai metabolitai, išskirti iš bakterijų išteklių, gali turėti ir konservuojančių, ir antimikrobinių savybių, kurios slopina bakterinių patogenų (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis ir Staphylococcus aureus) kolonizaciją odoje [9,26,28].

Dirvožemio ar jūros bakterijų, ypač aktinobakterijų, gaminami biologiškai aktyvūs junginiai yra neišnaudoti ir vis dar neištirti [23,30]. Įvairūs bioaktyvūs junginiai, naudojami kosmetikos ir kosmetikos pramonėje, įskaitant tuos, kurie turi senėjimą stabdančių, antioksidacinių, antitirozinazės, antimikrobinių ir necitotoksinių savybių, turi didelį potencialą naujam panaudojimui.

Yra daug tyrimų apie bioaktyvias medžiagas, išskirtas iš augalų, kurios šiuo metu naudojamos kosmeceutinėse kompozicijose, tačiau yra labai mažai tyrimų apie bioaktyvias medžiagas iš bakterijų [9,21,24–27,31]. Šiuo tyrimu buvo siekiama įvertinti etilacetato ekstraktų iš bakterijų padermės Streptomyces sp. T65 skirtas antioksidacinei, anti-senėjimo, antitirozinazės ir antibakterinei veiklai bei bet kokiam citotoksiniam poveikiui skirtingoms pelių ir žmogaus ląstelių linijoms. Be to, siekėme susintetinti mezoporines silicio dioksido daleles. Galiausiai, pagrindinis šio tyrimo tikslas buvo sukurti galutinį kosmetikos gaminį vietiniam naudojimui naudojant bioaktyvią medžiagą, išgautą iš dirvožemio mikroorganizmų.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Reagentai, ląstelių linijos ir įranga

Visi naudojami tirpikliai buvo analitinės kokybės. B16-F10 melanomos ląstelių linija, B16-F1 pelių melanomos ląstelių linija ir žmogaus keratinocitų ląstelių linija (HaCaT) buvo įsigytos iš American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, JAV). Dulbecco modifikuota Eagles terpė (DMEM), penicilinas-streptomicinas ir karščiu inaktyvuotas galvijų vaisiaus serumas (HI FBS) buvo įsigyti iš Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Seulas, Pietų Korėja). Ląstelių skaičiavimo rinkinys-8 (CCK-8) buvo įsigytas iš Dojindo (Kumamoto, Japonija). Pelės makrofagų ląstelių linija RAW264.7 ir CCD{10}}Sk žmogaus fibroblastai buvo įsigyti iš Korean Cell Line Bank (Seulas, Pietų Korėja). Lipopolisacharidas (LPS, Escherichia coli, serotipas O11:B4), sulfanilamidas, naftiletilendiamino dihidrochloridas, grybų tirozinazė, kiaulių kasos elastazė, l-tirozinas, askorbo rūgštis, arbutinas, N-Succ-(Ala){16}}p-nidas , 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), I tipo kolagenas, Tween 20, tetrametilbenzidinas (TMB) ), tetraetilortosilikatas (TEOS), plurono P-123 (poli(etilenglikolio)-bloko-poli(propilenglikolio)-bloko-poli(etilenglikolio); PEG-PPG-PEG) ir -melanocitų -stimuliuojantis hormonas (-MSH) buvo nupirktas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilas (DPPH) ir oleanolio rūgštis buvo įsigyti iš Aldrich (St. Louis, MO, JAV). COL1A1 (kolagenas, I tipo, alfa 1) pirminis antikūnas ir antrinis antikūnas, konjuguotas su HRP (krienų peroksidaze), buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). SpectraMax 340PC384 mikroplokštelių skaitytuvas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV) buvo naudojamas 96-šulinėlių plokštelių skaitymui.

2.2. Patogeninės bakterijų padermės

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 ir Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 buvo įsigyti iš Korėjos žemės ūkio kultūros kolekcijos (KACC, Jeonju, Pietų Korėja); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 ir Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 buvo gauti iš Korėjos aplinkos mikroorganizmų banko (KEMB, Suvonas, Pietų Korėja); ir Propionibacterium acnes KCTC 3314 buvo įsigytas iš Korėjos tipų kultūrų kolekcijos (KCTC, Jeongeup, Pietų Korėja).

2.3. Izoliavimas ir išsaugojimas

Įvairūs dirvožemio mėginiai buvo paimti iš rekultivuotų pievų Hwaseonge (37◦16′10" N 126◦45'43" E) ir Kyonggi universiteto miško (37◦18'1" N 127◦2'20" E) Korėjoje. Bakterijos buvo išskirtos naudojant anksčiau aprašytą metodą [9]. Kolonijos buvo išmargintos ant R2A plokštelių kas 1 savaitę trumpalaikiam konservavimui ir laikomos –80 ◦C temperatūroje kaip suspensija R2A sultinyje, papildytame 20 procentų (t/v) glicerolio ilgalaikiam konservavimui.

2.4. Izoliuotų padermių atranka, identifikavimas ir filogenetinė padėtis

Išskirtų padermių kosmetikos ir antimikrobinio aktyvumo patikra buvo baigta, kaip aprašyta anksčiau [9]. Funkcijos turinčios bakterijos buvo identifikuotos naudojant 16S rRNR genų seką. Genominė padermių DNR buvo išskirta naudojant InstaGene Matrix rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV), o 16S rRNR genas amplifikuotas PGR, naudojant universalų bakterijų pradmenį 27F ir 1492R [32]. PGR produktas buvo išgrynintas daugiaekrane filtro plokštele (Millipore Corp., Bedfordas, MA, JAV) ir sekvenuotas naudojant Applied Biosystems 3770XL DNR analizatorių, naudojant BigDye Terminator ciklo sekos nustatymo rinkinį v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Beveik visa seka atitiko SeqMan programinę įrangą (DNASTAR Inc., Madison, WI, JAV). Artimiausia izoliuotų funkcinių padermių padermė buvo nustatyta naudojant EzBioCloud [33] ir NCBI GenBank duomenų bazę [34]. Susijusios 16S rRNR sekos buvo gautos iš GenBank, o filogenetinė analizė atlikta naudojant MEGA7 [35].

2.5. Bakterijų kultūra

P. acnes buvo auginamas inkubuojant 3–4 dienas 37 ◦C temperatūroje anaerobiniame Schaedler anaerobiniame sultinyje (Oxoid). Anaerobinei kultūrai buvo naudojamas BBL anaerobinis stiklainis su GasPak EZ dujų generavimo konteinerių sistema (Becton Dickinson, NJ, JAV). S. epidermidis ir S. aureus buvo auginami TSB (Tryptic soy broth) terpėje (Oxoid) 37 ◦C temperatūroje 24 valandas aerobiškai. E. coli, P. aeruginosa ir B. subtilis buvo auginami LB (Luria-Bertani) (Oxoid) terpėje. Izoliuotos bakterijų padermės buvo kultivuojamos R2A 28 ◦ C temperatūroje 4–5 dienas.

2.6. Fermentacija

Fermentacijos procesui inokuliatas buvo ruošiamas R2A sultinyje 28 ◦ C temperatūroje 4–5 dienas 150 val. T65 padermė buvo fermentuojama naudojant 1–2 procentų inokuliatą ISP2 (International Streptomyces Project 2) terpėje 28 ◦ C temperatūroje 1 savaitę 140 val.

2.7. Ištraukimas

Surinktas sultinys buvo centrifuguojamas 11 305 × g greičiu 20 minučių 4 °C temperatūroje su didelės talpos centrifuga 1736R (LABOGENE, Seulas, Korėja). Kultūros supernatantas buvo filtruojamas naudojant 150 mm dydžio filtravimo popierių (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, JK), kad būtų pašalintos ląstelių liekanos, ir sukoncentruotas sukamuoju garintuvu 40 ◦C temperatūroje. Tada koncentruotas neapdorotas produktas buvo ekstrahuojamas du kartus vienodu tūriu, naudojant penkis skirtingus tirpiklius (n-heksaną, dietilo eterį, dichlormetaną, chloroformą ir etilo acetatą). Nustatyta, kad etilo acetatas yra geriausias tirpiklis, todėl tolimesnės analizės buvo atliekamos naudojant etilo acetato ekstraktą. Organinis sluoksnis atskiriamas dalijamuoju piltuvu ir išgarinamas iki sausumo. Galiausiai, džiovintas neapdorotas produktas buvo ištirpintas metanolyje tolesniam vertinimui.

cistanche ekstraktas

2.8. Aktyvių frakcijų rinkimas paruošiamuoju HPLC (prep-HPLC)

Neapdoroto T65 kultūros ekstrakto aktyvios frakcijos buvo surinktos naudojant preparatinį HPLC (Agilent 1200 serija). Kaip stacionari fazė buvo naudojama 15 μm dalelių dydžio atvirkštinė kolonėlė su sandarikliu PREP-ODS (K) C18 (30 mm id × 25 cm). Mobiliajai fazei buvo naudojamas 0,1 % HCHOOH vanduo (tirpiklis A) ir acetonitrilas (tirpiklis B). Tirpiklio B koncentracija buvo nuo 10 procentų iki 100 procentų nuo 0 min iki 60 min. ir 100 procentų nuo 60 min iki 75 min. Srauto greitis buvo 15 ml/min. Daugiabangis detektorius (MWD) buvo naudojamas su 208, 230, 254 ir 280 nm. Surinktos frakcijos nuo 14 min. iki 21 min. buvo išgarintos iki sausumo ir ištirpintos metanolyje (neapdorotas T65 produktas) tolesniam įvertinimui.

2.9. HaCaT ląstelės ląstelių gyvybingumas

HaCaT ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant CCK-8 (ląstelių skaičiavimo rinkinio-8) tyrimą pagal gamintojo instrukcijas. HaCaT ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių lėkštes po 104 ląsteles viename šulinyje ir po to 24 valandas inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje Dulbecco modifikuotoje Eagles terpėje (DMEM), turinčioje 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS). Ląstelės buvo apdorotos skirtingų koncentracijų neapdorotu T65 produktu (10 mg/ml, 1 mg/ml, 100 ug/mL, 10 ug/mL, 1 ug/mL, 100 ng/ml ir 1 ng/mL) ir inkubuojamos. kambario temperatūroje 2 valandas drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2, pridedant 10 μL CCK-8 reagento. Reakcijos mišinio absorbcija buvo išmatuota mikroplokštelės spektrofotometru esant 450 nm ir apskaičiuotas ląstelių gyvybingumo procentas.

2.10. Antioksidacinės veiklos įvertinimas

2.10.1. Toksiškumo įvertinimas RAW264.7 ląstelėse

RAW264.7 ląstelės buvo laikomos DMEM, kuriame buvo 10 procentų FBS, 100 V/mL penicilino ir 100 ug/ml streptomicino, 37 ◦C temperatūroje 5 procentų CO2 inkubatoriuje. RAW264.7 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokščiadugnę mikrotitravimo plokštelę, kurios tankis 104 ląstelės duobutėje su skirtingomis koncentracijomis (0–1 mg/mL) neapdoroto T65 produkto ir inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje 24 h 5 procentų CO2 inkubatoriuje. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), į kiekvieną šulinėlį įpilama 190 μL šviežios terpės ir 10 μL MTT darbinio tirpalo (5 mg/mL), o plokštelė buvo inkubuojama 37 ◦C 4 valandas 5 procentų CO2 inkubatoriuje. Tada supernatantas buvo pašalintas, o susidarę formazano kristalai buvo ištirpinti, į kiekvieną duobutę įpilant 150 μL DMSO (dimetilsulfoksido) 10 min. 37 ◦C temperatūroje 5 procentų CO2 inkubatoriuje. Ištirpusių formazano kristalų intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant mikroplokštelių skaitytuvą esant 570 nm.

2.10.2. Azoto oksido nustatymas

RAW264.7 ląstelės (105 ląstelės / ml) buvo iš anksto apdorotos įvairiomis koncentracijomis neapdorotu T65 produktu (15, 5–125 ug / ml) 30 minučių, po to stimuliuojamos 1 ug / ml LPS 24 valandas. Iš ląstelių išsiskiriančio NO koncentracija buvo nustatyta Grieso reagentu, naudojant standartinę NO2 kreivę – [36]. Šimtas mikrolitrų kultūros supernatanto buvo inkubuojamas su 100 μL Griess reagento (N-1-naftiletilendiamino dihidrochlorido (NEDHC) ir sulfanilamido mišinys) kambario temperatūroje 20 minučių tamsoje. Absorbcija buvo matuojama esant 540 nm.

2.10.3. DPPH laisvųjų radikalų pašalinimo tyrimas

DPPH laisvųjų radikalų šalinimo veikla buvo atlikta pagal anksčiau aprašytą metodą [9]. Neapdorotas T65 kultūros ekstrakto produktas buvo praskiestas iki 600, 200, 100, 20 ir 4 ug/ml koncentracijų metanolyje. 180 μL reakcijos mišinys buvo pagamintas su 90 μL 0,1 mM DPPH (ištirpinto MeOH) ir 90 μL skirtingų koncentracijų mėginių tirpalų (S1 lentelė). Bandomosios reakcijos buvo kruopščiai sumaišytos 96-šulinėlių plokštelėse, inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje 30 min., o sugertis matuojama esant 516 nm spektrofotometru. DPPH slopinimo procentas buvo apskaičiuotas taip:

Slopinimas (procentais )=[1 − (ODexp − ODcon) / (ODstd − ODbln)] × 100 (1)

čia ODexp yra eksperimentinio mėginio absorbcija; ODcon yra kontrolės absorbcija; ODstd, standarto absorbcija; ir ODbln – tuščiojo mėginio absorbcija.

2.11. Anti-senėjimo veiklos įvertinimas

2.11.1. CCD-986Sk ląstelių citotoksiškumo įvertinimas

Įvairių koncentracijų (0–1 mg/mL) neapdoroto T65 produkto citotoksiškumas žmogaus odos fibroblastų ląstelėse (CCD-986Sk) buvo nustatytas MTT tyrimu, kaip aprašyta anksčiau atliekant RAW264.7 MTT tyrimą. ląstelės.

2.11.2. Žmogaus fibroblastų dauginimasis naudojant CCD-986Sk ląsteles

Žmogaus odos fibroblastų (HDF) ląstelių proliferacija buvo nustatyta CCD{{0}}Sk ląstelėse, naudojant CCK-8 tyrimą. CCD-986Sk ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles 5 × 103 ląstelių/šulinėlių greičiu, o po to 24 valandas inkubuojamos 37 ◦ C temperatūroje DMEM, kuriame yra 10 procentų FBS. Ląstelės buvo apdorotos skirtingos koncentracijos neapdorotu T65 produktu (0–1 mg/ml) ir 2 valandas inkubuojamos kambario temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2, pridedant 10 μL CCK-8 reagento. Reakcijos mišinio absorbcija buvo matuojama mikroplokštelių skaitytuvu, esant 450 nm, ir nustatytas gyvybingų ląstelių procentas, lyginant su neapdorotų ląstelių absorbcija.

Cistanche kovoja su senėjimu.

2.11.3. I tipo kolageno sintezės tyrimas

I tipo kolageno sintezė buvo ištirta naudojant fermentinį imunosorbentinį tyrimą (ELISA). CCD-986Sk ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis 5 × 103 ląstelės/šulinėlyje DMEM, turinčioje 10 % FBS, ir inkubuojamos 37 ◦ C 24 val. Įvairios koncentracijos neapdoroto T65 produkto (31,25–25 {{30}} pg/ml) buvo pridėta į terpę be FBS 24 valandas. Tada 100 μL auginimo terpės ir I tipo kolageno buvo įpilta į kolagenu padengtas 96-šulinėlių plokšteles ir inkubuojama 37 ◦C temperatūroje 24, 48 ir 72 valandas. Kiekvienas šulinukas buvo plaunamas 0,05 procento fosfatu buferiniu fiziologiniu tirpalu su 0,1 procento Tween 20 (PBST), pridedamas COL1A1 pirminis antikūnas ir inkubuojamas 1 valandą. Vėlgi, šuliniai buvo plaunami 0, 05 procento PBST, pridedamas antrinis antikūnas, konjuguotas su HRP (krienų peroksidaze), ir inkubuojamas 1 valandą. Kiekvienas šulinys buvo plaunamas 0, 05 procento PBST ir pridėta TMB (tetrametilbenzidinas). Gavus pageidaujamą spalvos intensyvumą (mėlyną), reakcija buvo nutraukta pridedant 0,5N H2SO4, kuris tirpalo spalvą nuspalvino geltonai. Sugertis buvo išmatuota esant 450 nm mikroplokštelių skaitytuvu ir nustatyta I tipo kolageno gamyba.

2.11.4. Elastazės slopinimo tyrimas

Kiaulių kasos elastazės (PPE) slopinimo aktyvumas buvo tiriamas pagal anksčiau aprašytą procedūrą [9]. Neapdorotas T65 produktas buvo praskiestas iki 30{{10}}0, 1000, 500 ir 100 ug/ml koncentracijos metanolyje. Reakcijos mišinys buvo paruoštas naudojant 0,2 M Tris-HCl buferį (pH 8,0), 0,5 mM N-Succ-(Ala)3-ρ-nitroanilidą (SANA) kaip substratą, kiaulių kasos elastazę (3,5 U/mL in). 0,2 M Tris-HCl buferis; pH 8,0) ir inhibitorius (mėginys). Kiekvienas mėginys buvo iš anksto inkubuotas 37 °C temperatūroje 15 min., o visas reakcijos mišinys inkubuojamas 37 °C temperatūroje 20 min. Sugertis matuota esant 400 nm. Visas 150 μL reakcijos mišinys buvo paruoštas, kaip parodyta S2 lentelėje. Galutinės mėginio koncentracijos reakcijos mišinyje buvo 300, 100, 50 ir 10 ug/ml. PPE slopinimo procentas buvo apskaičiuotas naudojant (1) formulę.

2.12. Balinimo veiklos įvertinimas

2.12.1. Citotoksiškumo įvertinimas B16F1 ląstelėse

T65 neapdoroto produkto citotoksiškumas B16F1 melanomos ląstelėms buvo nustatytas MTT tyrimu. B16F1 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles po 104 ląsteles vienoje duobutėje, o po to 24 valandas inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje DMEM, kuriame yra 10 procentų FBS. Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis koncentracijomis T65 neapdorotu produktu (0–1 mg / ml) ir 2 valandas inkubuojamos kambario temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2. Reakcijos mišinio absorbcija buvo išmatuota mikroplokštelės spektrofotometru esant 450 nm ir apskaičiuotas ląstelių gyvybingumo procentas.

2.12.2. Melanino sintezės slopinimas B16F10 ląstelėse

B16F10 ląstelės buvo iš anksto apdorotos -MSH 6-šulinėlių plokštelėse esant 105 ląstelėms viename šulinyje ir 24 valandas inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje DMEM, kuriame yra 10 procentų FBS, kad būtų skatinama melanino sintezė. Ląstelės buvo inkubuojamos su įvairių koncentracijų neapdorotu T65 produktu (31, 25–125 ug / ml) ir 100 ug / ml arbutino kaip teigiamos kontrolės, kai yra arba nėra -MSH 48 valandas. Buvo pastebėtas melanino sintezės slopinimas B16F10 melanomos ląstelėse.

Cistanche slopina melanino susidarymą.

2.12.3. Grybų tirozinazės slopinimo tyrimas

Grybų tirozinazės slopinimo aktyvumas buvo nustatytas taip, kaip aprašyta anksčiau [9]. Neapdorotas T65 produktas buvo praskiestas iki 3000, 1000, 500 ir 100 ug/ml koncentracijos metanolyje. Reakcijos mišinys buvo paruoštas su 0,1 M kalio fosfato buferiu (pH 6,8), 3 mM l-tirozino tirpalu [ištirpsta DW (distiliuotame vandenyje)] ir 2000 U/mL grybų tirozinazės (ištirpsta 0,05 M kalio fosfato buferyje, pH 6.8). ; Sigma) 96-šulinėlių plokštelėse. Visas 150 μL bandomasis mišinys (120 μL fosfato buferio, 10 μL l-tirozino, 15 μL mėginio tirpalo ir 5 μL grybų tirozinazės; S3 lentelė) buvo inkubuojamas 37 ◦ C temperatūroje 10 min. ir matuojama absorbcija 47 nm. Galutinės mėginio koncentracijos reakcijos mišinyje buvo 300, 100, 50 ir 10 ug/ml. Standartas buvo be mėginio tirpalo, kontrolė buvo be l-tirozino, o tuščiasis mėginys buvo be l-tirozino ir mėginio tirpalo. Tirozinazės slopinimo procentas buvo apskaičiuotas taikant (1) formulę.

2.13. Aminorūgščių analizė

T65 neapdoroto produkto laisvoji aminorūgštis buvo nustatyta GC-FID (dujų chromatografijos – liepsnos jonizacijos detektoriaus) metodu Korėjos polimerų bandymų ir tyrimų institute (Koptri). GC-FID metodui naudotas aparatas Agilent 6890N GC-FID; kolonėlė, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); įpurškimo dalies temperatūra, 250 ◦C; įpurškimo kolonėlė, 2 μL; padalijimo santykis, 5:1; temperatūros sąlyga, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detektorius, FID @ 320 ◦C; nešiklis, azoto dujos, 1,5 ml/min.; gamintojas, Phenomenex; aminorūgščių standartas; ir koncentracija, 200 μmol/L.

T65 neapdoroto produkto sudėtinės aminorūgštys buvo nustatytos GC-FID (dujų chromatografijos-liepsnos jonizacijos detektoriaus) metodu Korėjos polimerų bandymų ir tyrimų institute (Koptri). GC-FID naudotas įrenginys buvo Agilent 6890N GC-FID; kolonėlė, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); įpurškimo dalies temperatūra, 250 ◦C; įpurškimo kolonėlė, 2 μL; padalijimo santykis, 5:1; temperatūros sąlyga, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detektorius, FID @ 320 ◦C; nešiklis, azoto dujos, 1,5 ml/min.; gamintojas, Phenomenex; aminorūgščių standartas; ir koncentracija, 200 μmol/L.

2.14. Riebalų rūgštis

Neapdoroto produkto T65 riebalų rūgštys buvo nustatytos GC-FID (dujų chromatografijos-liepsnos jonizacijos detektoriaus) metodu Korėjos polimerų bandymų ir tyrimų institute (Koptri). GC-FID naudotas įrenginys buvo Agilent 6890N GC-FID; kolonėlė, Supelco SP-2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 μm); įpurškimo dalies temperatūra, 250 ◦C; įpurškimo kolonėlė, 1 μL; padalijimo santykis, 50:1; temperatūros sąlyga, 100 ◦C (4 min) → 3 ◦C/min → 240 ◦C (15 min); detektorius, FID @ 285 ◦C; nešiklis, azoto dujos, 0,8 ml/min.; gamintojas, SUPELCO 37 komponentų FAME mišinys; ir koncentracija 0,5 mg/ml.

2.15. Antimikrobinė veikla

Patogeninių bakterijų slopinimas atliktas disko difuzijos metodu. Šimtas mikrolitrų P. acnes kultūros 108 CFU (kolonijas formuojantis vienetas)/ml buvo paskleistas ir inkubuojamas 35 ◦C temperatūroje anaerobiškai 2–3 dienas Schaedler agaro plokštelėse kartu su 6 mm disku (Whatman), kuriame yra 15 ug. neapdoroto ekstrakto, ištirpinto metanolyje, ir buvo išmatuotos slopinimo zonos. Panašiai 100 μL S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli ir P. aeruginosa 108 CFU/mL buvo paskleisti ir inkubuoti 35 ◦ C temperatūroje aerobiškai R2A arba LBA plokštelėse 1-2 dienų ir buvo išmatuotos slopinimo zonos.

2.16. Mezoporinio silicio dalelių sintezė

Struktūrą sukeliantis polimeras buvo ištirpintas dejonizuotame vandenyje, kad būtų gautas micelių tirpalas. Mezoporinės silicio dioksido medžiagos buvo susintetintos literatūroje aprašytais metodais [37]. Mezoporinių silicio dioksido dalelių (SBA-15) sintezei 10 g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, JAV) buvo ištirpinta 55 ml 2 M HCl, po to maišoma kambaryje. temperatūra 30 min. Be to, į tirpalą buvo įpilta 22 g tetraetilortosilikato (TEOS) ir toliau maišoma 30 min., 24 valandoms įdedama į 36 ◦C temperatūrą, o po to įdedama į orkaitę, kurioje buvo palaikoma 100 ◦C temperatūra ir paliekama. 4 dienos esant statinei būsenai. Po 4 dienų tirpalas butelyje pasikeitė į drumstą tirpalą. Drumstas tirpalas filtruojamas dviem sluoksniais celiuliozės filtravimo popieriaus ir plaunamas EtOH (du kartus) ir DI (dejonizuotu) vandeniu (du kartus). Gauti filtruoti milteliai buvo išdžiovinti 120 ◦C konvekcinėje krosnyje ir įdėti į mufelinę krosnį (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Seulas, Pietų Korėja). Šeši mėginiai buvo susintetinti tomis pačiomis sąlygomis, bet kitoje partijoje. Seulo nacionaliniame universitete transmisijos elektronų mikroskopu (Talos L120C; FEI) buvo padarytos sintezuoto SBA{19}} perdavimo elektronų mikrografijos (TEM).

2.17. BET paviršiaus ploto analizė

Silicio dioksido dalelių dydis buvo matuojamas Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, Jungtinė Karalystė). Norint paruošti BET (Brunauer-Emmett-Teller) analizės mėginį, 5 g P-123 buvo pridėta į 76 g 2M HCl ir maišoma 250 aps./min. greičiu 24 valandas. Po 24 val., kai P-123 buvo visiškai ištirpęs, tolygiai (15 ml/min.) buvo pridėta 160 ml DI (dejonizuoto) vandens ir TEOS ir maišoma 750 aps./min. greičiu 24 valandas. Po to susidarę milteliai buvo atskirti filtruojant ir atskirti milteliai dedami į antpirštį ir plaunami Soksletu 24 valandas. Tada jis buvo nuplautas DI vandeniu ir sudegintas mufelinėje krosnyje (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Pietų Korėja). BET paviršiaus ploto analizė buvo atlikta siekiant patvirtinti SBA{14}} sintezės būdu pagamintų miltelių veikimą. BET analizę atliko Inha universitetas ir Changwon nacionalinis universitetas.

Paruoštų mezoporinių silicio dioksido medžiagų paviršiaus plotui ir porų dydžio pasiskirstymui ištirti buvo naudojamas dujų sorbcijos analizatorius (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, JAV). Paviršiaus plotas ir porų dydžio pasiskirstymas buvo apskaičiuotas naudojant ASiQwin programinę įrangą (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, JAV), remiantis adsorbcijos-desorbcijos izotermomis. Nesugadintos susintetintos dalelės buvo degazuotos 300 ◦C/3h, tada N2 adsorbcijos ir desorbcijos izotermos buvo išmatuotos –196 ◦C temperatūroje. Bendram paviršiaus plotui apskaičiuoti buvo pritaikyta daugiataškė BET analizė.

2.18. Tvarumo vertinimas

Norint patvirtinti T65 buvimą įterptajame SBA-15, buvo atliktas toks veiksmas: 12 g SBA-15 ir 1,2 g neapdoroto T65 produkto buvo sumaišyti 500 ml acetonitrilo. Tirpalas maišomas 18 valandų 30 °C temperatūroje. Po filtravimo mišinys filtruojamas ir nufiltruotos dalelės džiovinamos 100 ◦C konvekcinėje krosnyje. Norint rasti pačią T65 dalelę SBA-15, 1 g išdžiovinto T65, įterpto į SBA-15, buvo ištirpintas acetonitrile ir pridėta 25 ml 3 M fluoro rūgšties. Mišinys maišomas kambario temperatūroje 24 valandas, kol tirpalas tapo skaidrus. Tada tirpalas filtruojamas, o filtrato tirpalas buvo naudojamas kaip mėginys. Mėginiai, gauti iš pirmiau minėtų eksperimentų, buvo analizuojami HPLC.

Norint nustatyti kontroliuojamo atpalaidavimo savybę, į 50 ml mineralinės alyvos (M3516; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) buvo įberta 35 ml įterpto SBA-15 ir gerai išmaišyta. Tada į mišinį įpilama 50 ml DI vandens ir 6 valandas purtoma kambario temperatūroje, o po to palikta ant stalo 12 valandų. Kai skystasis sluoksnis buvo atskirtas, vandens sluoksnis buvo išmestas ir 1 ml aliejaus sluoksnio buvo paimtas kaip HPLC analizės mėginys. Tas pats eksperimentas buvo pakartotas antrą ir trečią dieną, o mėginys vėl buvo analizuojamas naudojant HPLC.

2.19. Kosmetikos formulė ir pritaikymas

2.19.1. Formulės ir stabilumo testas

Kosmetikos gaminys buvo sukurtas iš emulsiklio tipo kremo. Kosmetikos formulės stabilumas buvo nustatytas laikant kosmetikos gaminį įvairiose temperatūrose (37, 45 ir 60 ◦C), įskaitant šaldiklyje, šaldytuve ir kambario temperatūroje iki 28 dienų. Kosmetinio kremo stabilumas buvo stebimas pirmą, antrą, trečią ir ketvirtą savaites.

2.19.2. Klinikiniai tyrimai, savanoriai ir taikymo metodai

Funkcinis kosmetinis kremas su T65 neapdorotu produktu buvo tepamas 21 savanoriai moteriai, siekiant nustatyti raukšlių gerinimo ir balinimo efektyvumą per odos šiurkštumą ir odos ryškumą. Visas eksperimentines žmonių dalyvavimo šiame tyrime procedūras patvirtino Elad Institucinė peržiūros taryba (IRB) (EL-P-7400). Informuotas sutikimas buvo gautas iš visų atskirų dalyvių. Bandymai buvo atlikti prieš naudojant produktą, po 2 savaičių ir po 4 savaičių. Nuvalius veidą du kartus per dieną (ryte ir vakare) ant veido buvo tepama apie 5 mg kosmetikos priemonės ir švelniai paskirstyta pagal odos tekstūrą. Savanoriams nebuvo leista naudoti jokių kitų kremų ar produktų 1 savaitę iki tyrimo ir tyrimo metu.

2.19.3. Vaizdo fiksavimo ir apdorojimo metodai

Nuotraukas užfiksavo VISIA-CR. Vaizdų šiurkštumas buvo analizuojamas PRIMOS programine įranga (PRIMOS versija 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, JAV). Vidutinis šiurkštumas (Ra) ir didžiausias šiurkštumo gylis (Rmax) buvo apskaičiuoti pagal šią formulę:

Ra arba Rmax rodiklis (procentais)=(vertė prieš gydymą – vertė po gydymo) / vertė prieš gydymą × 100 (2)

Vaizdų ryškumas buvo analizuojamas naudojant Chromameter CR-400. L* yra ryškumo parametras ir matuojamas pagal šią formulę:

L* didėjimo greitis (procentais)=(vertė prieš gydymą – vertė po gydymo) / vertė prieš gydymą × 100 (3)

2.20. Statistinė analizė

Statistiniai IC50 reikšmės skaičiavimai buvo atlikti naudojant OriginPro 8.5 statistinę programinę įrangą (OriginLab Corporation, Northampton, MA, JAV). Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais, o visi rezultatai buvo pateikti kaip trijų atskirų eksperimentų vidurkis ± SD. Duomenys buvo analizuojami taikant nepriklausomos imties t-testo vienpusę dispersijos analizę (vienpusė ANOVA), po kurios buvo atliktas Tukey post-hoc testas naudojant OriginPro 8.5. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, kai p <>

3. Rezultatai ir diskusijos

3.1. Pasirinktų aktyvių padermių išskyrimas, atranka ir filogenija

Iš surinktų dirvožemio mėginių iš viso buvo išskirtos 2285 bakterijų padermės. Atrankos rezultatai parodė, kad 102 bakterijų padermės turėjo funkcijas, taikomas kosmetikos preparatams (S4 lentelė). Remiantis pirminiu patikrinimu, Streptomyces sp. Nustatyta, kad T65 pasižymi didesniu aktyvumu visoms kosmetikos reikmėms, ty antioksidaciniam, antielastazės, antitirozinazės ir antimikrobiniam poveikiui. Galiausiai, tolimesniam vertinimui buvo pasirinktas padermė T65, siekiant nustatyti galimą jo taikymą kosmetikos gaminiuose. Filogenetinė analizė parodė, kad padermė T65 sudarė kladą su Streptomyces bungoensis DSM 41781T (artimiausia padermė pagal 16S rRNR geno seką), turinti stiprią įkrovos vertę (S1 pav.).

3.2. Bioaktyvios medžiagos aptikimas ir surinkimas

Sumaišytos bioaktyvios medžiagos iš T65 etilacetato kultūros ekstrakto buvo surinktos iš Prep-HPLC. Bioaktyvios medžiagos buvo išmatuotos 208, 230, 254 ir 280 nm detektoriais. Frakcijos buvo renkamos pagal laiką (nuo 14 min. iki 21 min.). Surinktos frakcijos buvo išgarintos iki sausumo ir ištirpintos metanolyje (neapdorotas T65 produktas) ir buvo naudojamos visiems vertinimams, įskaitant antimikrobinį aktyvumą.

3.3. Citotoksiškumas HaCaT ląstelėse

Žmogaus keratinocitų ląstelių linijos (HaCaT ląstelės) ląstelių gyvybingumas liko nepakitęs T65 neapdoroto produkto iki 10 mg / ml. Kita vertus, ląstelių gyvybingumas padidėjo priklausomai nuo dozės, kai buvo panaudota nuo 10 ng / ml iki 10 mg / ml neapdoroto T65 produkto (S2 pav.). Šis koncentracijos diapazonas lėmė daugiau nei 100 procentų ląstelių gyvybingumą, o tai rodo, kad jis skatino HaCaT ląstelių dauginimąsi ir todėl buvo netoksiškas HaCaT ląstelių linijai.

3.4. Antioksidacinė veikla

3.4.1. Citotoksiškumas RAW264.7 ląstelėje

Neapdoroto T65 produkto citotoksiškumas buvo įvertintas pagal ląstelių gyvybingumą RAW264.7 makrofaguose MTT tyrimo metodu. Neapdorotas T65 produktas neparodė citotoksinio poveikio RAW264.7 ląstelių linijoms.

Priešingai, neapdorotas T65 produktas padėjo daugintis RAW264.7 ląstelėms priklausomai nuo dozės, kai buvo gydoma 13,5–1{13}}00 ug/ml. Kai buvo naudojamas 1000 ug/mL neapdoroto T65 produkto, RAW264.7 ląstelių gyvybingumas buvo 118,7 proc. (p < 0,05).="" šie="" rezultatai="" parodė,="" kad="" neapdorotas="" t65="" junginys="" buvo="" netoksiškas="" iki="" 1="" mg/ml="" ir="" gali="" būti="" naudojamas="" kosmetikos="">

3.4.2. Azoto oksido (NO) gamybos slopinimas

NO lygiui nustatyti buvo naudojamas Grieso reagentas. Norėdami nustatyti NO slopinimą, RAW264.7ląstelės buvo apdorotos 1 ug/mL LPS (lipopolisacharidu) kartu su įvairiomis T65 neapdoroto produkto koncentracijomis. RAW264.7 ląstelės buvo aktyvuotos LPS, o NO gamyba buvo matuojama kaip nitritų koncentracija auginimo terpėje. Palyginti su vien LPS, neapdorotas T65 produktas reikšmingai (p < 0,001)="" slopino="" nitritų="" koncentraciją="" lps="" stimuliuojamose="" raw264.7="" ląstelėse="" priklausomai="" nuo="" koncentracijos,="" kai="" buvo="" naudojamas="" nuo="" 15,5="" iki="" 125="" ug/ml="" (pav.="" 2).="" makrofagai="" buvo="" į="" lps-toll="" panaši="" indukuojamos="" no="" sintazės="" (ino)="" ekspresija,="" signalizuojanti="" apie="" ląstelių="" aktyvaciją="" per="" receptorius="" [38].="" lps="" yra="" makrofagų="" aktyvatorius="" ir="" vaidina="" svarbų="" vaidmenį="" gaminant="" no="" žinduolių="" ląstelėse="" [39].="" no="" yra="" laisvasis="" radikalas,="" kurį="" gamina="" imunokompetentingos="" ląstelės,="" tokios="" kaip="" makrofagai="" [40].="" no="" gamyba="" turi="" fagocitinį="" poveikį="" makrofagams.="" taigi,="" makrofagų="" ląstelių="" linija="" raw264.7="" buvo="" atrinkta="" antioksidantų="" tyrimui.="" ilgą="" laiką="" didelis="" dėmesys="" buvo="" skiriamas="" natūralių="" antioksidantų,="" slopinančių="" no="" gamybą,="" paieškoms="" [41].="" esant="" 125="" ug/ml,="" neapdorotas="" t65="" produktas="" pakankamai="" sumažino="" no="" lygį="" 57,4="" proc.,="" palyginti="" su="" no,="" kurį="" gamina="" 1="" ug/ml="" lps.="" remiantis="" no,="" pagaminto="" lps="" sukeltoje="" raw264.7="" makrofagų="" ląstelių="" linijoje,="" slopinimu,="" t65="" kultūros="" ekstraktas="" gali="" būti="" laikomas="" stipriu="">

DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveennggininggpAerccteivnitayges esant skirtingoms koncentracijoms ir neapdoroto T65 produkto IC50 vertės pateiktos S5 lentelėje. Askorbo rūgštis (vitaminas C) buvo naudojama kaip standartas, nes ji naudojama losjonams, kremams, serumams ir pleistrams, kurie, kaip gerai žinoma, turi galingą antioksidacinį poveikį vietiniam naudojimui [42]. Nustatyta, kad antrinių vitamino C ir T65 produktų DPPH radikalų šalinimo aktyvumo IC50 buvo atitinkamai 5,01 ir 6,31 ug/mL (3 pav.).

Yra tik keli tyrimai apie bakterijų izoliatų antioksidacinį aktyvumą, palyginti su antioksidaciniu aktyvumu iš augalinių medžiagų, o dauguma tyrimų buvo skirti gerai žinomiems augaliniams produktams [43–49]. 10 ug/ml produkto koncentracija sugebėjo sunaikinti 68,66 ± 2,83 proc. DPPH laisvųjų radikalų. Neapdoroto T65 produkto IC50 buvo beveik panašus į stipriausio antioksidanto vitamino C, kuris parodė, kad jis gali būti naudojamas kaip antioksidantas gaminant kosmetikos preparatus.

3.5.1. Citotoksiškumas CCD-986Sk ląstelėse

Neapdorotų T65 junginių citotoksiškumas žmogaus odos fibroblastų (HDF) ląstelėse buvo įvertintas CCD-986Sk ląstelių linijoje, naudojant MTT tyrimą. Kai buvo tiekiama neapdoroto T65 produkto koncentracija nuo 0 iki 1 mg/ml, HDF ląstelės proliferavo priklausomai nuo dozės iki 500 ug/ml koncentracijos. Šis rezultatas parodė, kad neapdoroti junginiai iš T65 nebuvo citotoksiški HDF ląstelėms. Tačiau buvo nustatyta, kad didesnė nei 1 mg/ml koncentracija yra citotoksiška, ir tik 81,34 proc. ląstelių išgyveno, palyginti su kontroline grupe (4 pav.).

3.5.2. HDF plitimas

HDF ląstelių dauginimasis buvo nustatytas naudojant CCD{{0}}Sk ląstelių liniją. Neapdorotas T65 produktas padaugino HDF ląsteles priklausomai nuo koncentracijos nuo 0 iki 500 ug/ml (5 pav.). Tačiau jis buvo citotoksinis, kai koncentracija buvo 1 mg/ml. Žmogaus odos epitelio ląstelių augimas patvirtino raukšlių gerinimo gebėjimą dėl pirminių kultivuotų ląstelių, išskirtų iš žmogaus odos ląstelių, ir išskiriamo kolageno pasikeitimo [50, 51].

3.5.3. I tipo kolageno sintezė

I tipo kolageno sintezė nustatyta ELISA metodu. Neapdorotas T65 produktas, esant 250 pg/mL, padidino I tipo kolageno koncentraciją priklausomai nuo dozės iki 145,91 proc. ± 9,11 proc. (vidurkis ± SD; vidurkis 24, 48 ir 72 val.). Trijų eksperimentų, atliktų 24, 48 ir 72 val., rezultatai parodė I tipo kolageno sintezę (6 pav.). Taigi, odos ląstelių kolageno sekrecija kartu su žmogaus odos epitelio ląstelių augimu patvirtino T65 junginių raukšles gerinančius gebėjimus.

3.6. Balinimo veikla

3.6.1. Citotoksiškumas B16F1 ląstelėse

Neapdoroto T65 produkto citotoksiškumo B16F1 melanomos ląstelėms rezultatas pagal MTT tyrimą parodytas 8 paveiksle. Neapdoroto T65 produkto inkubavimo B16F1 ląstelėse rezultatas parodė netoksinį poveikį iki 1 mg/ml koncentracijos. B16F1 ląstelės proliferavo priklausomai nuo dozės iki 62,5 ug/mL koncentracijos, tačiau reikšmingas (p < 0.05)="" nuo="" dozės="" priklausomas="" ląstelių="" gyvybingumo="" sumažėjimas="" buvo="" įvertintas="" nuo="" 125="" iki="" 1000="" ug/ml.="" tačiau="" esant="" 1="" mg/ml="" koncentracijai,="" buvo="" pastebėta="" 99,12="" %="" ±="" 4,16="" %="" gyvybingų="" ląstelių="" (8="" pav.).="" eksperimentiniai="" rezultatai="" parodė,="" kad="" t65="" padermės="" kultūros="" etilo="" acetato="" ekstraktas="" nebuvo="" citotoksiškas="" b16f1="" melanomos="" ląstelių="" linijai="" ir="" gali="" būti="" naudojamas="" gaminant="" kosmetikos="" gaminius,="" skirtus="" žmogaus="" odai="">

3.6.2. Melanino sintezės slopinimas B16F10 ląstelėse

Norėdami patvirtinti balinimo efektą, B16F10 ląstelės, ląstelių linija, kuri išskiria ir gaminabuvo naudojamas melaninas ląstelėse. Siekiant skatinti melanino sintezę, B16F10 buvo papildytas 1 ug -MSH. Arbutinas (100 ug/ml; komerciškai parduodamas balinimo agentas) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Mikroskopinis šio eksperimento stebėjimas parodė beveik visišką melanino slopinimą per 48 valandas panaudojus 125 ug/ml T65 kultūros ekstrakto (9A, B pav.). Šis eksperimentas įrodė, kad T65 kultūros ekstraktas gali slopinti melanino sintezę priklausomai nuo dozės ir gali būti naudojamas kaip balinimo priemonė kuriant kosmetikos gaminius vietiniam naudojimui.

3.7. Mezoporinės silicio dioksido medžiagos

Mezoporinė medžiaga yra medžiaga, kurioje yra porų, kurių skersmuo yra nuo 2 iki 50 nm pagal IUPAC (Tarptautinė grynosios ir taikomosios chemijos sąjunga) nomenklatūrą, taigi mezoporinė silicio dioksido medžiaga yra silicio dioksido medžiaga, kurios poros yra 2–50 nm skersmens. Ši medžiaga pirmą kartą buvo aprašyta aštuntajame dešimtmetyje JAV patentuose, tačiau nebuvo gerai pastebėta susijusiose srityse, todėl panašią medžiagą 1990 m. Japonija vėl savarankiškai tyrinėjo ir susintetino [69]. Išsamesnius tyrimus atliko Mobil Corporation Laboratories ir jie pavadino šią medžiagą MCM (Mobil kristalinė medžiaga) su tokiais pavyzdžiais kaip MCM-41 arba MCM-48, kurių mezoporų skersmuo svyruoja nuo 2 iki 6 nm [70,71]. Kitai Kalifornijos universiteto Santa Barbaros tyrimų grupei po 6 metų pavyko susintetinti didesnio porų dydžio (5–30 nm) mezoporinį silicio dioksidą ir pavadino jį SBA (Santa Barbara amorfine medžiaga)-15 [72] . Mezoporo silicio dioksido medžiaga iš pradžių buvo sukurta naudoti kaip molekulinis sietas dėl savo struktūrinio pobūdžio, tačiau pastaruoju metu ji buvo plačiai pritaikyta vaistų tiekimo, katalizatoriaus, biojutiklio, energijos kaupimo ir kt.

SBA{0}} ir MCM-41 mezoporinės medžiagos skiriasi. Tačiau paprasčiausias būdas atskirti šiuos du yra silicio dioksido sienelių storis. SBA-15 su storesne silicio dioksido sienele turi stabilesnę ir standesnę struktūrą, palyginti su MCM-41, kurios sienelės storis yra plonesnis. Be to, sintetinis SBA-15 metodas yra paprastesnis nei MCM-41. Dėl šių skirtumų SBA-15 buvo pasirinktas bioaktyviam T65 neapdorotam produktui pernešti silicio dioksido mezoporoje.

3.8. Mezoporinio silicio dalelių sintezė

Po to, kai kalcinavimo procesas buvo vykdomas 200 ◦ C temperatūroje 2 valandas ir 600 ◦ C temperatūroje 3 valandas nuolat, buvo gauti balti mezoporiniai silicio dioksido milteliai. Šiame procese susintetinta 8 nm porų SBA-15. Nustatyta, kad SBA-15 dalelių dydžiai yra 11,539–13,630 mm skersmens (S4 pav.) ir buvo nustatyti dviejose skirtingose ​​patalpose: Inhos universiteto laboratorijoje ir Čangvono nacionalinio universiteto laboratorijoje. Be to, visi šeši pavyzdžiai S4 paveiksle buvo susintetinti tuo pačiu metodu, bet skirtinga partija.

Kai mišinys buvo palaikomas 60 ◦C temperatūroje ir paliekamas 4 dienas statinėmis sąlygomis pagal aukščiau pateiktą metodą, buvo susipažinta su 5 nm porų SBA-15. Be to, kai temperatūra buvo kontroliuojama 120 ◦C, buvo susintetintas 10 nm SBA-15. Remiantis rezultatais, mezoporų dydį galima kontroliuoti priklausomai nuo senėjimo proceso [73]. Tolimesniam apdorojimui buvo naudojamas 10 nm porų SBA-15 (11 pav.), nes didelių porų mezoporinės silicio dioksido nanomedžiagos pasižymi geresniu biomolekulių tiekimo poveikiu nei siauros poros [74].

3.9. Tvarios veiklos vertinimas

Norint nustatyti, ar mezoporinis SBA-15 turi kontroliuojamo atpalaidavimo gebėjimą, SBA-15 ir neapdorotas T65 produktas buvo sumaišyti DI vandenyje, metanolyje, acetonitrile arba etilenglikolio tirpiklyje. Sumaišius SBA-15 ir vandenį, tirpalas tapo srutomis dėl koaguliacijos tarp silicio dioksido paviršiaus ir vandens. Metanolis buvo geras silicio dioksido ir T65 neapdoroto produkto tirpiklis. Tačiau dėl toksiškumo acetonitrilas buvo pakeistas metanoliu. T65 panardinimo santykio dalelės buvo nustatytos pagal PV reikšmę (S13 lentelė). Kaip parodyta S13 lentelėje, SBA-15 PV vertė sumažėjo panardinus į neapdorotą T65 produktą. Tai parodė, kad T65 medžiagos buvo gerai panardintos į mezoporines silicio dioksido daleles.

Norint nustatyti, ar dalelės viduje yra T65, pats T65 buvo ištirtas HPLC (S5 pav.). Kaip rodo duomenys, buvo dvi specifinės smailės (raudonos dėžutės viduje), kurios visada buvo matomos T65 kultūros ekstraktų atveju, net jei T65 preparato partija buvo pakeista. Šių dviejų smailių sulaikymo laikas buvo 10 minučių ir 12 minučių esant 230 nm. Filtrato mėginys buvo tiriamas HPLC, siekiant nustatyti, ar T65 buvo įterptajame SBA-15. Kaip parodyta S6 paveiksle, dvi specifinės smailės buvo pastebėtos netoli 10 min. ir 12 min. Be to, beveik 18 minučių sulaikymo laikas buvo pastebėtas nedidelis pikas, o tai labai svarbu norint atsekti T65 produktus, kurie yra išleisti tam tikrą laiką.

12 paveiksle parodytas kontroliuojamas T65 įterptojo SBA-15 tvaraus testo išleidimas nuo 0 iki 3 dienų. Konkretus T65 pikas buvo matomas po 15 ir 2 0 min. nuo 0 iki 3 dienų. Neapdoroti T65 produktai buvo tinkamai panardinti ir laikui bėgant palaipsniui išsiskyrė. Be to, šiame tyrime pasiūlytos mezoporinės silicio dioksido medžiagos (SBA-15) gali turėti fiziologiškai aktyvių medžiagų neapdorotame T65 produkte ir patvirtino, kad fiziologiškai aktyvios medžiagos po pakrovimo išsiskyrė nuolatinio atpalaidavimo būdu. Be to, šiame tyrime pasiūlyta silicio dioksido mezoporinė medžiaga ateityje galėtų būti naudojama kaip geras nešiklis įvairioms funkcinėms medžiagoms impregnuoti ir kaip ilgalaikio atpalaidavimo medžiaga, palaikanti įvairias fiziologiškai aktyvias medžiagas.

4. Išvados

Antrinės bioaktyvios medžiagos, išgautos iš dirvožemio mikroorganizmų, yra svarbios kosmetikos reikmėms dėl savo antimikrobinio, antioksidacinio, raukšlių mažinimo, odą balinančio ir antimikrobinio poveikio. Šiame tyrime aprašomas naujas T65 padermės kultūros etilo acetato ekstrakto aktyvumas kosmetikos preparatų funkcinėms sudedamosioms dalims. Neapdorotas T65 produktas buvo netoksiškas skirtingoms ląstelių linijoms, tokioms kaip HaCaT (žmogaus keratinocitas), RAW264.7 (makrofagų ląstelė), CCD-986Sk (žmogaus odos fibroblastų ląstelė) ir B16F1 ir B16F10 melanomos ląstelėms. . Be to, neapdorotas produktas T65 parodė I tipo kolageno sintezės reguliavimą, o tai labai svarbu norint sumažinti odos raukšles. Be to, neapdorotas produktas T65 pakankamai slopino žmogaus patogenines bakterijas, tokias kaip B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus ir S. epidermidis, o tai gali padėti išvengti kosmetikos gaminio gedimo ir patogeninių bakterijų kolonizacijos. formuojantis acne vulgaris ant žmogaus odos. Be to, neapdorotas T65 produktas slopino grybų tirozinazę balinamajam poveikiui ir kiaulių kasos elastazę, stabdydamas senėjimą, ir slopino NO ir pašalino DPPH radikalus, kad būtų užtikrintas antioksidacinis aktyvumas. Mezoporinio silicio dioksido dalelių SBA{15}} sintezė įrodė, kad neapdorotas T65 produktas būtų veiksmingas kosmeceutinėse kompozicijose su veiksmingomis kontroliuojamo atpalaidavimo savybėmis. Galiausiai, in vivo suformuluoto kosmetikos gaminio naudojimas kartu su neapdorotu produktu T65 ant savanorių veidų įrodė balinantį ir raukšles mažinantį T65 poveikį. Tačiau dar reikia atrasti skirtingų biologiškai aktyvių junginių chemiją ir molekulinius mechanizmus, susijusius su skirtingu fermentų slopinimu ir patogeno slopinimo veikla. Apibendrinant galima teigti, kad mūsų tyrimas tvirtai palaikė idėją, kad bakterijų išteklius galima pridėti prie lokaliai naudojamų kosmetikos gaminių, siekiant balinimo, raukšlių susidarymo, antioksidacinio poveikio ir antimikrobinės veiklos.

cistanche pharma special

Norėdami gauti daugiau informacijos, spustelėkite čia.