Melanogenezės inhibitoriai iš Ligusticum Sinense šakniastiebio B16-F10 melanomos ląstelėse in vitro ir zebrafish in vivo

Susisiekite: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,† , Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4, Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* ir Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Santrauka:Ligusticum sinense, kinų vaistinio augalo, šakniastiebis nuo seno buvo naudojamas kaip kosmetika.balinimasir odos drėkinimas senovės Kinijoje. Siekdami ištirti L. sinense šakniastiebio antimelanogeninius komponentus, atlikomeantimelanogenezėgryninimas naudojant pusiau paruošiamąjį HPLC, kartu su spektroskopine analize aktyviesiems komponentams nustatyti. Remiantis biologinio tyrimo metodu, iš L. sinense metanolinių ekstraktų etilo acetato sluoksnio buvo išskirti ir identifikuoti 24 junginiai, tarp jų – 5-[3-(4-hidroksi{{ 7}}metoksifenil)alil]ferulo rūgštis (1) ir cis-4-pentilcikloheks-3-enas-1,2-diolis (2) buvo nauji junginiai. Visiems gryniems izoliatams buvo atliktas antimelanogenezės tyrimas naudojant pelių melanomos B16-F10 ląsteles. Parodomas 1 junginys ir (3S,3aR)-neoknidilidas (8).antimelanogenezėaktyvumas, kai IC50 vertės buvo atitinkamai 78,9 ir 31,1 µM, be akivaizdaus citotoksiškumo. Tolesnis tyrimas parodė, kad 8 junginys, palyginti su arbutinu (20 µM), parodė reikšmingą antipigmentacinį poveikį ant zebrafinių žuvų embrionų (10-20 µM) ir neturėjo jokio citotoksinio poveikio normaliems žmogaus epidermio keratinocitams. Šie radiniai rodo, kad (3S,3aR)-neoknidilidas (8) yra stiprus antimelanogeninis ir netoksiškas natūralus junginys ir gali būti sukurtas kaipbalinimaskosmetikos priemonė.

Raktiniai žodžiai:Ligusticum sinense; šakniastiebis;antimelanogenezė; B16-F10 melanomos ląstelė; zebrafish;pigmentacija

Spustelėkite norėdamiCistanche tubulosa milteliai melanino slopinimui

Įvadas

Melaninas yra rudai juodas pigmentas, kuris daugiausia lemia odos, plaukų ir akių spalvą [1]. Melaninas yra biopolimeras ir apima dvi pagrindines žmogaus odos pigmentų klases: rusvai juodą eumelaniną ir rausvai geltoną feomelaniną [1]. Melanino biosintezė yra sudėtingas daugiapakopis procesas, vadinamasmelanogenezė, kuri yra fiziologinė žmogaus odos reakcija, siekiant užkirsti kelią žalingam ultravioletinės (UV) spinduliuotės ir aplinkos teršalų poveikiui. Tačiau dėl pernelyg didelės melanogenezės oda gali patamsėti, o nenormali hiperpigmentacija sukelia įvairias dermatologines problemas, tokias kaip strazdanos, melasma, senatvinis lentiginas ir net odos vėžys [2].

Melaninas gaminamas su membrana susietose organelėse, vadinamose melanosomomis, kurios yra specializuotose ląstelėse, vadinamose melanocitais. Melanino sintezė prasideda nuo L-tirozino hidroksilinimo į L-dihidroksifenilalaniną (DOPA), o po to vyksta oksidacija į dopachinoną. Šias dvi reakcijas katalizuoja greitį ribojantis fermentas tirozinazė. Nesant tiolinių medžiagų, dopachinonas ciklizuojasi į leukodopachromą, o po to įvyksta daugybė oksidoredukcijos reakcijų, kurios apima su tirozinaze susijusį baltymą -2 (Tyrp-2), kad susidarytų tarpinis dopachromas ir 5, 6-dihidroksiindolas{. {9}}karboksirūgštis (DHICA). DHICA vėliau oksiduojasi, katalizuoja Tyrp{10}}, ir polimerizuojasi, kad susidarytų eumelaninas. Dopachinonas taip pat konjuguoja su cisteinu ir glutationu, kad susidarytų cisteinildopa ir glutationildopa, kurios palaipsniui virsta feomelaninu [1].

Melanocitus supančios ląstelės, tokios kaip keratinocitai ir fibroblastai, dalyvauja reguliuojant melanocitusmelanogenezė[3]. Nuolatinis ultravioletinių spindulių poveikis sukelia DNR pažeidimą inkeratinocitams ir sukelia p53-tarpininkaujantį proopiomelanokortino (POMC) reguliavimą. POMC atlieka potransliacinį skilimą, kad susidarytų melanocitus stimuliuojantis hormonas (-MSH) ir endorfinas. Savo ruožtu -MSH jungiasi prie melanokortino 1 receptoriaus (MC1R) gretimuose melanocituose, todėl padidėja cAMP reguliavimas. Padidėjęs cAMP stimuliuoja su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus (MITF) ekspresiją. Tada MITF reguliuoja pigmentacijos fermentų, įskaitant tirozinazę, Tyrp{10}} ir Tyrp-2, transkripciją. UV sukeltas kelias galiausiai veda į melanino sintezę ir melanosomų perkėlimą į keratinocitus [4–6]. Be išorinių stimulų, melanino gamybai įtakos turi ir vidiniai veiksniai, tokie kaip hormonų pokyčiai, genetiniai sutrikimai, uždegimas ir amžius [3].

Rytų Azijoje dauguma moterų tikisi išvengti netolygios odos pigmentacijos ir siekti odos šviesinimo. Pavyzdžiui, arbutinas, kojinė rūgštis, azelaino rūgštis, askorbo rūgštis, baltojo šilkmedžio ir saldymedžio šaknų ekstraktas buvo naudojami kaipbalinimaskosmetikos preparatų sudedamosios dalys [7]. Veiksmingos ir profilaktinės odos išnaudojimasbalinimasNatūralių šaltinių medžiagos yra labai įdomios kosmetikos srityje, visų pirma dėl santykinio netoksiškumo ir mažesnio šalutinio poveikio [7,8]. Ligusticum sinenseOliv šakniastiebis. (Umbelliferae) jau 2000 metų buvo naudojama kaip tradicinė kinų medicina, o iki šiol jos šaknys yra labai rekomenduojama žolelių arbata [9]. L. sinense, kinų kalba „Gaoben“, taip pat žinomas kaip kiniškas lovage, buvo naudojamas šalčiui šalinti, skausmui ir reumatralgijai malšinti bei anemofrigidiniam galvos skausmui malšinti. Pagrindinis L. sinense išorinis panaudojimas yra odos balinimas ir drėkinimas [10]. Iki šiol praneštos cheminės L. sinense sudedamosios dalys yra terpenoidai, ftalido analogai ir fenilpropanoidiniai glikozidai [11–16]. Buvo pranešta, kad tokios sudedamosios dalys turi daug farmakologinių poveikių. Pavyzdžiui, buvo pranešta, kad eteriniai aliejai iš L. sinense šaknų ir šakniastiebių turi analgetinį, raminamąjį ir antimikrobinį poveikį [15,17]. Ligustilidas, pagrindinis ftalidas, plačiai randamas Umbelliferae augaluose, plečia miometriją ir sumažino uždegiminį poveikį. ir neurogeninis skausmas [18]. Įrodyta, kad Cnidilidas, kitas ftalidas, kurio gausu Umbelliferae augale, turi antispazminį ir uždegiminį poveikį [19,20]. Ankstesni tyrimai parodė, kad L. sinense ekstraktas slopina.melanogenezėant B16-F10 pelių melanomos ląstelių [21]. Tačiau vis dar nebuvo pranešta apie aktyvius melanogenezę slopinančius komponentus.

natūralių ingredientų

Preliminarios biologinės patikros metu buvo nustatyta, kad L. sinense metanoliniai ekstraktai rodoantimelanogenezėaktyvumas B16-F10 ląstelėse, kurių IC50 vertė yra 50 µg/mL [22], o priešlaikinės ambulatorinės genezės principai iki šiol neatskleista. Taigi mes nusprendėme ištirti L. sinense šakniastiebio aktyvumo principą biologinio tyrimo metodu, todėl buvo išskirti ir identifikuoti du nauji junginiai 1 ir 2 kartu su 22 žinomais junginiais 3–24. Šiuo straipsniu taip pat buvo siekiama ištirti 1 ir 8 junginių poveikį B16-F10 melanomos ląstelėms in vitro ir zebrafish in vivo, įvertinti saugumą normalių žmogaus epidermio keratinocitų MTT tyrimu ir kiekybiškai įvertinti 1 ir 8 L. sinense šakniastiebiuose. .

2. Rezultatai ir diskusijos

2.1. Izoliavimas ir struktūrinis išaiškinimas

Bandant izoliuoti ir identifikuotimelanogenezėefektyviai iš aktyvių frakcijų, taikėme biologiniu tyrimu vadovaujamą frakcionavimo strategiją. L. sinense rizomos metanolinis ekstraktas buvo padalintas, kad susidarytų etilo acetatas, n-butanolis ir vandenyje tirpūs sluoksniai. Po to gauti trys sluoksniai buvo tiriami dėl antimelanogenezės aktyvumo pelių melanomos B16-F10 ląstelėse. Pelės B16 melanomos ląstelė yra jautri, patikima ir tinkama platforma, skirta tirti daug mažų molekulių.melanogenezėreguliatoriai [23–25]. Esant 25–100 µg/mL koncentracijoms, etilo acetate tirpus sluoksnis pasižymėjo stipriausiu slopinamuoju aktyvumu, o n-butanolio arba vandenyje tirpaus sluoksnio slopinimas buvo nedidelis (1A pav.), kaip rodo melanino kiekis lizuotame tirpale. B16-F10 melanomos ląstelės (1B pav.). Atviras etilacetato sluoksnio atskyrimas per silikagelį, po to išgryninimas HPLC, davė du anksčiau nenurodytus cheminius elementus 1 ir 2 (2A pav.) kartu su 22 žinomais junginiais. Žinomi junginiai buvo apibūdinti kaip eugenolis (3) [26], {{17} }hidroksi-4-metilacetofenonas(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-butilheksahidroftalidas (5) [28], karvakrolis (6) [29], skvalenas (7) [30 ],(3S,3aR)-neoknidilidas (8) [31], koniferilo alkoholis 9-metilesteris (9) [32], bergaptenas (10) [33], metoksalenas (11) [34], metilo vanilitas ( 12) [35], 2,5-dihidroksi-4-metilacetofenonas (13) [36], 2-metoksi-4-nitrofenolis (14) [37], 2,{{ 55}}dimetoksifenolis (15) [38], falkarindiolis (16) [39], (9Z)-heptadecenas-4, 6-diinas-1, 8-diolis (17) ) [40], 3-O-(p-kumaroil)urzolio rūgštis (18) [41], pregnenolonas(19) [42], (9Z,11E,13R)-13-hidroksioktadeka{{79 }}, 11-dieno rūgštis (20) [43], ferulo rūgštis (21) [44], koniferilferulatas (22) [45], p-hidroksifenetilferulatas (23) [46] ir vanilas rūgšties rūgštis (24) [47].

1 junginys, gautas kaip bespalvis aliejus, turėjo C20H20O6 formulę, kaip nustatyta iš 13C BMR ir teigiamų jonų HRESI-MS, kuri parodė fragmento joną esant teigiamam HRESI-MS m/z 357,1331 [M plius H] plius (apskaičiuota C20H21O6, 357.1333). Jo IR sugertis ties 3444, 1633 ir 1509 cm-1 rodo atitinkamai hidroksi, olefino ir aromatinių funkcijų buvimą. 1H BMR 1,1,3,4,5-tetrapakeistas aromatinis fragmentas [δH 7,07 (d, J=1,8 Hz, H-6) ir 7,22 (d, J=1,8 Hz, H-2)], ABX tipo aromatinė funkcija [δH 6,69 (dd, J=7.9, 1,8 Hz, H-60) , 6,74 (d, J=7,9 Hz, H-50) ir 6,87 (d, J=1,8 Hz, H-20)], du trans- tarpusavyje susieti olefininiai protonai [δH 6,33 (d, J=15,9 Hz, H-8) ir 7,56 (d, J=15,9 Hz, H-7) ], galinė alilinė grupė [δH 4,99 (ddd, J=17,1, 1,8, 1,8 Hz, H-90a), 5,10, (br d, J=7,6 Hz) , H-70), 5,15 (ddd, J=10.1, 1,8, 1,8 Hz, H-90b) ir 6,40 (ddd, J=17.1, 10,1) , 7,6 Hz, H-80)] ir du metoksilo rezonansai [δH 3,77 (s, 30-OCH3) ir 3,92 (s, 3-OCH3)]. Dvidešimt anglies rezonansų, priskirtinų septyniems neprotonuotiems aromatiniams anglies atomams [δC 126,7 (C-1), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 146,1 (C{{116}). }), 148,6 (C-3), 147,2 (C-4) ir 148,2 (C-30)], vienos rūgšties karbonilas (δC 168,4, C-9), onemetinas (δC 48,2, C-70), aštuoni olefininiai metinai [δC 108,9 (C-2), 113,2 (C-20), 115,6 (C-70), 116,1 (C) -8), 121,8 (C-60), 123,8 (C-6), 141,5 (C-80) ir 146,2 (C-7)], vienas egzometilenas (δC 115,9, C-90) ir du metoksilai [δC 56,4 (30-OCH3) ir 56,6 (3-OCH3)] buvo pastebėti 13C BMR spektre kartu su DEPT spektru 1 ( 1 lentelė). 1 jungiamumas dar buvo nustatytas pagal kryžmines smailes δH5,10 (H-70)/δC 113,2 (H-20), 115,9 (H-90), 121,8 (H{{) 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 141,5 (C-80) ir 147,2 (C{{) 198}}), δH 7,56 (H{201}}) / δC 108,9 (C-7), 116,1 (C{207}}), 123,8 (C{201}}), 126,7 (C) -1) ir 168,4 (C-9), δH 3,77 (30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) ir δH 3,92 (3-OCH3)/ δC 148,6 (C-3) HMBC spektre (2B pav.), kuriuos dar patvirtino tarpusavyje susiję δH 3,77 (30-OCH3)/δH 6,87 (H-20) signalai. ) ir δH 3,92 (3-OCH3)/δH 7,22 (H-2) NOESY spektre (2B pav.). Atitinkamai, 1 buvo apibūdintas kaip parodyta ir pavadintas kaip 5-[3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)alil]ferulo rūgštis. Mūsų žiniomis, 1 su dviem C6–C3 blokų rinkiniais, sujungtais C-70, buvo naujas skeleto lignano tipas.

2 junginys buvo išskirtas kaip bespalvis aliejus, kurio molekulinė formulė C11H2{{20}}O2, kaip nustatyta teigiamų jonų HR-ESIMS, rodo [M plius H] plius joną, esant m/z 185,1501 (apskaičiuota C11H21O2, 185.1541). Pastebimos sugertis ties 3445 ir 1660 cm−1 IR spektre 2 rodė, kad yra atitinkamai hidroksi ir olefino funkcinės grupės. 1H BMR (2 lentelė) kartu su COSY spektru 2 parodė dvi alifatines grandines esant δH 0,85–1,97 (–H2-7–H3-11) ir δH 1,66–5,44 (–H-3 –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). Aukščiau pateiktos priskyrimai taip pat atsispindi 2 13C BMR, paremtame DEPT spektrais, kuriuose vienas metilas (δC 14,2, C-11), šeši metilenai [δC 22,7 (C-10), 26,3 (C{{) 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) ir 37,4 (C-7)], trys metinai [δC Buvo pastebėta 67,1 (C-2), 69,2 (C-1) ir 121,0 (C-3)] ir viena ketvirtinė anglis (δC 144,1, C-4). HMBC spektre 2 (2C pav.), kryžminės smailės δH 5,44 (H-3)/δC 27,2 (C-5) ir 37,4 (C-7), δH 1,92– Nurodyta C{ {100}}–C-6 buvo ciklohekseno dalis su dviguba jungtimi ties ∆3, o C-7–C-11, prisotinta linijinė alifatinė grandinė, buvo prijungta ties C{{105 }}. Hidroksilą turinčių chiralinių C-1 ir C-2 santykinės konfigūracijos buvo priartintos pagal karbinoilprotonų H-1 (9,1, 4,2 Hz) ir H-2 (4,2 Hz) J vertes. ). Taigi santykinė 1,2-dihidroksi konfigūracija 2 buvo išvesta į cis. Galutinai 2 struktūra buvo išaiškinta, kaip parodyta, ir pavadinta cis-4-pentilcikloheks-3-en-1,2-diolis.

2.2. 1 ir 8 junginių poveikis melanino kiekiui -MSH stimuliuojamose B16-F10 ląstelėse

Siekiant nustatyti L. sinense šakniastiebių depigmentacijos sudedamąsias dalis, visi gryni izoliatai buvo tiriamiantimelanogenezėtyrimas B16-F10 melanomos ląstelėse. Pelių melanomos B16-F10 ląstelės yra nusistovėjęs antimelanogeninių principų atradimo modelis ir buvo plačiai pritaikytas ankstesniuose tyrimuose [48]. Melanocitus stimuliuojantis hormonas (-MSH) yra peptidinis hormonas, atsakingas už melanino gamybą melanocituose, aktyvindamas melanokortino 1 receptorius [49]. Šiame tyrime B16-F10 ląstelės buvo stimuliuojamos -MSH (100 nM) ir tuo pačiu metu apdorojamos kiekvienu junginiu, kurio koncentracija buvo 25, 50 arba 100 µM. Melanino kiekis B16-F10 melanomos ląstelėse be gydymo junginiais buvo priskirtas 100 proc. Arbutinas, įprasta odabalinimasagentas kosmetikos gaminiuose, buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Iš šių junginių 1 ir 8 slopina -MSH sukeltą melanino gamybą priklausomai nuo dozės. 1 ir 8 junginių IC50 reikšmės buvo atitinkamai 78,9 ir 31,1 µM (3B pav.). 1 ir 8 junginiai, esant efektyvioms koncentracijoms, neparodė akivaizdaus poveikio MTT tyrimui (3A pav.). MTT rezultatai gali atsirasti dėl bendro ląstelių proliferacijos mažinimo ir ląstelių gyvybingumo slopinimo poveikio, atsižvelgiant į eksperimentines sąlygas. Šie rezultatai rodo, kad 1 ir 8 junginių anti-melanogeninis poveikis nebuvo susijęs su ląstelių mirtimi ar augimo slopinimu.

Naudojant HPLC-DAD metodą, pagrindinės veiksmingos sudedamosios dalys (1 ir 8) buvo apibūdintos iš neapdoroto ekstrakto (4 pav.), lyginant su gryno 1 (iš laboratorinės sintezės, duomenys dar neskelbti) ir 8 (iš Sigma) sulaikymo laiku. kaip standartai. Buvo naudojami 1, 10, 20, 40, 60, 80 ir 100 µg/ml pradiniai tirpalai. Kiekviena koncentracija buvo švirkščiama trimis egzemplioriais. Džiovintos medžiagos ekstrakto kiekio santykis 1 ir 8 buvo kiekybiškai įvertintas kaip 0,009 procentai ir 0,15 procento (m/m) pagal atitinkamų smailių plotų tiesinę regresiją.

2.3. In Vivo Zebrafish pigmentacijos tyrimas

Be to, įvertinti 8 poveikį in vitroantimelanogenezė, buvo toliau tiriamas jo in vivo atsparumas pigmentacijai atliekant zebrafish pigmentacijos tyrimą. Zebrafish buvo laikomas palankiu stuburinio modelio organizmu dėl savo mažo dydžio, didelio vaisingumo ir panašių genų sekos bei organų sistemų kaip žmonėms. Be to, dėl melanino pigmentacijos proceso jo paviršiuje, leidžiančio lengvai stebėti, zebrafish yra ypač naudingas modelis tiriant vivomelanogeninius inhibitorius ar stimuliatorius [50]. Šiame tyrime 20 mM arbutinas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, o 20 µM arbutinas buvo įtrauktas, kad būtų galima palyginti su 8 junginiu toje pačioje koncentracijos lygyje. Po zebrafijos embrionų inkubacijos nuo 7 AG iki 72 AG, 8 junginys pasižymėjo didesniu pigmentaciją slopinančiu aktyvumu, kai koncentracija buvo 10 ir 20 µM, palyginti su arbutinu (20 µM) (5 pav.). Apdorojant 20 µM junginiu 8, zebrafish pigmentacijos lygis pastebimai sumažėja apie 31 proc.; 8 junginys esant 10 µM sumažina pigmentacijos lygį 26,2 proc.

2.4. Žmogaus epidermio odos ekvivalentų gyvybingumo tyrimas

Kosmetikos gaminių sauga kelia rimtą susirūpinimą. Pavyzdžiui, hidrochinonas, veiksminga odos šviesinimo priemonė, buvo uždrausta pateikti į rinką dėl daugybės nepageidaujamų reakcijų ir nesutarimų dėl galimos kancerogeninės rizikos [7]. Kojic rūgštis, stiprus tirozinazės inhibitorius, gali sukelti kontaktinį dermatitą ir galimą genotoksiškumą [51,52]. Norėdami įvertinti 1 ir 8 junginių saugumą ant žmogaus odos, atlikome ląstelių gyvybingumo tyrimą pagal žmogaus odos ekvivalentų (HSE) modelį. HSE yra trimatės kultūros sistemos, sukuriamos sėjant humankeratinocitus ant tinkamo odos substrato, iš anksto pasėto žmogaus fibroblastais. HSE yra fiziologiškai panašios į natūralią odą ir yra tinkamos alternatyvos bandymams su gyvūnais. Kontroliuojamomis auginimo sąlygomis HSE yra labai panašios į natūralų audinį, iš kurio jie buvo gauti [53]. Šiame tyrime buvo atlikti normalių žmogaus epidermio keratinocitų (NHEK) gyvybingumo tyrimai Leideno epidermio modeliuose (LEM). 1 ir 8 junginiai neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui, kai koncentracija buvo 10–100 µM. 1 junginio ląstelių gyvybingumas yra 98 procentai ir 106 procentai, kai koncentracija yra atitinkamai 10 ir 100 µM. 8 junginio ląstelių gyvybingumas yra 97 procentai ir 92 procentai, kai koncentracija yra atitinkamai 10 ir 100 µM. Atitinkamai, 1 ir 8 junginiai nesukėlė citotoksiškumo NHEK Leideno epidermio modeliuose, kai koncentracija buvo mažesnė nei 100 µM (6 pav.). Kadangi efektyvi 8 koncentracija yra mažesnė nei 100 µM, tai rodo, kad 8 gali būti saugus odaibalinimasmažesnė nei tirta koncentracija. Tačiau praktikoje kosmetikos gaminiai gali būti naudojami ant žmogaus odos ilgą laiką, todėl turi būti tęsiamas ilgesnis HSE bandytų junginių eksperimentinis laikotarpis.

2.5. B16-Musculus tirozinazės molekulinio prijungimo tyrimas

Tirozinazės katalizė yra greitį ribojantis melanino biosintezės etapas. Taigi tirozinazės slopinimas yra labiausiai paplitęs būdas pasiekti odos baltumą [54, 55]. Siekiant nustatyti, ar L. sinense nuslopintasmelanogenezėB16-F10 ląstelėse, slopinant tirozinazę, buvo atlikti 3D lazdelių modeliai (7A pav.) ir 2D diagrama (7B pav.) molekulinio prijungimo naudojant DS programinę įrangą, kuri atskleidė galimą 8 junginio slopinimo mechanizmą pelėje (Mus). musculus) tirozinazė. Nustatyta, kad aktyvi pelių tirozinazės vieta buvo domene, apsuptame aminorūgščių His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 kartu su dviem vario jonais. CDOCKER sąveikos energija tarp fermento ir inhibitoriaus buvo –46,0067 kcal/mol. Modeliavimo rezultatai parodė, kad hidrofobinės aminorūgštys, įskaitant Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 ir His192 aplink katalizinę vietą, sudarė van der Waals jėgas su junginiu 8. Be to, 8 -laktono fragmento deguonies atomas sudaro 8 vandenilio ryšius ir His257. , o jo karbonilo grupė sudaro koordinacinius ryšius su dviem vario jonais. Taip pat buvo pastebėta, kad ciklohekseno žiedas ir butanas padarė silpną π-alkilo sąveiką atitinkamai su His381 ir His215. Ankstesni tyrimai parodė, kad L. sinense ekstraktas slopina grybų tirozinazę ir sumažino tirozinazės mRNR ekspresiją B16-F10 ląstelėse [21,56]. Kadangi molekulinis prijungimas parodė stiprią sąveiką tarp aktyvaus pelės tirozinazės domeno ir junginio 8, todėl buvo pasiūlyta, kad (3S, 3aR) -neoknidilidas (8) pasižymėjo antimelanogenezės aktyvumu dėl tirozinazės aktyvumo susilpnėjimo ir toliau mažėjančio melanino gamybos. Tačiau, be tirozinazės slopinimo, kiti pagrindiniai mechanizmaiantimelanogenezė(3S,3aR)-neoknidilido (8) aktyvumas dar turi būti toliau tiriamas.

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Generolas

HPLC tipo tirpikliai, n-heksanas, etilo acetatas, metanolis ir acetonitrilas, buvo įsigyti iš JT Baker (Phillipsburg, NJ, JAV). Etanolis buvo pirktas iš Merck (Darmštatas, Vokietija). - Melanocitus stimuliuojantis hormonas (-MSH), dimetilsulfoksidas (DMSO), fosfatu buferinis fiziologinis tirpalas (PBS), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2 ,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) buvo nupirktas iš Sigma Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Atviros kolonėlės chromatografija buvo atlikta silikageliu (70–230 akių, Merck, Darmštatas, Vokietija). Iš anksto padengtos silikagelio plokštelės 60 F254 ir aliuminio lakštai RP-18 F254S, skirti TLC, buvo nupirkti iš Merck (Darmštatas, Vokietija). Optiniai sukimai buvo matuojami JASCO P-1020 poliarimetru (Jasco, Tokijas, Japonija). 1H ir 13C BMR buvo gauti naudojant Bruker Avance DRX-500 spektrometrą (Bruker, Rheinstetten, Vokietija). Mažos skiriamosios gebos ir didelės skiriamosios gebos masės spektrai buvo gauti naudojant ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, JAV) ir Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, JAV) ), atitinkamai. IR spektrai buvo užfiksuoti JASCO FT/IR 4100 spektrometru (Jasco, Tokijas, Japonija).

3.2. Augalinės medžiagos

Džiovintas L. sinense Oliv. buvo nupirktas iš Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taivanas.

3.3. Izoliavimas ir struktūrinis išaiškinimas

Džiovintas L. sinense šakniastiebis (9,9 kg) buvo susmulkintas ir ekstrahuotas metanoliu (40 L × tris kartus), kuris filtruojamas ir išgarinamas, kad gautų juodą likutį (1758 g). Tada ši liekana buvo suspenduota H2O (3{48}} l) ir tris kartus iš eilės padalyta su vienodu tūriu etilo acetato ir n-BuOH. Kiekvienas sluoksnis buvo sukoncentruotas sumažintame slėgyje, kad gautų EtOAc (415 g), n-BuOH (147 g) ir H2O (896 g) sluoksnius. Po to išdžiovintas etilo acetato sluoksnis (25{{100}} g) buvo sumaišytas su 375 g silikagelio ir perkeltas į kondicionuojamą atvirą kolonėlę, užpildytą 3550 g silikagelio, ir eliuuojamas vienu žingsniu. Gradiento metodas, naudojant n-heksano, etilo acetato ir metanolio mišinius. Kiekvienas 500 ml buvo surinktas vienai frakcijai ir analizuojamas TLC. Tada visos frakcijos buvo sujungtos į aštuonias I–VIII dalis pagal TLC analizės rezultatus, kurios buvo ištirpintos minimaliame n-heksano-etilacetato mišinių, naudojamų tolimesnėje HPLC sistemoje, tūryje. II dalis, eliuuota n-heksanu ir etilo acetatu (95:5), buvo išgryninta pusiau paruošiamuoju HPLC (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm), naudojant n-heksaną-etilo acetatą (96:4) kaip eliuentą esant srauto greičiui. 3 ml/min. gauti 6 (4,2 mg, tR=19,8 min.), 3 (6,1 mg, tR=21.2 min.), 5 (32 mg, tR=23 .5 min.) ir 7 (79 mg, tR=28.0 min.). Ta pati dalis buvo išgryninta pusiau paruošiamuoju HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm), naudojant heksaną-etilo acetatą (99). :1) kaip eliuentą, esant 3 ml/min srauto greičiui, gaunant 4 (36 mg, tR=32,5 min.). III dalis, eliuuota n-heksanu-etilacetatu (90:10), buvo išgryninta Pusiau paruošiamasis HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm), naudojant n-heksaną-acetoną (95:5) kaip eliuentą, esant 3 ml/minto srauto greičiui, gaunamas 8 (1,7 g, tR=19). 3 min). IV dalis, eliuuota n-heksanu-etilacetatu (80:20), buvo išgryninta pusiau paruošiamuoju HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm), naudojant n-heksaną-etilo acetatą (85:15) kaip eliuentą esant srauto greičiui. 3 ml/min., kad gautųsi 15 (19 mg, tR=24.4 min.), 12 (11 mg, tR=26.9 min.), 9 (25 mg, tR=33 .8 min.), 10 (31 mg, tR=37.0 min.), 11 (24 mg, tR=42.5 min.). Ta pati dalis buvo išgryninta ta pačia kolonėlė, naudojant n-heksaną-etilo acetatą (78:22) kaip eliuentą 3 ml/mint srauto greičiu, kad gautų 14 (10 mg, tR=20.1 min.) ir 13 ( 22 mg, tR=24.6 min.). Ta pati dalis buvo išgryninta ta pačia kolonėlė, naudojant n-heksaną-etilacetatą-acetoną (80:10:10) kaip eliuentą 3 ml/mint srauto greičiu, kad gautų 20 (25 mg, tR=13.2 min. ), 17 (15 mg, tR=16.3 min.), 18 (28 mg, tR=18.5 min.), 16 (132 mg, tR=21.8 min.) ir 19 (39 mg, tR=25,6 min.). V dalis, eliuuota n-heksanu – etilo acetatu (60:40), buvo išgryninta pusiau paruošiamuoju HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm), naudojant n-heksaną-etilacetatą-acetoną (68:27:5) kaip eliuentą. esant 3 ml/min srauto greičiui gauti 21 (5,3 g, tR=10,2 min.), 23 (63 mg, tR=20,0 min.), 22 (84 mg, tR { {164}},0 min.) ir 24 (33 mg, tR=26,5 min.). Ta pati dalis buvo išgryninta pusiau paruošiamuoju HPLC (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm), naudojant n-heksaną-etilacetatą (72:28) kaip eliuentą 3 ml/min srauto greičiu, kad gautų 2 (24 mg, tR).=24.3 min.). Dalis VI, eliuuota n-heksanu – etilo acetatu (40:60), buvo išgryninta pusiau paruošiamuoju HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm), naudojant n-heksaną-etilo acetatą (53:47) kaip eliuentą esant srauto greičiui. 3 ml/min., kad būtų gautas 1 (47 mg, tR=13,2 min.).

3.4. Spektroskopiniai duomenys

{{0}}[3-(4-Hidroksi-3-metoksifenil)alil]ferulo rūgštis (1): bespalvis aliejus; [ ]25D plius 5,6◦(c 0.12, CH3OH);IR (švarus) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; teigiamas ESI-MS m/z 357,2 [M plius H] plius; teigiamas HRESI-MS m/z 357,1331 [M plius H] plius (apskaičiuota C20H21O6, 357,1333); 1H ir 13C BMR duomenis žr. 1 lentelę. Cis-4-pentilcikloheks-3-en-1,2-diolis (2): bespalvė alyva; [ ]22D-20,3◦(c 0,20, CH3OH); IR (švarus) νmax 3445,2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [M plius H] plius; HRESI-MS m/z 185,1501 [M plius H] plius (apskaičiuota C11H21O2, 185,1541); 1H ir 13C BMR duomenis žr. 2 lentelėje.

3.5. HPLC-DAD analizė

Chromatografinė analizė buvo atlikta naudojant Hitachi HPLC sistemą, kurią sudaro L{{0}}siurblys, L-7200 automatinis mėginių ėmiklis, L-7455 detektorius ir D-7000 sistemos tvarkyklės duomenų rinkimo programinė įranga. ,XBridgeTM C18 kolonėlėje (250 mm ilgio, 4,6 mm vidinio skersmens, 5 um dalelių dydžio; Waters). Mobiliąją fazę sudarė H2O (tirpiklis A) ir CH3CN (tirpiklis B). Srauto greitis buvo 1,0 ml/min. Eliuavimo programa buvo tokia: izokratinė su 2 procentais B (0–5 min.), 2–20 procentų B (5–25 min.), 20–90 procentų B (25–30 min. ), ir izokratiškas su 90 procentų B (30–35 min.). Įpurškimo tūris buvo 10 l. UV matomas spektras buvo užfiksuotas esant 240 nm.

3.6. Ląstelių kultūros

B16-F10 pelių melanomos ląstelės (CRL6475) buvo įsigytos iš Maisto pramonės tyrimų ir plėtros instituto (FIRDI, Hsinchu, Taivanas). Ląstelės buvo kultivuojamos 90 procentų Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), papildyta 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS, Sigma, Sent Luisas, MO, JAV) ir 1 proc. Penicilino-streptomicino tirpalo kultivavimo kolbos CO2 inkubatoriuje su drėgna atmosfera, kurios ore yra 5 procentai CO2 37 ◦C temperatūroje. Auginimo terpė buvo keičiama kas dvi dienas. Ląstelės buvo paimtos tripsinizuojant, kai jos susiliejo apie 85 proc., suskaičiuotos hemocitometru (Neubauer Improved., Marienfeld, Vokietija) ir atitinkamu skaičiumi pasėtos į ląstelių kultūros plokštelių šulinius tolesniems eksperimentams.

3.7. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Norint nustatyti įvairių ekstraktų saugumą, ląstelių gyvybingumas po apdorojimo ekstraktais buvo nustatytas MTT tyrimu. Šis metodas pagrįstas 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido (MTT) redukavimu į formazaną, veikiant mitochondrijų fermentams. gyvybingose ​​ląstelėse [57]. Susidariusio formazano kiekis yra proporcingas esamų gyvybingų ląstelių skaičiui ir gali būti matuojamas spektrofotometriškai. Trumpai tariant, 100 nM melanocitus stimuliuojančiu hormonu (-MSH) iš anksto apdorotos ląstelės, pasėtos 1 × 104 ląstelių tankiu į šulinėlių plokštelę, buvo paliktos prilipti per naktį. Tada į kiekvieną šulinėlį buvo dedami gryni izoliatai arba arbutinas ir inkubuojami dar 72 valandas. Tada apdorotos ląstelės buvo pažymėtos MTT dažų reagentu (Applichem, Danija) PBS (2 mg / ml) 3 valandas. Formazano nuosėdos buvo ištirpintos DMSO ir koncentracijos buvo išmatuotos esant 570 nm mikroplokštelių skaitytuvu. Ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę: ląstelių gyvybingumas (procentais )=(A mėginys / A kontrolė) × 100, kur A mėginys ir A kontrolė yra mišinio absorbcija, pridėjus arba nepridedant tiriamojo mėginio, atitinkamai.

3.8. Melanino kiekio tyrimas

Melanino kiekis buvo matuojamas, kaip aprašyta anksčiau, su nedideliais pakeitimais [58]. B16-F10 melanomos ląstelės buvo pasėtos 1 × 104 ląstelių/šulinėlių 3 ml terpės 6-šulinėlių auginimo plokštelėse ir inkubuojamos per naktį, kad ląstelės galėtų prilipti. Ląstelės buvo veikiamos įvairių koncentracijų (25, 50 ir 100 µM) grynų izoliatų arba arbutino 72 valandas, esant 100 nM -MSH. Gydymo pabaigoje ląstelės buvo plaunamos PBS ir 1 valandą 80 °C temperatūroje lizuojamos 150 µl 1 N NaOH (Merck, Vokietija), turinčio 10 procentų DMSO. Sugertis ties 405 nm buvo išmatuota naudojant mikroplokštelės skaitytuvą. Melanino kiekis B16-F10 melanomos ląstelėse be gydymo junginiais buvo priskirtas 100 proc., o melanino kiekis junginiu apdorotose ląstelėse buvo apskaičiuotas, palyginti su kontroline grupe.

3.9. In Vivo Zebrafish pigmentacijos tyrimas

Gyvūnų naudojimo protokolą peržiūrėjo ir patvirtino Taipėjaus medicinos universiteto (Nr. LAC{0}}) Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas arba komisija (IACUC/IACUP). Metodai buvo atlikti laikantis atitinkamų įstatymų ir patvirtintose gairėse.Laukinio tipo zebrafish embrionai buvo paimti iš Taipėjaus medicinos universiteto Zebrafish Core Facility.Fenotipu pagrįstas zebrafinio embriono vertinimas buvo atliktas pagal ankstesnį tyrimą su nedideliais pakeitimais [50]. Embrionai buvo inkubuojami 28 °C temperatūroje, naudojant 1% etanolį kaip kontrolinį ir skirtingą junginių koncentraciją nuo 7 hpf (po apvaisinimo) iki 72 hpf. Norėdami įvertintianti-melanogenezėmelanogeninių moduliatorių poveikis zebražuvės vystymosi procesui, zebražuvės pigmentacija buvo ištirta esant 72 AG. Embrionai buvo sumontuoti 1 procento mažai tirpstančioje agarozėje (Bioshop Canada, Burlington, ON, Kanada) ir užfiksuoti vaizdai ZEISS Stemi508 stereomikroskopu (ZEISS, Oberkochen, Vokietija). Vaizdų pikselių matavimo analizę atliko „ImageJ“ Fidžio paketas. Buvo išanalizuotas pigmentacijos duomenų kiekybinis įvertinimas (plotas po zebražuvės akimis) ir lyginamas su kontroline grupe.

3.10. Normalių žmogaus epidermio keratinocitų gyvybingumo tyrimas

Visos pirminės žmogaus odos ląstelės iš sveikų donorų, kurias naudoja Leideno universiteto medicinos centro Dermatologijos skyrius, yra išskirtos iš audinių pertekliaus, surinkto pagal Nyderlandų medicininio gydymo įstatymo 467 straipsnį ir Nyderlandų biomedicinos federacijos tinkamo žmogaus audinių naudojimo kodeksą. Mokslo draugijos. Pagal 467 straipsnį pertekliniai audiniai gali būti naudojami, jei pacientas neprieštarauja. Tai reiškia, kad pacientas, kuriam bus atlikta plastinė chirurgija, yra gerai informuotas apie tyrimą. Nė vienas iš autorių nedalyvavo imant audinių mėginius. Dirbant su žmogaus audiniais buvo vadovaujamasi Helsinkio deklaracijos principais.

Šviežia motinos sumažinimo perteklinė vienos patelės oda buvo naudojama normaliems žmogaus epidermio keratinocitams (NHEK) izoliuoti, kaip aprašyta anksčiau [59]. NHEK Leidenepiderminiuose modeliuose (LEM) buvo inkubuojami per naktį panardintomis sąlygomis keratinociteminėje terpėje. Per keturias dienas vaisiaus galvijų serumas buvo palaipsniui praleistas, o NHEK LEM buvo auginami be serumo oro ir skysčio sąsajoje septynias dienas, o auginimo terpė buvo atnaujinama du kartus per savaitę. Gyvybingumo tyrimai buvo atlikti pridedant 0,5 ml 1 mg/ml MTT į kiekvieną LEM esantį NHEK 3 valandoms po 24 valandų poveikio bandomiesiems junginiams 1, 8 ir DMSO (neigiama kontrolė). nusodintas mėlynas formazano produktas buvo ekstrahuotas iš ląstelių per 2 valandas su 0,5 ml izopropanolio šulinėlio. Formazano koncentracija buvo matuojama nustatant OD esant 570 nm naudojant aTecan Infinite F50 mikroplokštelių skaitytuvą.

3.11. Statistinė analizė

Visi mūsų tyrimo duomenys buvo gauti kaip eksperimentų, kurie buvo atlikti bent trimis egzemplioriais, vidurkiai ir išreikšti kaip vidurkis ± SD (standartinis nuokrypis). Statistinė analizė atlikta Studento t-testu. Rezultatų statistinis reikšmingumas nustatytas ties p < 0.05="" (*)="" ir="" p="">< 0,01="">

3.12. B16-Musculus tirozinazės molekulinio prijungimo tyrimas

3.12.1. Homologijos modeliavimas

Kadangi šiuo metu nėra trijų matmenų Mus musculus tirozinazės struktūrų, homologinis modeliavimas yra patikimiausias metodas, leidžiantis nuspėti nežinomo baltymo trimačius struktūras, remiantis prielaida, kad nežinomo baltymo struktūra yra panaši į žinomas kai kurių homologinių etalonų struktūras. baltymai. Mus musculus tirozinazės aminorūgščių seką įsigijome iš Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro. baltymų sekų duomenų bazė. Užklausos baltymo Mus musculustyrosinase homologinio baltymo šabloną nustatė Phyre2 (Protein Homology/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60]. 446 liekanos (81 proc. Mus musculus sekos) ) buvo sumodeliuoti su 100,0 procentų patikimumu pagal vienintelį aukščiausių balų šabloną kaip PBP kodą: c5m8pA buvo pasirinktas kaip doko skaičiavimo tyrimų receptorius.

3.12.2. Ligandų ir baltymų sąveikos analizė

Mus musculus tirozinazės surišimo vieta buvo nustatyta remiantis etalonine humantirozinazės (PDB 5M8M) šešiomis aminorūgščių liekanomis, o surišimo kišenėje yra du variniai. Todėl buvo apibrėžta surišimo vietos sfera. Vėliau 8 junginio 3D struktūra buvo paruošta ir optimizuota sumažinus energiją, prijungtą prie Mus musculus tyrosinase surišimo kišenės, naudojant CDOCKER programą, o inhibitorių prijungimo paleidimų skaičius buvo nustatytas į 50. Visi kiti parametrai buvo nustatyti kaip numatytieji ligando ir baltymų sąveikos analizei naudojant BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diegas, CA, JAV). Galiausiai iš 50 prijungimo konformacijų buvo pasirinkta geriausia, turinti aukščiausią CDOCKER energijos balą, siekiant ištirti prijungto junginio prisijungimo būdą Mus musculus tirozinazės aktyvioje vietoje.

4. Išvados

Šiame tyrime pritaikėme biologinio tyrimo metodą, naudodami B16-F10 ląsteles, kad iš L. sinense šakniastiebių ekstraktų išskirtų antimelanogenezės sudedamąsias dalis. Nustatyta, kad aktyvios sudedamosios dalys yra 5-[3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)alil]ferulo rūgštis (1) ir (3S,3aR)-neoknidilidas (8). Remiantis HPLC analize, 8 junginio kiekis sudaro 0,15 % neapdoroto ekstrakto. Theantimelanogenezė8 aktyvumas buvo patikrintas tiek in vitro B16-F10 ląstelėmis, tiek in vivo zebrafish tyrimais. Visi šie radiniai leido manyti, kad 8 bent jau gali pateikti pagrindą L. sinense potencialui dėl jos didelio stiprumo ir kiekio . Ląstelių gyvybingumo duomenys apie B16-F10 ląsteles ir NHEK tiesiog rodo, kad 8 galima sukurti kaip antimelanogenezės agentą. Spėjama, kad8 poveikio antimelanogenezei būdas yra tirozinazės aktyvumo slopinimas, pagrįstas molekulinio susijungimo rezultatais; tačiau tai dar reikia patvirtinti. Mūsų atradimas atskleidė, kad buvo eksponuojamas 8 junginysanti-melanogenezėpoveikis ir saugumas atliekant in vitro, in vivo ir ex vivos tyrimus, tačiau depigmentacijos veiksmingumas ir biologinis saugumas žmogaus odai turi būti įvertintas ir patvirtintas klinikiniais tyrimais ateityje.