Cistanche:Echinacoside slopina kasos adenokarcinomos ląstelių augimą, sukeldamas apoptozę per mitogenų aktyvuotą baltymų kinazės kelią

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG ir XINFENG LI

Abstraktus.

Klinikinis natūralių produktų, gautų iš tradicinės kinų medicinos, taikymas sulaukė dėmesio vėžio chemoterapiniuose preparatuose.Echinacozidas(ECH), vienas iš feniletanoidų, išskirtų išCistanche(kinų vaistažolių vaistas) turi audinių apsauginį ir anti-apoptotinį poveikį centrinei nervų sistemai. Tačiau vis dar iš esmės neaišku, ar ECH turi naviką slopinantį aktyvumą. Šiame tyrime buvo įrodyta, kad ECH gali žymiai slopinti kasos adenokarcinomos ląstelių proliferaciją, skatindamas reaktyviųjų deguonies rūšių gamybą ir mitochondrijų membranos potencialo perturbaciją ir taip sukeldamas apoptozę. Be to, buvo išaiškinta, kad ECH(Echinacozidas)slopina naviko ląstelių augimą moduliuodamas MAPK aktyvumą. Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas atskleidžia naują ECH funkciją(Echinacozidas), užkertant kelią vėžio vystymuisi ir reiškia, kad ECH naudojimas galėtų būti potenciali chemoterapinė vėžio strategija.

Įvadas

P53 naviko slopintuvo kelias per naviko slopintuvo indukciją, ARF sušvelnina onkogeninę E3-ligazės pelės dvigubos minutės (MDM)2-tarpininkaujamą p53 degradaciją (3). Tai automatiškai reguliuojamas, savisaugos mechanizmas, neleidžiantis ląstelėms piktybiškai virsti. Pažymėtina, kad p53 gali slopinti Myc veiklą transkripcijos būdu aktyvuodamas, pavyzdžiui, miR-145, kuris nukreiptas įMycmRNR vertimo nutildymui (4,5), taip sudarant neigiamą grįžtamojo ryšio reguliavimo ciklą.

Paprasčiausia ir veiksmingiausia vėžio gydymo strategija yra vėžinių ląstelių žudymas. Įrodyta, kad dažniausiai vartojami priešvėžiniai vaistai, tokie kaip cisplatina (6), aktinomicinas D (7) ir adriamicinas (8), skatina naviko augimą skatindami apoptozę. Pastaruoju metu daugėja įrodymų, kad daugelis natūralių produktų ir darinių iš augalų, ypač iš vaistinių augalų, naudojamų tradicinėje kinų medicinoje (TCM), pasižymi naviką slopinančia funkcija, nes sukelia vėžinių ląstelių apoptozę, ir gali būti kliniškai pritaikyti vėžio terapijoje (9). Pavyzdžiui, natūralus antrachinono emodinas yra išskirtas iš daugelio rūšių vėžinių ląstelių (10,11). Camptothecin, kilęs iš kinų "laimingo medžio",Camptotheca acuminate, yra vertingas natūralus produktas, slopinantis DNR perrišimą po topo I sukeltų sruogų lūžių (12). Kitame retrospektyviame populiacijos kohortos tyrime, kuriame iš viso dalyvavo 729 pacientai, sergantys pažengusiu krūties vėžiu, buvo pasiūlyta, kad TCM terapija gali prisidėti prie vėžio gydymo. Iš šios grupės 115 pacientų buvo TCM vartotojai, o 614 pacientų TCM nevartojo. Daugiamatė analizė parodė, kad, palyginti su ne naudotojais, TCM naudojimas buvo susijęs su žymiai sumažėjusia mirtingumo nuo visų priežasčių rizika (13). Visos minėtos išvados parodė, kad TCM yra svarbi papildoma ir alternatyvi medicina, kurią galima naudoti gydant vėžį.

pelėms, turinčioms ūminį plaučių pažeidimą (16,17). Be to, ECH(Echinacozidas)įrodyta, kad jis turi apsauginį poveikį nervų audiniui ir pagerina Parkinsono ligos pelių modelių elgesio sutrikimus (18). Pažymėtina, kad buvo nustatyta, kad ECH skatina ląstelių proliferaciją ir slopina apoptozę pelės žarnyno epitelio MODE-K ląstelėse (19). Tačiau iki šiol mažiau dėmesio buvo skiriama galimam ECH vaidmeniui vėžio prevencijoje.

Šiame tyrime buvo tiriama, ar gydymas ECH veikia naviko ląstelių augimą ir proliferaciją ir ar ECH(Echinacozidas)sukelia apoptozę, padidina reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamybą ir sumažina mitochondrijų membranos potencialą (MMP), todėl slopina naviko ląstelių augimą. Be to, šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti molekulinius mechanizmus, atsakingus už ECH sukeltą ląstelių augimo slopinimą.

Medžiagų ir Metodai

Ląstelė linija Reagentas ir Antikūnai.SW1990 kasos adenokarcinomos ląstelės (ATCC, Manassas, VA, JAV) buvo kultivuojamos modifikuotoje Dulbecco Eagle terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumu, 50 V/ml penicilinu ir 0,1 mg/ml streptomicino 37 °C temperatūroje 5% CO2 drėgnoje atmosferoje. ECH (angl.(Echinacozidas)buvo įsigytas iš "Jrdun Biotechnology Corp." (Šanchajus, Kinija). Antikūnai prieš AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 ir GAPDH buvo įsigyti iš ląstelių signalizacijos technologijos (Danvers, MA, JAV); anti-Bax ir anti-Bcl-2 buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, JAV); ir anti-Caspase-3 buvo įsigytas iš Abcam (Šanchajus, Kinija).

Ląstelė gyvybingumasTyrimas. Norėdami įvertinti naviko ląstelių augimo greitį, ląstelių skaičiavimo rinkinys-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, JAV) buvo naudojamas pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelių suspensijos buvo pasėtos 5 000 ląstelių viename šulinyje, gydant ECH 0, 12, 24, 48 arba 72 val. 96 duobučių kultūros plokštelėse. Ląstelių augimo slopinimas buvo nustatytas pridedant WST-8 reagentą iš CCK-8 rinkinio, kai galutinė koncentracija yra 10% į kiekvieną duobutę, o mėginių absorbcija buvo išmatuota esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, JAV).

Hoechst 33342 Dažymo.Ląstelės (60 % santakos) buvo apdorotos Hoechst 33342 (Beyotime biotechnologijos institutas, Haimenas, Kinija), kurių galutinė koncentracija buvo 1µg/ml, inkubuojamas 37 °C inkubatoriuje 15 min., du kartus plaunamas fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu, kambario temperatūroje 30 min. fiksuojamas 4 % paraformaldehidu ir pritvirtinamas ant stiklelių. Ląstelių branduolių morfologiniai pokyčiai buvo pastebėti fluorescenciniu mikroskopu (Olympus BX51, Melville, NY, JAV). Įprasti branduoliai buvo apvalūs ir nudažyti šviesiai mėlynai, o apoptotiniai branduoliai buvo susitraukę ir nudažyti ryškiai mėlynai.

Fluorescencinis aktyvuotas ląstelė Rūšiavimo (FAKS) Analizės.Apoptozės vertinimui fluoresceino izotiocianatas (FITC)-priedas V apoptozės aptikimo rinkinys (BD Biosciences, Šanchajus, Kinija) buvo naudojamas pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, 5x104 ląstelės buvo plaunamos lediniu šaltu PBS, sumaišytos su 0,1 ml surišamuoju buferiniu tirpalu (Beyotime biotechnologijos institutas) ir nudažytos 10 ml FITC konjuguoto V priedo (10 mg/ml) ir 10 ml propidžio jodido (PI) (50 mg/ml). Po 15 min. inkubavimo kambario temperatūroje tamsoje ir pridėjus 400 ml surišimo buferinio tirpalo, ląstelės buvo analizuojamos srauto citometru (C6; BD Biosciences, Šanchajus, Kinija).

Matavimo eurų. Reaktyvusis deguonis rūšis (ROS).Siekiant įvertinti ROS gamybą, pagal gamintojo instrukcijas buvo naudojamas "Reactive Oxygen Species Assay" rinkinys ("Vigorous Biotechnology", Pekinas, Kinija). Trumpai tariant, ląstelės (80% susiliejimo) buvo surinktos ir plaunamos PBS prieš dažymą dihidroetidžio (DHE) tirpalu (Beyotime biotechnologijos institutas). Tada ląstelės buvo analizuojamos atliekant srauto citometrinę analizę.

Matavimo eurų. Mitochondrijų Membrana galimas (MMP).

MMP pokyčiams nustatyti buvo naudojamas tetrametilrokodamino metilesterio (TMRM) tyrimo rinkinys (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, JAV). Trumpai tariant, ląstelės (80% susiliejimas) buvo surinktos, plaunamos PBS ir 15-20 min. TMRM dažomos 37°C inkubatoriuje. Po to ląstelės vieną kartą buvo plaunamos PBS ir joms buvo atlikta srauto citometrinė analizė.

ImunoblotingasAnalizės. Ląstelės (80% santakos) buvo surinktos ir lydėtos RIPA buferiniame tirpale (Jrdun Biotechnology), kurį sudarė 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natrio deoksicholio rūgšties ir 0,1% SDS bei šviežiai pridėtų proteosomų inhibitorių. Imunoblotingo analizei buvo naudojami tokie patys skaidrių ląstelių lizato kiekiai, kaip aprašyta anksčiau (20).

Statistikos analizė.Kiekybiniai duomenys išreiškiami kaip standartinio nuokrypio ± vidurkis. Statistiniai skirtumai buvo įvertinti nesuporuotu Studento t testu, naudojant statistinę SPSS 15.0 programinę įrangą. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultatai

ECH (angl. (Echinacozidas)Slopina Naviko ląstelėaugimas. Nors buvo pranešta, kad ECH(Echinacozidas)atlieka apsauginį vaidmenį slopindamas apoptozę ir uždegiminius signalus somatinėse ląstelėse, tokiose kaip neuronų ir žarnyno epitelio ląstelės (16-19), lieka neaišku, ar ECH kontroliuoja vėžinių ląstelių augimą ir proliferaciją. Siekiant tai patikrinti, buvo atliktas ląstelių išgyvenimo tyrimas, gydant SW1990 ląsteles, gautas iš II laipsnio kasos adenokarcinomos, titruotomis ECH dozėmis, kaip parodyta 1 pav. Pažymėtina, kad buvo įrodyta, kad ECH žymiai sulėtina naviko ląstelių proliferaciją priklausomai nuo dozės per 5 dienų kultūros laikotarpį (1 pav.).ECH (angl. Sukeliaapoptozė. Kadangi apoptozės praradimas yra vienas iš pagrindinių priežastinių mechanizmų, lemiančių nekontroliuojamą kasos vėžio ląstelių proliferaciją (21), šiame tyrime buvo atliktas eksperimentų rinkinys, siekiant nustatyti, ar ECH sukelia apoptozę. Pirma, dažant naviko ląstelių branduolius Hoechst 33342, buvo įrodyta, kad ECH sukelia apoptozę priklausomai nuo dozės (2A pav.). Be to, FACS analizė buvo atlikta naudojant V priedo / PI dažymą, siekiant dar labiau patvirtinti apoptotinį ty ECH poveikį (2B pav.). Vidutinis apoptotinių ląstelių procentas normaliomis kultūros sąlygomis buvo 1,1%, o šis procentas žymiai padidėjo iki 10,6, 21,4 ir 51,3%, reaguojant į gydymą ECH priklausomai nuo dozės (2C pav.). Šie rezultatai kartu su ląstelių gyvybingumo tyrimu, parodytu 1 pav., Rodo, kad gydymas ECH slopina naviko ląstelių proliferaciją, sukeldamas apoptozę.

sukurti etidį, kuris persipynęs su DNR, šiame tyrime buvo naudojamas ROS gamybai įvertinti. Nustatyta, kad, kaip ir kiti priešvėžiniai vaistai, ECH taip pat stimuliuoja ROS gamybą priklausomai nuo dozės, kaip rodo padidėjęs fluorescencijos intensyvumas gydant ECH (3 pav.).

ECH (angl. (Echinacozidas)Sumažina MMP.Įrodyta, kad mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su apoptozės indukcija. Įrodyta, kad mitochondrijų pralaidumo perėjimo porų atidarymas skatina transmembraninio potencialo depolarizaciją ir pro-apoptotinių veiksnių išsiskyrimą (23). Todėl buvo išbandyta, ar ECH gali sukelti MMP praradimą naviko ląstelėse, atlikdamas TMRM tyrimą, kuris yra nusistovėjęs metodas, nes TMRM fluorescencijos intensyvumas yra proporcingas membranos potencialui. Buvo įrodyta, kad gydymas ECH žymiai sumažina MMP priklausomai nuo dozės (4 pav.).ECH (angl. Kontrolė Naviko ląstelė augimas Via mitogeno aktyvuotas baltymasbuvo ištirtas molekulinis ECH sukeltos naviko ląstelių mirties pagrindas, kelių gyvybiškai svarbių signalizacijos kelių, tokių kaip MAPK ir AKT (24,25), kurie kontroliuoja ląstelių išlikimą ir mirtį, aktyvumas. MAPK yra evoliuciškai konservuotos, proline nukreiptos Ser/Thr baltymų kinazės, įskaitant ekstraląstelines signalais reguliuojamas kinazes (ERKs), c-Jun NH2-galinę kinazę (JNKs) ir p38 šeimos narius, kurie aktyvuojami per trijų pakopų kinazės signalizavimo kaskadas (26,27). Šiame tyrime buvo įvertinta MAPK ir AKT ekspresija, taip pat jų aktyvuotos fosforilintos formos ir nustatyta, kad ECH žymiai slopina JNK ir ERK1/2 aktyvumą, tačiau padidina p38 aktyvumą (5 pav.). Pažymėtina, kad buvo įrodyta, kad AKT aktyvumui, kuris taip pat yra kritiškai svarbus ląstelių proliferacijai, ECH gydymas neturi įtakos (5 pav.). Be to, buvo įrodyta, kad gydymas ECH padidina Bax ir Caspase-3 išraišką, tuo pačiu sumažindamas Bcl-2 išraišką (5 pav.), O tai atitinka 2 pav. Taigi rezultatai rodo, kad ECH sukelia naviko ląstelių apoptozę per MAPK kelią.

Diskusija

Kiek mums žinoma, tai yra pirmasis tyrimas, parodantis, kad ECH turi naviką slopinančią funkciją, sukeldamas apoptozę (2 pav.), Skatindamas ROS gamybą (3 pav.) ir sukeldamas mitochondrijų membranos potencialo depolarizaciją (4 pav.), Todėl sukelia naviko ląstelių augimo slopinimą (1 pav.). Be to, buvo įrodyta, kad molekulinis ECH sukeltos naviko ląstelių mirties pagrindas atsiranda reguliuojant MAPK signalizacijos kelius (5 pav.). Šios išvados rodo naują ECH funkciją užkertant kelią navikogenezei ir taip rodo, kad jis gali būti kandidatas į vėžio terapiją.

Dauguma priešvėžinių vaistų gali sukelti naviko ląstelių apoptozę, senescenciją ir (arba) ląstelių ciklo sustojimą, o tai sukelia naviko ląstelių augimo slopinimą ir proliferaciją. Ląstelių ciklo sustojimas yra ląstelių atsakas į lengvus streso signalus, leidžiančius ląstelėms atstatyti pažeistą DNR prieš pradedant replikacinę DNR sintezę ar mitozę, o apoptozė ir senescencija (nuolatinis ląstelių ciklo sustojimas) atsiranda reaguojant į streso signalus, kurie pašalina nepataisomas ar piktybines ląsteles (28,29). Todėl šiame tyrime buvo įvertintas tik apoptotinis ECH poveikis naviko ląstelėms, nes vėžinių ląstelių žudymas yra pagrindinis kriterijus vertinant priešvėžinio preparato stiprumą. Pažymėtina, kad buvo įrodyta, jog ECH skatinaBax(5 pav.), pro-apoptotinis genas, transkripciškai aktyvuotas naviko slopintuvo p53 (30). Taigi verta patikrinti, ar ECH gali suaktyvinti p53 signalizacijos kelią. Jei taip, ECH taip pat gali sukelti nuo p53 priklausomą ląstelių ciklo sustojimą, senescenciją, apoptozę ar autofagiją. Šiame tyrime buvo išaiškinta naviką slopinanti ECH funkcija SW1990 kasos adenokarcinomos ląstelių linijoje. Tačiau reikia tolesnių tyrimų, stebinčių daugiau kasos vėžio ląstelių linijų. Įrodyta, kad onkogeninio baltymo RAS ir naviko slopintuvo p53 mutacijos yra susijusios su kasos vėžio vystymusi (31); tačiau SW1990 ląstelių linijoje nėra jokios p53 mutacijos, teigiama IARC p53 duomenų bazėje (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Todėl svarbu ištirti, ar ECH gali turėti įtakos kitų kasos vėžio ląstelių linijų, turinčių skirtingas p53 mutacijas, augimui ir proliferacijai. Be to, būtų įdomu nustatyti, ar ECH gali skatinti apoptozę ir slopinti kitų tipų navikų augimą.

Nustatyta, kad ROS aktyvumo padidėjimas ir MMP sumažėjimas, kuriuos sukėlė gydymas ECH, yra labai svarbūs indukuojant apoptozę (22). Be to, buvo nustatyta, kad ROS gali sukelti mitochondrijų porų oksidaciją, prisidedant prie citochromo išsiskyrimoc, tarpinis apoptozėje dėl MMP sutrikimo (22). Taigi dar reikia nustatyti, ar ECH netiesiogiai sutrikdo MMP indukuodamas ROS. Be to, įrodyta, kad ROS sukeltas oksidacinis stresas taip pat yra susijęs su daugybės ląstelių augimą kontroliuojančių signalų moduliavimu, įskaitant p53, NF-κB, HIF ir PI3K (32). Dar reikia nustatyti, ar ir, jei taip, kaip ECH reguliuoja šiuos svarbius signalizavimo kelius. Pažymėtina, kad oksidacinis stresas sukelia įvairias neurodegenercines ligas dėl didelio deguonies suvartojimo, silpnų antioksidacinių sistemų ir centrinės nervų sistemos terminalinės diferenciacijos savybių (33). Tačiau keli tyrimai parodė, kad ECH turi apsauginį ir anti-apoptotinį poveikį nervų audiniams. Šiuo atžvilgiu yra pagrįsta kelti hipotezę, kad ECH gali sumažinti ROS gamybą terminaluose diferencijuotose nervinėse ląstelėse. Todėl taip pat dar reikia nustatyti, ar ECH ros gamybos reguliavimas priklauso nuo ląstelių diferenciacijos statuso. Taigi dabartiniai rezultatai kartu su kitais tyrimais atskleidžia, kad ECH, plačiai naudojamas TCM, gali būti svarbi chemoterapinė strategija ne tik neurodegeneracinių ligų, bet ir piktybinių karcinomų gydymui.

Pastaruoju metu TCM naudojimas vėžio terapijoje sulaukė vis daugiau dėmesio. Natūralių produktų iš vaistinių augalų, naudojamų TCM, potencialą mokslo bendruomenė pripažino net vakarų pasaulyje (9). Reikia stengtis išsiaiškinti pagrindinius šių natūralių produktų veikimo mechanizmus, kurie galiausiai gali paskatinti sukurti veiksmingus ir saugius vaistus vėžio terapijai.

Apibendrinant, šis tyrimas parodė naviko slopinančią ECH funkciją ir taip pat detalizuoja molekulinį ECH sukelto naviko slopinimo pagrindą, taip parodydamas galimą klinikinį ECH taikymą vėžio terapijoje.

Padėkos

Šis tyrimas buvo finansuojamas ir remiamas pagal FMU pagrindinę mokslinių tyrimų programą (dotacija Nr. 09ZD014). Autoriai norėtų padėkoti Biomedworld (Šanchajus, Kinija) už pagalbą redaguojant rankraštį.

Nuorodos

1. Hanahanas D ir Weinbergas RA: vėžio požymiai: ateinanti karta. 144 langelis: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripcija: TRANSKRIPCIJOS POVEIKIS MYC. Nat Rev Vėžys 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ ir Roussel MF: Myc signalizacija per ARF naviko slopintuvą reguliuoja nuo p53 priklausomą apoptozę ir nemirtingumą. Genai Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K ir Mo YY: p53 slopina c-Myc indukuodamas naviko slopintuvą miR-145. Proc Natl Acad Sci JAV 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X ir Lu H: Naujos įžvalgos apie p53 funkcijas per tikslines mikroRNR. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB ir Lippard SJ: Cisplatina ir DNR taisymas vėžio chemoterapijoje. Tendencijos Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H ir Korc M: Aktinomicinas D sukelia apoptozę ir slopina kasos vėžio ląstelių augimą. Int J Vėžys 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P ir Dass CR: Doksorubicinas: naujausia informacija apie priešvėžinį molekulinį poveikį, toksiškumą ir naujas vaistų tiekimo sistemas. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS ir Kaina B: Nuo tradicinės kinų medicinos iki racionalios vėžio terapijos. Tendencijos Mol Med 13: 353-361, 2007.