ltKalba
Namuose / Išmanymas / Turinys

Išmanymas

Ishophloroglucin A, išskirtas iš Ishige Okamurae, slopina -MSH sukeltą melanogenezę: in vitro ir in vivo 2 dalis

Apr 03, 2023

3. Diskusija

sdasdad

Iš IOE išskirtas junginys DPHC jau buvo pranešęs apie tirozinazės slopinimąaktyvumas ir apsauginis poveikisnuo UV-B spinduliuotės sukelto ląstelių pažeidimoin vitro[8]; tačiauanti-melanogenezės poveikiskomponentų, gautų iš IOE in silico sąveikaujant sutirozinazė,in vivoatliekant fenotipo tyrimus su gyvūnų modeliais ir pagrindiniais jų molekuliniais mechanizmais,dar nebuvo išnagrinėti. Šiame tyrime nustatėme anti-melanogenezę ir tirozinazęIPA, florotanino, išskirto iš IO ir IOE, slopinamoji veikla zebrafish stuburiniame modelyjein vivo ir B16F10 melanomos ląstelėse in vitro, po indukcijos su -MSH.


Gydymas su Yra žinoma, kad MSH skatina melanino sintezę ir tirozinazės aktyvumą.20]. Be to, įrodyta, kad tirozinazė yra būtina melanogenezei.29]. Ankstesnės studijosparodė, kad molekulinis prijungimas gali būti naudojamas tirozinazės slopinamajam aktyvumui įvertinti [30,31]. Taigi, siekiant suprasti IPA įrišimo modelį, buvo atlikti molekulinio prijungimo skaičiavimaiir DPHC, žinomas polifenolis, išskirtas iš IO, kuris atskleidė didesnę surišimo energijąanti-melanogenezės aktyvumas nei arbutinas, kaip teigiama kontrolė. Pagal rezultatus (pav1), IPA atskleidė žemiausius prijungimo balus, kurie parodė, kad IPA sąveika su taikiniubaltymų tirozinazė buvo stipresnė už kitus du junginius – DPHC ir arbutiną. TačiauGrybų tirozinazės aktyvumo ir ląstelių slopinimo koreliacija yra ribotatirozinazės arba melanino gamyba kultivuotuose melanocituose [32]. Taigi, slopinamasis poveikisįjungta IPAtirozinazės aktyvumas ir melanogenezė buvo tiriami zebrafijojein vivomodelis ir pelės B16F10melanomos ląstelės.


Melanino pigmentai kaupiasi zebražuvės paviršiuje, todėl galima mikroskopiškai stebėtipigmentacijos procesas be sudėtingų eksperimentinių procedūrų, todėl jie yra tinkamas modelismelanogenezės inhibitorių atrankai [33,34]. Mes įvertinome melanino slopinamąjį poveikįIPAir IOE zebrafish lervos modelyje, kurį stimuliavo -MSH nustatant melanino kiekį.Visi išbandyti mėginiai darė didelį slopinamąjį poveikįzebrafish pigmentacija be reikšmingostoksiškumas (S2 pav.). Slopinantis poveikispigmentacija buvo pastebėta atliekant morfologinę analizęzebrafish lervos, susijusios su skirtingomisgydymas (pav2). Be to, ankstyvos stadijos lervų naudojimaso ne suaugusiųjų stadija suteikia dar vieną pranašumą tiriant perkutaninį poveikįvaistųarba kosmetiniai junginiai [33,35]. Šiuo atveju pasirinkome -MSH kaip induktorius tiek zebrafish in vivoir B16F10 melanomos ląstelėsein vitro. Pagal abu rezultatus zebrafish embrionuose ir B16F10melanomos ląstelių, melanino kiekis padidėjo - MSH stimuliacija.


Melanino kiekis tiesiogiai koreliuoja su tirozinazės aktyvumu ir baltymų kiekiu [36]. Todėl,nustatėme slopinamąjį poveikįIPA ir IOE dėl tirozinazės aktyvumo, kurį sukelia - MSH įjungtasB16F10 ląstelės. Mes nustatėme, kad IPA gydytoje grupėje sumažėjo tirozinazės aktyvumas ir sumažėjo melanino kiekisturinys, kurį skatina -MSH, sumažėjus tirozinazės aktyvumui maždaug 35 proc., o 40 procmelanino kiekis (pav4A, C). IOE slopino tirozinazės aktyvumą priklausomai nuo dozės iržymiai sumažino melanogenezę B16F10 ląstelėse (Pav4B, D). Palyginti su arbutinu, IPA irIOE turi reikšmingą slopinamąjį poveikįdėl melanino gamybos ir tirozinazės aktyvumo, kuris turėjoankstesnių molekulinio prijungimo tyrimų rezultatai.


Ištirti slopinamojo poveikio mechanizmąįjungta - MSH sukelta melanino sintezėląstelių, buvo atliktas Western blot tyrimas. Su melaninu susijusių baltymų ekspresijos lygiai, įskaitantBuvo įvertinti ERK, JNK ir p38 po gydymo IPA arba IOE. Suaktyvintas fosforilinimasERK gali skatinti MITF skaidymą per nuo ubikvitino ir proteasomų priklausomą kelią [28]. Tai rodo, kad galimi melanogenezės inhibitoriai gali slopinti melanino sintezę skatindamiMITF proteasominis skilimas, kuris buvo susijęs su ERK signalizacijos aktyvavimukeliai [37]. ERK, JNK ir p38 MAPK priklauso MAPK šeimai [38–40]. Papildomai,p38 MAPK kelio sukeltos MITF ekspresijos aktyvacija [41]. Šiame tyrime Western blotanalizė atskleidė, kad IPA skatina p-JNK ir p-p38 (pav5B, C). Priešingai, p-ERK lygiainepasikeitė gydant IPA ir IOE (Pav5A). Šie rezultatai rodo, kad slopinamasis poveikisIPA ir IOE tirozinazės aktyvumas ir melanogenezė gali būti susiję su JNK ir p38signalizacijos keliai.

4. Medžiagos ir metodai

4.1. Cheminės medžiagos ir reagentai

Dimetilsulfoksidas (DMSO), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromidas (MTT),L-DOPA, alfa melanocitus stimuliuojantis hormonas ( -MSH) ir fosfatiniu buferiufiziologinis tirpalas (PBS)buvo įsigyti iš Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, JAV). Dulbecco modifikuotasEagle terpė (DMEM) ir vaisiaus galvijų serumas (FBS) buvo gauti iš Invitrogen-Gibco(Grand Island, NY, JAV). Tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė (ERK1/2), fosforilintas ERK1/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-galinė kinazė (JNK), fosforilinta JNK (p-JNK), p38, fosforilintap38 (p-p38), cAMP atsako elementą surišantis baltymas (CREB), fosforilintas CREB (p-CREB),su mikroftalmija susijęs transkripcijos faktorius (MITF), su tirozinaze susijęs baltymas-1 (Trp-2),su tirozinaze susijęs baltymas -1 (Trp-1), tirozinazė (TYR), antikūnai prieš pelių ir triušių IgGbuvo įsigyti iš Cell Signaling Technology (Beverly, MA, JAV). Visi kiti reagentai, įskaitant -MSH, buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich Chemical Co.

4.2. Tirozinazės molekulinis prijungimas

Atliekant prijungimo tyrimą, tirozinazės kristalinė struktūra (PDB: 3NM8) buvo gauta išBaltymų duomenų bankas. Prijungimo tyrimai buvo atlikti naudojant CDOCKER„Accelrys Discovery Studio 3“.{1}} („Accelrys, Inc.“, San Diegas, CA, JAV). Kai visas nukleotidasseka yra padengta receptorių tinkleliu, manoma, kad ligandai pasirenka geriausią prijungimo padėtį [42]. Prijungimo procedūra buvo paminėta ankstesniame tyrime. Trumpai tariant, buvo atlikti trys žingsniai: (1)2D struktūros pavertimas 3D struktūra; 2) mokesčių apskaičiavimas; ir (3) pridėjimasvandenilio atomai naudojant lanksčią prijungimo programą [31,43]. 

4.3. IOE paruošimas ir IPA išskyrimas

IO buvo nuimtas 2018 m. birželio mėn. rytinėje Jeju salos pakrantėje, Korėjoje. Dumbliai buvo nuplauti du kartusvandentiekio vandeniu, kad pašalintumėte prie paviršiaus prilipusias druskas, epifitus ir smėlį. Toliau buvo kruopščiainuplaunamas gėlu vandeniu ir buvo laikomas medicininiame šaldytuve−20 ◦C. Po to sušaldytiprieš ekstrahavimą dumbliai buvo liofilizuoti ir homogenizuoti trintuvu. IOE buvo išgauta 50 procetanolis (v/v, vandenyje), maišant 24 valandas kambario temperatūroje, po to filtruojamas. Filtratasekstraktas buvo sukoncentruotas dekompresijos sąlygomis ir liofilizuotas iki miltelių (IOE). 50 procentų etanolisIO ekstraktą atliko Shinwoo Co. Ltd. (partijos Nr. SW9E29SA, Gyeonggi-do, Korėja). IPA buvoizoliuotas nuo IOE, kaip aprašyta anksčiau [9]. Trumpai tariant, IOE buvo frakcionuotas naudojant išcentrinįpasiskirstymo chromatografija. Visos frakcijos buvo surinktos ir IPA galiausiai buvo išgrynintas apusiau paruošiamoji HPLC kolonėlė (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). IPA buvo nustatytas kaip apolifenolis ir jo cheminė struktūra (S1 paveikslas, papildomos medžiagos) buvo identifikuoti naudojant LC/MSanalizė su masem/z 992.1315, taigi nurodant C molekulinę formulę96H66O48 (1986.26 mapskaičiuota molekulinė masė,∆0.6, [M − 2H] 2−). 

4.4. Tėvų zebrafish kilmė ir priežiūra

Suaugę zebražuviai buvo gauti iš komercinio pardavėjo (Seulo akvariumas, Seulas, Korėja) ir 10žuvys buvo konservuotos 3-L akrilo bake 28,5 val◦C, su 14:10 h šviesos: tamsos ciklu. Zebrafish buvomaitinamas du kartus per dieną, 6 dienas⁄savaitę su papildomu Tetramino dribsnių maistu (SEWHAPET Food Co.,Seulas, Korėja). Embrionai buvo surinkti per 30 minučių natūraliu neršto būdu ir sukelti ryteįjungus šviesą. Zebrafish eksperimentas gavo patvirtinimą iš gyvūnų priežiūros ir naudojimoČedžu nacionalinio universiteto komitetas (patvirtinimo Nr. 2017-0001).

4.5. Melanino kiekio zebrafish lervose matavimas

IPA ir IOE bei stimuliatorius -MSH koncentracijos buvo naudojamos tiriant poveikįapiesutelkti dėmesį į embriono vystymąsi. Kiekviename buvo pasėta penkiolika zebrafish embrionų (3–4 AG).šulinėlį, kuriame yra 1,9 ml embriono terpės, 12-šulinėlių sėjimo plokštelėje. Tiriami mėginiai buvo ištirpinti1 proc. DMSO su 1× PBS ir gerai išmaišyti. Kiekvieną rytą pirmieji 5 pdf buvo gyvybingi embrionaisurašyti, kad gautų išgyvenimo priemonę. Norint nustatyti melanino kiekį, embrionai at7–9 hpf buvo pasėta į 6-šulinėlių plokštelę su 30 embrionų kiekviename šulinyje į 27-mL embriono terpę.Po 3 dienų lervos du kartus nuplaunamos 1× PBS, kad pašalintumėte visus likusius reagentus arbadalelių ir panašus lervų kiekis buvo patalpintas į e-vamzdelius. Prieš matuojant melanino kiekįturinį, mikroskopu buvo užfiksuotos kelios kiekvienos grupės lervos, o likusios centrifuguojamos.


Po centrifugavimo nuosėdos buvo ištirpintos 1 ml 1 N NaOH 90 ° C temperatūroje◦C 60 min. Mišinyspo to buvo energingai maišomas, kad ištirptų melanino pigmentas. Supernatanto absorbcija buvomatuojamas ties 490 nm. Rezultatas buvo lyginamas su kontroline medžiaga, kuri buvo laikoma vienašimtas. Melanino kiekis buvo kalibruojamas pagal baltymų kiekį ir stebėjimai kartojamitrimis egzemplioriais.

4.6. IPA ir IOE citoksiškumas B16F10 ląstelėse

B16F10 pelių melanomos ląstelės buvo gautos iš ATCC (American Type Culture Collection,Manasas, VA, JAV). B16F10 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM, papildytu 100 V/ml penicilino,100 µg/ml streptomicino ir 10 procentų FBS. Tada ląstelės buvo inkubuojamos 5 procentų CO atmosferoje2 adresu37 ◦C ir po to buvo subkultūrinami kas 3–5 dienas. IPA ir IOE citotoksiškumas prieš B16F10ląstelės buvo tiriamos naudojant kolorimetrinį MTT tyrimą. Trumpai tariant, ląstelės buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokšteles a

koncentracija 2× 104ląstelės/ml. Maždaug 16 valandų po sėjos ląstelės buvo inkubuojamos su IPA ir IOEskirtinguosekoncentracijos 72 val., ir nustatytas jų gyvybingumas.

4.7. Ląstelių melanino kiekio nustatymas

Ląstelių melanino kiekis buvo matuojamas naudojant anksčiau aprašytą metodą [33]. Ląstelės(2 × 104 ląstelės/ml) buvo inkubuojami su įvairiomis IPA ir IOE koncentracijomis 72 valandas; todėl,jie buvo plaunami lediniame PBS. Trumpai tariant, ląstelės buvo inkubuojamos 80 laipsnių temperatūroje◦C 1 valandą 1 ml 1 NNaOH/10 procentų DMSO ir po to maišomi sūkuryje, kad ištirptų melaninas: absorbcija buvo matuojama esant450 nm. Manoma, kad optinis slopinimo tankis kontrolėje yra 100 procentų. Duomenys yrapateikti vidutinių procentų forma, o rezultatai buvo pakartoti trimis egzemplioriais.

















Tau taip pat gali patikti