Lizosomų lipidų peroksidacija reguliuoja naviko imunitetą

Lizosomų slopinimas, kurį sukelia palmitoilbaltymų tioesterazės 1 (PPT1) inhibitoriai, tokie kaip DC661, gali sukelti ląstelių mirtį, tačiau to mechanizmas nėra visiškai suprantamas. Norint pasiekti citotoksinį DC661 poveikį, nebuvo reikalingi užprogramuoti ląstelių mirties būdai (autofagija, apoptozė, nekroptozė, ferroptozė ir piroptozė). Katepsinų slopinimas arba geležies ar kalcio chelatacija nepadėjo išgelbėti DC 661-sukelto citotoksiškumo. PPT1 slopinimas sukėlė lizosomų lipidų peroksidaciją (LLP), dėl kurios įvyko lizosomų membranos pralaidumas ir ląstelių mirtis, kurią galėjo pakeisti antioksidantas N-acetilcisteinas (NAC), bet ne kiti lipidų peroksidacijos antioksidantai. Lizosominis cisteino transporteris MFSD12 buvo reikalingas NAC intralizosominiam transportavimui ir LLP gelbėjimui. PPT1 slopinimas sukėlė ląstelėms būdingą imunogeniškumą su kalretikulino ekspresija paviršiuje, kurį buvo galima pakeisti tik naudojant NAC. DC661-apdorotos ląstelės paskatino naivias T ląsteles ir sustiprino T ląstelių sukeliamą toksiškumą. Pelės, paskiepytos DC661-gydytomis ląstelėmis, sukėlė adaptyvų imunitetą ir naviko atmetimą esant „imuniniams karštiems“ navikams, bet ne „imuniniams šaltiems“ navikams. Šie atradimai rodo, kad LLP skatina lizosomų ląstelių mirtį, unikalią imunogeninę ląstelių mirties formą, nurodant kelią į racionalų imunoterapijos ir lizosomų slopinimo derinį, kurį galima išbandyti klinikiniuose tyrimuose.

Cistanche tubulosa-Antitumor pranašumai

Įvadas

Skatinanti veikla klinikiniuose tyrimuose, kuriuose dalyvauja lizosomų inhibitorius hidroksichlorokvinas (HCQ) (1), palmitoilbaltymų tioesterazės 1 (PPT1) identifikavimas kaip chlorokvino darinių molekulinis taikinys (2) ir naujų PPT1 inhibitorių paleidimas į klinikinę. tyrimų (3, 4), reikia suprasti mechanizmą, kuriuo lizosomų inhibitoriai sukelia ląstelių mirtį, ir lizosomų slopinimo poveikį naviko imunitetui. Kanoninis lizosomų ląstelių mirties mechanizmas, aprašytas HCQ, apima lizosomų membranų pralaidumą (LMP), katepsinų nutekėjimą ir kaspazės sukeltos apoptozės aktyvavimą (5, 6). Anksčiau mes parodėme, kad lizosomų inhibitorius DC661 prasiskverbia į ląsteles rūgštinėje naviko mikroaplinkoje ir lokalizuojasi lizosomoje efektyviau nei HCQ (2, 7). DC661 sukelia stiprią ląstelių mirtį daugelyje vėžio ląstelių linijų (2). DC661 jungiasi ir slopina PPT1, mažina lizosomų rūgštingumą ir slopina autofagiją. DC661 taip pat sukelia LMP ir padidina suskaidytos kaspazės 3 lygį (2, 7). Pastaraisiais metais buvo apibrėžti nauji ląstelių mirties mechanizmai, turintys imunogeninių pasekmių, įskaitant nekroptozę, ferroptozę ir piroptozę (8). Įrodyta, kad nuo lizosomų priklausoma autofagija ardo I klasės MHC (9), taip pat imunoproteasomos komponentus (10), o tai rodo, kad autofagijos slopinimas gali sustiprinti antigenų apdorojimą. Tačiau imunogeninis lizosomų slopinimo ir dėl to kylančios ląstelių mirties poveikis nebuvo visiškai apibūdintas. Norėdami pašalinti šią žinių spragą, ištyrėme DC661 poveikį kanoniniams ląstelių mirties mechanizmams, kad nustatytų, ar lizosomų ląstelių mirtis yra jos ląstelių mirties forma, ar tiesiog vieno iš kitų nustatytų mechanizmų pirmtakas. Mes nustatėme, kad HCQ ir DC661 sukėlė reikšmingą tik nedaugelio baltymų padidėjimą melanomos proteome ir dauguma jų buvo su autofagija ir apoptoze susiję baltymai. Užprogramuotos ląstelių mirties inhibitoriai (apoptozė, nekroptozė, ferroptozė ir piroptozė) nesumažino citotoksinio poveikio po lizosomų pažeidimo DC661. Lizosomų lipidų peroksidacija (LLP) yra pagrindinis LMP sukeltos ląstelių mirties, susijusios su kalretikulino (CALR) ekspresija ląstelės paviršiuje, veiksnys. Šią ląstelių mirties formą galima pakeisti tik naudojant antioksidantą N-acetilcisteiną (NAC). NAC aktyvumą pablogino lizosominio cisteino importuotojo MFSD12 slopinimas. LLP sukėlė imunogeninius fenotipus, skatinančius T ląstelių sukeltą žudymą. Šie radiniai rodo, kad lizosomų ląstelių mirtis yra potencialiai unikali imunogeninės ląstelių mirties forma.

cistanche augalą stiprinanti imuninė sistema

Rezultatai

Lizosomų slopinimas sukelia reikšmingus proteomo pokyčius, susijusius su autofagija ir apoptoze. Norėdami nustatyti lizosomų inhibitorių citotoksinį poveikį, įvertinome A375P melanomos, RKO gaubtinės žarnos karcinomos ir MIA PaCa-2 kasos vėžio ląstelių linijų, apdorotų vakuoliniu H+-ATPazės inhibitoriumi bafilomicinu-A1, gyvybingumą (1). 00 nM); PPT1 inhibitoriai DC661 (3 μM) arba HCQ (10 μM arba 30 μM); palmitato mimetikas heksadecilsulfonilfluoridas (HDSF; 60 μM); katepsino inhibitoriai pepstatinas A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) arba PepA+E64; ir lizosomų membraną ardančio vaisto Leu-Leu metilo esterio hidrobromido (20 μM) 48 valandas. Tik bafilomicinas-A1 ir DC661 sukėlė reikšmingą ląstelių gyvybingumo sumažėjimą vėžio ląstelių linijose (1A paveikslas ir 1A papildomas paveikslas; papildoma medžiaga, prieinama internete su šiuo straipsniu; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), gaminant DC661 didesnis ląstelių gyvybingumo sumažėjimas nei bafilomicinas-A1. Remdamiesi šiais duomenimis ir farmakologinėmis į vaistus panašiomis chlorokvino darinių savybėmis, tyrime daugiausia dėmesio skyrėme chlorokvino dariniams kaip priemonėms suprasti lizosomų ląstelių mirtį. Nešališka visuotinė proteomų analizė buvo taikoma A375P melanomos ląstelėms, apdorotoms DC661 (3 μM) arba mažiau stipriu HCQ (10 μM arba 30 μM) 24 valandas. Iš 4 264 didelio patikimumo kiekybiškai įvertintų baltymų tik 87 ir 55 baltymai buvo reikšmingai padidinti atitinkamai naudojant DC661 (3 μM) ir HCQ (30 μM); Be to, atitinkamai DC661 (3 μM) ir HCQ (30 μM) žymiai sumažino 14 ir 15 baltymų (absoliutus kartotinis pokytis didesnis nei 2; q < 0,05) atitinkamai naudojant DC661 (3 μM) arba HCQ (30 μM). , lyginant su transporto priemonės valdymu. Mažesnė HCQ dozė (10 μM) neparodė reikšmingų baltymų pokyčių, palyginti su nešiklio kontrole. 50 geriausių baltymų, kurie žymiai padidėjo po gydymo DC661, daugiausia buvo susiję su autofagija ir apoptoze, ir panašūs pokyčiai buvo pastebėti vartojant didesnę HCQ dozę (1B pav.). Dėl šių priežasčių nusprendėme tolesnius tyrimus sutelkti į stipresnį DC661. Kai kurių didžiausių baltymų pokyčių, susijusių su autofagija ir apoptoze, pavyzdžiai buvo mokesčių{62}}rišantis baltymas 1 (TAX1BP1; padidėjo 15- kartus); BCL2-sąveikaujantis baltymas 3 (BNIP3; padidėjęs 6- kartus); BRCA1 geno 1 baltymo kaimynas (NBR1; padidėjęs 12- kartus); sekvestosoma-1 (SQSTM1/p62; padidėjęs 5-karto); branduolinio receptoriaus koaktyvatorius 4 (NCOA4; padidintas 3- kartus); ir LC3B (MAP1LC3B; padidėjo 3- kartus). Apolipoproteinas B-100 (APOB; padidėjęs 66- kartus) buvo gautas iš veršelio vaisiaus serumo ir toliau nebuvo tiriamas. Imunoblotavimas patvirtino, kad gydymas DC661 ar didesnėmis HCQ koncentracijomis žymiai padidino autofagijos krovinių receptorių NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 ir NCOA4 ekspresiją priklausomai nuo dozės ir laiko (papildomas 1 paveikslas, B ir C). PPT1 CRISPR / Cas9 KO A375P ląstelėse fenokopijavo DC661 poveikį šiems baltymams, palyginti su jų WT kolegomis (papildomas 1D paveikslas). Tačiau autofagijos krovinių receptorių ekspresija ir santykinis padidėjimas, sukeltas gydymo DC661, buvo kintamas gaubtinės žarnos vėžio, kasos vėžio ir kitų melanomos ląstelių linijose, kuriose DC661 demonstruoja citotoksiškumą (papildomas 1E paveikslas). Tai leido manyti, kad patys autofagijos krovinių receptoriai, nors ir padidėjo baltymų lygiu, mažai tikėtina, kad būtų atsakingi už ląstelių mirtį po gydymo DC661. Norėdami tai patvirtinti, mes sutelkėme dėmesį į autofagijos krovinių receptorius TAX1BP1 ir BNIP3, nes jie turi žinomą proapoptotinį poveikį vėžio ląstelėse (1C pav.). TAX1BP1 yra autofagijos krovinio adapteris (11) ir taip pat reguliuoja apoptozę, kurią sukelia baltymų sintezės inhibitoriai arba DNR žalingi agentai vėžio ląstelėse (12). TAX1BP1 numušimas siRNR (1D pav.) neturėjo įtakos DC{119}}sukeltam citotoksiškumui atliekant trumpalaikius (1E pav.) ir ilgalaikius gyvybingumo tyrimus (1F pav.). Šie rezultatai parodė, kad TAX1BP1 neatlieka esminio vaidmens DC{126}}sukeliamam citotoksiškumui. BNIP3 yra proapoptotinis baltymas, kuris pažeidžia mitochondrijų bioenergetiką ir reguliuoja mitofagiją (13). Veiksmingas BNIP3 numušimas (1G pav.) neturėjo įtakos DC{131}}sukeltam citotoksiškumui (1, H ir I paveikslai). Šie rezultatai parodė, kad citotoksinis DC661 poveikis nepriklauso nuo BNIP3 ekspresijos. Toliau ištyrėme kanoninių autofagijos genų, reikalingų autofagosomų gamybai, ląstelių išeikvojimą DC661 veiksmingumui, pašalindami unc{136}}, pvz., autofagiją aktyvuojančią kinazę 1 (ULK1) ir su autofagija susijusį geną 7 (ATG7). Veiksmingas ULK1 arba ATG7 numušimas (papildomas 2 paveikslas, A ir B) slopino autofaginį srautą (papildomas 2C paveikslas), bet neturėjo įtakos DC 661- sukeltam citotoksiškumui (1 pav., J–M). Šie rezultatai parodė, kad esminės pagrindinės autofagijos mechanizmo nebuvimas nepanaikina DC661 citotoksinio poveikio. Lizosomų slopinimas DC661 sukelia daugybę užprogramuotų ląstelių mirties būdų. Kanoninis požiūris yra tas, kad lizosomų ląstelių mirtis atsiranda dėl apoptozės (5). Imunoblotavimas atskleidė, kad gydymas DC661 sukėlė kaspazės -3, -7 ir -9 aktyvavimą bei PARP-1 skilimą, o tai patvirtino, kad DC661 aktyvavo apoptozę (2A pav.). Pan-kaspazės inhibitorius Z-VAD-FMK užkirto kelią kaspazės aktyvacijai DC661, bet neslopino LC3B ir p62 kaupimosi, parodydamas, kad apoptozės aktyvacija ir autofagijos blokada yra atskiriami po lizosomų slopinimo (2B pav.). Apoptozės blokavimas naudojant ZVAD-FMK nepadidino ir neapribojo DC661 citotoksiškumo, o tai rodo, kad lizosomų ląstelių žūčiai apoptozės nereikia (2 pav., C ir D). Citotoksinis DC661 poveikis buvo panašus Bax / Bak dvigubo KO pirminėse kaulų čiulpų ląstelėse, kurios negali patirti apoptozės, ir WT ląstelėse (2E pav.). Apoptozės blokada neturėjo įtakos DC{171}}sukeltam citotoksiškumui gaubtinės žarnos vėžio ir kasos vėžio ląstelėse (2 papildomas paveikslas, D–F). Kadangi nustatėme, kad DC{173}}sukeltai ląstelių žūčiai apoptozė nebūtina, ištyrėme, ar DC661 sukelia nekroptozę – kitą užprogramuotos ląstelių mirties formą, reguliuojamą su receptoriais sąveikaujančios proteinkinazės (RIPK) ir mišrios linijos kinazės domeno tipo baltymo. MLKL). Fosforilintų ir aktyvuotų RIPK ir MLKL formų lygis po gydymo DC661 padidėjo nuo 0,1–1 μM (2F pav.). Esant 3 μM DC661, nebuvo fosforilinto RIPK1, bet nuolat fosforilintas MLKL, o tai rodo, kad esant šiai didesnei koncentracijai, gali atsirasti papildomų ląstelių mirties formų. Išankstinis apdorojimas RIPK1 inhibitoriais nekrostatinu-1 arba nekrotinu-1 arba MLKL inhibitoriumi nekrosulfonamidu neleido RIPK1 fosforilinti po gydymo DC661 (1 μM) melanomos ląstelėse (2G pav.), bet nepavyko išgelbėti DC{{192 }}sukeltas citotoksiškumas melanomos ląstelėse (2H pav.) arba gaubtinės žarnos vėžio arba kasos vėžio ląstelėse (papildomas 2G paveikslas). Šie radiniai rodo, kad nekroptozė yra suaktyvinta, bet jos negalima dėl DC{195}}sukeliamos ląstelių mirties.

1 pav. Lizosomų autofagijos slopinimas sukelia reikšmingus apoptozės ir autofagijos baltymų pokyčius. (A)

Lizosomos yra viena iš pagrindinių geležies saugojimo vietų. Nereguliuojamas tarpląstelinis geležies metabolizmas kartu su sumažėjusiu redukciniu pajėgumu gali sukelti neapoptotinę ląstelių mirtį, vadinamą ferroptoze. Būdingas ferroptozės požymis yra prostaglandino endoperoksido sintazės 2 (PTGS2), katijonų transportavimo reguliatoriaus homologo 1 (CHAC1) ir cisteino-tRNR sintetazės (CARS) reguliavimas (14). Visi 3 iš šių ferroptozės žymenų buvo transkripciškai reguliuojami gydant DC661 (3A pav.), o tai rodo, kad lizosomų slopinimas sukelia ferroptozę. DC661 sukėlė fluorescencijos poslinkį C11 – BODIPY apdorotose A375P ląstelėse, o tai rodo lipidų peroksidaciją, būdingą ferroptozei. Šis DC661-sukeltas poslinkis buvo reikšmingai priešingas, kai buvo vartojami ferroptozės inhibitoriai ferostatinas-1 arba lūpų roksstatinas-1, kurių koncentracija buvo veiksminga (3B pav. ir 3A papildomas paveikslas), tai dar labiau rodo, kad DC661 sukelta ferroptozė. Tačiau ferroptozės slopinimas neišgelbėjo su DC661 susijusio citotoksiškumo (3 pav., C ir D). Vėžinių ląstelių gydymas geležies chelatoriumi deferoksaminu (DFO) ir DC661 neišgelbėjo DC661 citotoksiškumo (3E pav.). Gydymas ferostatinu-1, lūpų roksstatinu-1 arba DFO neišgelbėjo DC661 trumpalaikio gyvybingumo arba ilgalaikio klonogeninio augimo melanomos, gaubtinės žarnos ir kasos vėžio ląstelėse slopinimo (papildomas 3 paveikslas, B –E ir papildomas 4 paveikslas, A–D). Šie duomenys rodo, kad ferroptozė yra suaktyvinta, bet jos negalima, kad dingtų DC{31}}sukeltas ląstelių mirtis. Piroptozė yra užprogramuotos ląstelių mirties forma, susijusi su uždegiminiu atsaku, kuris apima gastriną (GSDM) apdorojančių kaspazių aktyvavimą, todėl plazmos membranoje susidaro poros ir vėliau išsiskiria su pažeidimais susiję molekuliniai modeliai, tokie kaip didelis mobilumas. 1 grupės dėžutė (HMGB1). Gydymas DC661 daugybinėse melanomos ląstelių linijose (A375P, A375, WM35 ir WM793) suaktyvino iniciatoriaus kaspazę-8 ir -9 bei budelio kaspazę-7, būdingą piroptozei, ir pagamino viso ilgio GSDME skilimas, panašus į žinomą piroptozės induktorių PLX4720 ir PD0325901 (papildomas 5A paveikslas). DC661 sukėlė stipresnį ekstraląstelinį HMGB1 išsiskyrimą nei žinomas piroptozės induktorius BRAF ir MEK slopinimas 1% FBS (15), atspindintis aktyvuotos piroptozės funkcines pasekmes. Toliau išbandėme, ar piroptozės slopinimas GSDME KO pagerintų citotoksinį DC661 poveikį. Gydymas DC661 sukėlė LC3II ir SQSTM1 / p62 kaupimąsi ir kaspazės aktyvaciją, tačiau HMGB1 išsiskyrimas buvo beveik visiškai panaikintas GSDME-KO WM35 žmogaus ląstelėse, parodydamas, kad buvo pasiekta funkcinė piroptozės slopinimo pasekmė (3F pav.). Tačiau gydymas DC661 sukėlė vienodą citotoksiškumą YUMM1.7 WT, tuščiame vektoriuje (EV) ir Gsdme KO1 ir KO2 ląstelėse tiek 10%, tiek 1% FBS sąlygomis (3G paveikslas ir papildomas 5B paveikslas). Viena dažna daugelio ląstelių mirties formų pasekmė yra LDH išsiskyrimas. DC661 žymiai padidino LDH išsiskyrimą, ir to negalėjo pakeisti apoptozė, nekroptozė ar ferroptozės slopinimas (papildomas 5C paveikslas). Šie rezultatai parodė, kad DC661 sukelia daugybę ląstelių mirties būdų, įskaitant apoptozę ir piroptozę, taip pat nekroptozę ir ferroptozę, tačiau nė vienas iš šių ląstelių mirties būdų nėra reikalingas DC{73}}sukeltai ląstelių žūčiai. Katepsino slopinimas arba kalcio chelatacija neapsaugo nuo ląstelių mirties dėl lizosomų membranos pralaidumo. Įrodžius, kad kaspazės aktyvinimas (kuris reikalingas apoptozei ir piroptozei) yra būtinas DC 661-sukeltai ląstelių žūčiai, iškėlėme hipotezę, kad katepsino išsiskyrimas iš lizosomų gali sukelti nuo kaspazės priklausomą ląstelių mirtį. Cheminis (DC661) arba genetinis (PPT1 siRNR [siPPT1]) PPT1 slopinimas sukėlė lizosomų membranos pralaidumą (LMP), o HDSF, mažiau stiprus negrįžtamas PPT1 inhibitorius, kuris greitai išsenka ląstelių kultūroje, negalėjo sukelti LMP, kaip matuojama. dėl galektino{82}} – teigiamos puncta (4A pav.). Dėl LMP į citoplazmą išsiskiria katepsinai ir kitas lizosominis turinys, ir manoma, kad tai yra pagrindinė proksimalinė lizosomų ląstelių mirties savybė. DC661 sukeltas LMP buvo susijęs su reikšmingu citoplazminio katepsino-L aktyvumo padidėjimu, kuris buvo reikšmingai užblokuotas cisteino proteazės inhibitoriumi E64 (4B pav.). Ankstesnėse ataskaitose buvo teigiama, kad katepsino išsiskyrimas iš lūžusių lizosomų skatina kaspazės aktyvaciją, dėl kurios miršta apoptozinė ląstelės (16–18). Visiškas katepsino slopinimas neapsaugo nuo kaspazės skilimo (4C pav.) ir neišgelbėjo DC661-sukelto citotoksiškumo atliekant trumpalaikius ir ilgalaikius gyvybingumo tyrimus sergant melanoma (4 pav., D ir E), gaubtinės žarnos vėžiu ir kasos vėžiu. vėžio ląstelės (6 papildomas paveikslas, A–C). Šie rezultatai prieštarauja kanoniniam požiūriui į lizosomų ląstelių mirtį, kurią lemia katepsino sukelta ląstelių mirtis. Be katepsino išsiskyrimo iš nesandarių lizosomų, kalcio išsiskyrimas iš lizosomų buvo susijęs su ląstelių disfunkcija, kai sutrinka PPT1 (19). Gydymas DC661 sukėlė didelį kalcio išsiskyrimą, kuris buvo panaikintas iš anksto apdorojant nuolatinį kalcio (Ca{101}}) chelatorių BAPTA-AM. (4F pav.). Pažymėtina, kad BAPTA-AM neapsaugojo nuo DC{105}}sukelto LMP (4G pav.) arba kaspazės skilimo (papildomas 6, D ir E paveikslas) ir, svarbiausia, neapsaugojo nuo DC{108}}sukelto citotoksiškumo ( 4H pav.). Šie radiniai taip pat buvo pastebėti tiek RKO, tiek MIA PaCa{110}} ląstelių linijose, kuriose nebuvo pastebėta jokių reikšmingų IC50 verčių skirtumų naudojant BAPTA-AM ir DC661 (papildomas 6F paveikslas), o tai rodo, kad su LMP susijusi ląstelių mirtis nepriklauso nuo kalcio ar katepsinų.

2 pav. DC661-sukelta apoptozė ir nekroptozė. (A)

3 pav. DC661-sukelta ferroptozė ir piroptozė. (A)

LLP varo LMP. Nustačius, kad pagrindinių ląstelių mirties takų (apoptozės, nekroptozės, ferroptozės ir piroptozės), katepsinų (PepA ir E64) ir jonų chelatorių (BAPTA-AM [Ca2+] ir DFO [Fe{{3}) inhibitoriai. }]) neapsaugojo nuo ląstelių mirties dėl DC661 ir radę C-11-BODIPY lipidų peroksidacijos įrodymų, atlikome visuotinę lipidomų analizę praėjus 2 ir 4 valandoms po gydymo DC661. DC661 sukėlė ankstyvą ir ilgalaikį 3- iki 10- kartų padidėjimą kiekvienoje lizofosfolipidų klasėje (5A pav.). Priešingai, fosfolipidų klasėse, įskaitant fosfatidilcholiną, fosfatidiletanolaminą, fosfatidilseriną, fosfatidilinozitolį, fosfatidilglicerolį ir fosfatido rūgštį, pakitimai buvo minimalūs arba jų nebuvo (papildomas 7A paveikslas). Lizofosfolipidų rūšis gali generuoti ROS, kuri oksiduoja sočiųjų riebalų rūgščių grandinę, kurią vėliau atskiria fosfolipazės (20). Siekdami nustatyti, ar antioksidantai gali užkirsti kelią ROS sukeliamam lipidų pažeidimui, ištyrėme DC661-sukeltą citotoksiškumą, esant visos ROS šalintojui N-acetilcisteinui (NAC) (21, 22) ir tariamiems lipidų peroksidacijos inhibitoriams Trolox (23). ) ir vitamino C (askorbo rūgšties) (24, 25). Skirtingai nei bet kuris kitas iki šiol išbandytas agentas, bendras gydymas NAC išgelbėjo su DC661- susijusį citotoksiškumą keliose ląstelių linijose (5B pav. ir 7B papildomas paveikslas). Ilgalaikiai CFU tyrimai parodė, kad NAC, skirtingai nei visi čia tirti ląstelių žūties inhibitoriai, jonų chelatoriai ir katepsino inhibitoriai, užkirto kelią citotoksiniam DC661 poveikiui A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 ir MC38 ląstelėse. 5C paveikslas ir papildomas 7C paveikslas). Įdomu tai, kad Trolox ir vitaminas C neišgelbėjo DC661 citotoksiškumo žmogaus melanomos, gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio, kasos vėžio ląstelių ir pelių melanomos bei gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląstelėse (5D pav. ir 7 papildomas paveikslas, D – H). Šis skirtumas paskatino mus patikrinti, ar NAC, Trolox ir vitaminas C paveikė LMP. Mūsų rezultatai parodė, kad NAC buvo vienintelis antioksidantas, reikšmingai sumažinęs DC661-sukeliamą LMP (5E pav.). Iškėlėme hipotezę, kad LLP skatina LMP gamybą DC661, kurią gali pakeisti NAC, bet ne Trolox ir vitaminas C. Norėdami ištirti LLP procesą, naudojome fluorescencinį zondą FOAM-LPO (26), kuris konkrečiai lokalizuojasi lizosomoje ir gamina. spektrinis poslinkis nuo 586 iki 512 nm (raudonos iki žalios), kai veikia lipidų peroksidai. Mes nustatėme, kad DC661 sukėlė LLP, palyginti su kontrole (5F pav.). NAC sumažino lipidų peroksidaciją DC661-gydytų melanomos ląstelių lizosomose, o Trolox ir vitaminas C nesugebėjo sumažinti LLP (5F pav.). NAC, Trolox ir vitaminas C atskirai neturėjo reikšmingos įtakos lipidų peroksidacijai. PPT1 numušimas (papildomas 8A paveikslas) arba gydymas didelėmis HCQ koncentracijomis (papildomas 8B paveikslas) taip pat sukėlė LMP, kurį NAC galėjo pakeisti, o cheminis ULK1 slopinimas nesukėlė LMP (papildomas 8C paveikslas). Svarbu, kad siPPT1 numušimas taip pat apėmė LLP, kurią galima pakeisti naudojant NAC (papildomas 8D paveikslas). Šie rezultatai parodė, kad PPT1 slopinimas sukelia LLP, kurį gali išgelbėti NAC, ir tai greičiausiai yra PPT1- slopinimo sukelto LMP priežastis. Be to, šie rezultatai rodo, kad LLP yra labai svarbus lizosomų ląstelių mirčiai.

Kinijos žolė cistanche augalas-Antitumor

Cisteino importas į lizosomas MFSD12 sumažina lizosomų ląstelių mirtį. Iš 3 lipidų peroksidacijos inhibitorių tik NAC užkirto kelią LLP. Neseniai paskelbta ataskaita parodė, kad pagrindinis fasilitatoriaus superšeimos domenas, kuriame yra 12 (MFSD12), yra esminis lizosomų ir melanosomų cisteino importuotojo komponentas (27). Mes samprotavome, kad NAC arba jo metabolitas cisteinas per MFSD12 yra pernešamas į lizosomą, kur cisteinas oksiduojamas į jo disulfidą, cisteiną. Norėdami patikrinti šią hipotezę, palyginome NAC gebėjimą išgelbėti DC661 citotoksiškumą siNT ir siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP ląstelėse. Mūsų rezultatai parodė, kad NAC išgelbėjo DC661-sukeltą LMP siNT ląstelėse, bet neišgelbėjo LMP siMFSD12 ląstelėse (6A pav.). NAC sumažino DC661-apdorotų siNT-A375P ląstelių, bet ne siMFSD12 ląstelių, LLP. siMFSD12 ląstelės, apdorotos DMSO arba NAC, padidino bazinį LLP (6B paveikslas), palyginti su siNT ląstelėmis. Nors NAC išgelbėjo DC661 citotoksiškumą siNT ląstelėse, NAC gebėjimas išgelbėti DC661 citotoksiškumą buvo visiškai panaikintas siMSFD12 ląstelėse (6C pav.). Tai parodė, kad MFSD12 numušimas blokuoja citoprotekcinį NAC poveikį prieš DC661. NAC deacetilinamas citozolyje esančios acilazės (28). Norėdami nustatyti, ar gydymas NAC sukelia cisteino ar cistino kaupimąsi lizosomose, taikėme lizosomų imunoprecipitacijos (Lyso-IP) metodą (29), kad išvalytume lizosomas iš DMSO ir NAC apdorotų A375P ląstelių (6D paveikslas ir 9 priedas). tikslinė metabolomika, siekiant kiekybiškai įvertinti NAC ir susijusius metabolitus. Kaip ir tikėtasi, NAC buvo aptiktas NAC apdorotame visų ląstelių lizate ir susijusiose nesurištose frakcijose. L-cisteino lygis NAC apdorotose lizosomose žymiai padidėjo. L-cistinas buvo aptinkamas tik NAC apdorotose lizosomose. Stebėtina, kad NAC gydytose grupėse reikšmingo glutationo padidėjimo (sumažinto) neradome (6E pav.); tai nustebino, nes paprastai manoma, kad gydymas NAC padidina glutationo gamybą, koreguodamas redokso balansą. Šie rezultatai rodo, kad cisteinas, importuotas į lizosomas per MFSD12 importuotoją, yra labai svarbus siekiant išgelbėti LLP, LMP ir lizosomų ląstelių mirtį. LLP yra imunogeninis. Kai kurios reguliuojamos ląstelių mirties formos, kurias sukelia DC661 (piroptozė, nekroptozė, ferroptozė), buvo nustatytos kaip imunogeninės. Anksčiau imunogeninė ląstelių mirtis buvo aprašyta chemoterapiniams vaistams, remiantis būdingomis savybėmis, įskaitant su pažeidimu susijusių molekulinių modelių rodymą, įskaitant CALR ekspresiją ląstelės paviršiuje ir HMGB1 baltymo bei adenozino trifosfato (ATP) išsiskyrimą (30). CALR veikia kaip „suvalgyk mane“ signalas, kai ląstelės streso metu veikiamas ląstelių paviršius. Ekstraląstelinis HMGB1 ir ATP išsiskyrimas veikia kaip „rasti mane“ signalas, kurį atpažįsta fagocitinės ląstelės. Palyginome du modelius: B16F10 ląsteles, kuriose singeniniuose navikų modeliuose beveik visiškai nėra naviką infiltruojančių limfocitų, ir MC38 ląsteles, kuriose singeniniuose navikų modeliuose yra naviko infiltruojančių limfocitų. Pirma, mes parodėme, kad gydymas DC661 arba siPpt1 reikšmingai sukelia paviršiaus CALR ekspresiją, kurią galima visiškai panaikinti naudojant NAC MC38 ląstelėse (7, A ir B paveikslai). Panašūs radiniai buvo pastebėti B16F10 ląstelėse (7C pav.). Pagrindinių ląstelių mirties būdų (apoptozės, nekroptozės, ferroptozės ir piroptozės) inhibitoriai nesugebėjo užkirsti kelio CALR paviršiaus ekspresijai (7D pav.). Norint nustatyti, ar DC661 sukelta imunogeninė ląstelių mirtis atsirado dėl I klasės MHC padidėjimo, B16F10 ir MC38 ląstelės buvo apdorotos DC661 (3 μM) arba DMSO 24 valandas. Mes nustatėme, kad gydymas DC661 nepadidino MHC I klasės ekspresijos ir imunoproteasomų padidėjimo (7E paveikslas ir papildomas 9 paveikslas, B ir C).

4 pav. Katepsino slopinimas arba kalcio chelatacija neapsaugo nuo DC661-sukeltos ląstelių mirties. (A)

Norėdami suprasti autofagijos slopinimo poveikį T ląstelių pradėjimui, atlikome in vitro pradmenų ir kokultūros eksperimentą, naudodami C57BL6 / J splenocitus, kaip aprašyta anksčiau (31). Norėdami pradėti, splenocitus paveikėme DC661- arba DMSO apdorotomis B16F10 arba MC38 ląstelėmis. Tada šie gruntuoti splenocitai buvo kultivuojami su gyvomis B16F10 arba MC38 ląstelėmis ir buvo išmatuotas citotoksiškumas (8A pav.). Splenocitai, užpildyti DC661-apdorotomis B16F10 ląstelėmis, žymiai padidino IFN, palyginti su splenocitais, paveiktais DMSO apdorotomis B16F10 ląstelėmis. Pradedant T ląsteles tarpininkaujamas proliferuojančių B16F10 ląstelių žudymas buvo žymiai padidintas DC661-parengtuose splenocituose, palyginti su DMSO paruoštais splenocitais (8 pav., B ir C). MC38 ląstelės, apdorotos DC661, sukėlė dar didesnį IFN ir T ląstelių citotoksiškumą, palyginti su B16F10 ląstelėmis (8 pav., D ir E). Bendras NAC gydymas su DC661 galėjo visiškai panaikinti IFN išsiskyrimą iš splenocitų ir neryškų T ląstelių citotoksiškumą (8 pav., F ir G). Kalretikulino sunaikinimas siCalr MC38 ląstelėse (papildomas 9D paveikslas) panaikino gydymo DC661 pradinį efektyvumą ir žymiai sumažino pradinį T ląstelių citotoksiškumą (8 pav., H ir I). Kartu šie duomenys patvirtina mechaninį su LLP susijusio CALR reguliavimo vaidmenį skatinant priešnavikinių ląstelių T ląstelių imunitetą. Tada mes išplėtėme šiuos in vitro atradimus į in vivo priešnavikinės vakcinacijos tyrimą su imunokompetentingų ir imunodeficitų pelių modeliais. Šiam tyrimui in vitro užšaldytos ir atšildytos arba DC{40}}apdorotos B16F10 arba MC38 ląstelės buvo švirkščiamos į kairįjį šoną, siekiant apsaugoti imunokompetentingas C57BL/6 arba NOD/SCID peles nuo pakartotinio sušvirkštimo su tos pačios rūšies gyvomis naviko ląstelėmis. Po 7 dienų į dešinįjį šoną (9A pav.). DC661-gydytos B16F10 ląstelės nesugebėjo užkirsti kelio naviko atmetimui, nepaisant in vitro tyrimų, o tai rodo, kad DC661 sukėlė imunogeninę ląstelių mirtį (9B pav. ir 9E papildomas paveikslas). Priešingai, vieno šono inokuliacija DC661-apdorotomis MC38 ląstelėmis paskatino visišką gyvų MC38 ląstelių, implantuotų priešingame šone, atmetimą (9C pav. ir 9F papildomas paveikslas). Norėdami nustatyti, ar adaptyvus imunitetas buvo labai svarbus vakcinos poveikiui, kurį DC661 turėjo su MC38 navikais, pakartojome eksperimentą su NOD / SCID pelėmis. Stebėtina tai, kad DC661-gydytos MC38 ląstelės nesukėlė imunodeficito NOD/SCID pelių navikų atmetimo (9D pav. ir 9G papildomas paveikslas), o tai rodo, kad stebimam vakcinos poveikiui reikalingas adaptyvus imunitetas. Norėdami patikrinti šios išvados patikimumą, pasirinkome kitą gerai žinomą imunogeninę pelių vėžio ląstelių liniją CT26 ir atlikome vakcinacijos eksperimentą, kaip nurodyta aukščiau. Kaip ir tikėtasi, DC661-apdorotų CT26 ląstelių implantavimas viename pelės šone sukėlė į vakciną panašų poveikį ir neleido išaugti gyvoms CT26 ląstelėms, implantuotoms kitame šone (9E pav. ir 9H papildomas paveikslas). Mūsų išvados rodo, kad DC661-sukeltas LLP yra labai svarbus LMP sukeltai imunogeninei ląstelių žūčiai, kurią pakeičia cisteino importas į lizosomą lizosominiu transporteriu MFSD12 (9F pav.).

Diskusija

Atrodo, kad ikiklinikinių tyrimų metu lizosomų slopinimas yra daug žadantis terapinis metodas, o HCQ klinikiniai tyrimai davė vilčių teikiančių, bet nevienodų rezultatų (1, 32). PPT1 yra molekulinis HCQ taikinys, o stipresni PPT1 inhibitoriai, tokie kaip DC661 (2) ir GNS561 (3), in vitro sukelia LMP sukeltą ląstelių mirtį. Tikslus lizosominių ląstelių mirties mechanizmas ir jo vaidmuo naviko imunogeniškumui nebuvo iki galo išaiškintas. Priešnavikinis imunitetas sustiprėja, kai autofagijos slopinimas derinamas su imunoterapija (9, 10, 31). Siūlomi ląstelėms būdingo imunogeniškumo mechanizmai po autofagijos slopinimo apima I klasės MHC ir imunoproteasomų reguliavimą, kurie abu palaiko geresnį antigeno apdorojimą ir pateikimą. Be to, autofagijos baltymų praradimas arba autofagijos slopinimas chlorokvinu padidino CD8+ T ląstelių atsaką, nes dendritinėse ląstelėse padidėjo I klasės MHC kiekis (33). Anksčiau parodėme, kad sisteminis PPT1 slopinimas gali repoliarizuoti makrofagus nuo M2 iki M1 fenotipo. PPT1 inhibitoriai gali padidinti STING lygį, todėl melanomos modeliuose išsiskiria IFN ir padidėja T ląstelių žudymas (31). Čia parodėme, kad LLP pati sukuria naviko ląstelėms būdingą imunogeninę ląstelių mirties formą. Mes nustatėme, kad lizosomų slopinimas sukėlė labai nedaug baltymų pokyčių vėžio ląstelėse, o labiausiai padidėję baltymai buvo autofagijos krovinių receptoriai ir apoptozės reguliatoriai. Mūsų požiūris, nukreiptas į kai kuriuos iš šių genų įvairiose funkcijose, parodė, kad vaistų sukelti baltymai greičiausiai nebuvo pagrindiniai ląstelių mirties reguliatoriai. Genetinis ULK1 arba ATG7 slopinimas taip pat neišgelbėjo DC661 citotoksiškumo. Mes parodėme, kad lizosomų slopinimas suaktyvina daugybę užprogramuotų ląstelių mirties formų, įskaitant apoptozę, nekroptozę, ferroptozę ir piroptozę, tačiau kiekvienas iš jų buvo nereikalingas dėl vaistų sukelto citotoksiškumo. Pažymėtina, kad užprogramuoti ląstelių mirties mechanizmai gali sutapti, o kelių ląstelių mirties mechanizmų taikymas gali suteikti citoapsaugą nuo ląstelių mirties po lizosomų membranos pralaidumo. Mūsų darbas atmetė nuo katepsino ir kalcio priklausomus lizosomų ląstelių mirties mechanizmus ir pabrėžė LLP, kaip svarbiausio ląstelių mirties veiksnio, svarbą. Mes radome MLP įrodymų, kurie buvo grįžtami antioksidantu, kuris buvo perneštas į lizosomą, NAC ir buvo labai svarbus lizosomų membranos pralaidumui ir citotoksiškumui. NAC buvo vienintelis agentas, galintis sušvelninti arba pakeisti DC{27}}sukeliamą ląstelių mirtį, ir šis pajėgumas priklausė nuo lizosominio cisteino transporterio MFSD12 buvimo. Tikėtina, kad dėl lizosomų prasiskverbimo trūkumo kiti numanomi lipidų peroksidacijos inhibitoriai, Trolox ir vitaminas C, negalėjo užkirsti kelio DC661 citotoksiškumui. NAC paverčiamas cisteinu, kuris importuojamas į lizosomas ir oksiduojasi į savo disulfidinę formą – cistiną. Cistiną į citozolį eksportuoja kitas lizosomų pernešėjas, cistinozė, kur jis redukuojamas iki cisteino, kuris remobilizuoja vidinius maistinių medžiagų šaltinius, suaktyvina rapamicino komplekso 1 tikslą ir skatina autofagiją (34). Šis cisteino oksidacijos-redukcijos ciklas į cistiną (lizosomas) ir atgal į cistiną (citozolį) gali būti galimas NAC gelbėjimo mechanizmas nuo DC661 citotoksiškumo arba bendresnio lizosomų pažeidimo kitose ligose, kuriose NAC pasirodė esantis naudingas terapiškai (35). . NAC ne tik apvertė DC{35}}sukeltas LLP ir LMP, bet ir imunogeninio ląstelių mirties žymens kalretikulino paviršiaus ekspresiją. CALR baltymo ekspresija ląstelės paviršiuje buvo reikalinga, kad padidėtų T ląstelių sukeltas citotoksiškumas, kurį sukelia DC661-priimti splenocitai, ir tai rodo, kad lizosomų slopinimas sukuria specifinę ląstelėms būdingo imunogeniškumo formą.

Nors ankstesni tyrimai parodė, kad lizosomų slopinimas gali sustiprinti imuninės sistemos kontrolinio taško slopinimo priešnavikinį aktyvumą esant nustatytiems šoniniams navikams (9, 31), mūsų tyrimas yra pirmasis mūsų žiniomis, įrodantis į vakciną panašų poveikį MC38 navikams, bet ne B16 navikams. naviko ląstelės, prieš implantaciją apdorotos DC661. Tai rodo, kad lizosomų ląstelių mirtis gali sukelti ląstelėms būdingą imunogeniškumą, tačiau šie pokyčiai nėra pakankamai tikėtina, kad „imuninio šalto“ naviko mikroaplinka pakeistų „imuninio karšto“ naviko mikroaplinką. Ankstesni „imuninio šalto“ naviko mikroaplinkos modelių B16 ir BRafCA PtenloxP Tyr tyrimai: CreERT2 genetiškai modifikuoti pelių modeliai (31) parodė, kad sisteminis lizosomų slopinimas padarė poveikį su naviku susijusiems makrofagams ir mieloidinių ląstelių kilmės slopinančioms ląstelėms, kurių pakako sustiprinti. imunoterapijos veiksmingumas. Gali būti, kad ląstelėms būdingas imunogeniškumas taip pat turi įtakos šiems imuniniams peršalimo navikams, kurie po lizosomų slopinimo labiau reaguoja į ICD. Į vakciną panašus lizosomų slopinimo poveikis, pastebėtas kontroliuojamoje laboratorinėje aplinkoje, gali pasireikšti klinikoje arba ne, tačiau jis gali paaiškinti, kodėl kai kuriems pacientams, gydytiems dabrafenibu, trametinibu ir HCQ, anksčiau gydyta BRAF mutantine melanoma, buvo tokia gili ir patvari. reaguoti į šį režimą (32). Norint suprasti, kaip PPT1 slopinimas sukelia lizosomų ROS ir lipidų peroksidaciją, reikia atlikti tolesnį tyrimą. PPT1-priklausomas V-ATPazės ir lizosomų rūgštėjimo reguliavimas nėra pakankamas paaiškinimas, nes bafilomicinas slopina lizosomų rūgštėjimą, bet negamina LMP (duomenys nerodomi). Šių išvadų pasekmės rodo, kad lizosomų inhibitoriai, didinantys naviko ląstelių vidinį imunogeniškumą, gali būti racionaliai derinami su terapija, kuri sustiprina T ląstelių aktyvaciją arba infiltraciją į naviko mikroaplinką, o tai gali sukelti sinergetinį poveikį.

5 pav. N-acetilcisteinas apsaugo nuo DC661-sukeltos ląstelių mirties. (A)

Metodai

Ląstelių kultūros. Žmogaus A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420) ), A549 (CRM-CCL-185) ir pelės B16F10 (CRL-6475) ląstelių linijos buvo įsigytos iš ATCC. Žmogaus A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 ir pelės YUMM1.7 (WT, Gsdme EV ir Gsdme KO1 ir KO2) linijos buvo gautos įmonės viduje. Pelės MC38 ir CT26 ląsteles pateikė Andy Minn iš Pensilvanijos universiteto. FL5.12 ir nuo IL-3 priklausomos Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) pirminės kaulų čiulpų ląstelės buvo gautos iš Kathryn E. Wellen, Pensilvanijos universiteto. Žmogaus Panc-1 (CRL-1469, ATCC) ląstelių liniją pateikė Benas Z. Stangeris iš Pensilvanijos universiteto. Pelės YUMMER 1.7 ląstelių linija buvo gauta iš Xiaowei (George) Xu, Pensilvanijos universiteto. Visos ląstelių linijos buvo tiriamos dėl mikoplazmos kas du kartus per metus Pensilvanijos universiteto pagrindinių įrenginių ir patvirtintos naudojant trumpą tandeminį pakartotinį pirštų atspaudų atspaudą Wistar Institute Genomics branduolyje. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 ir Bax/ Bak DKO ląstelių linijos buvo auginamos RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 ir MC38 ląstelių linijos buvo kultivuojamos DMEM (Invitrogen, 11995); ir YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV ir Gsdme KO1 ir KO2) ląstelės (15) buvo auginamos DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Kultūrinės terpės buvo papildytos 10% vaisiaus galvijų serumu (12306C, MilliporeSigma) ir 1 × antibiotikų antimikotiniu tirpalu (Gibco, 15140-122). FL5.12 ir Bax/Bak DKO ląstelių linijos buvo palaikomos pilnoje RPMI terpėje, papildytoje 50 μM merkaptoetanoliu (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) ir 0,35 ng/mL ir 3. /mL IL-3, atitinkamai. YUMMER1.7 ir YUMM1.7 (WT, Gsdme EV ir Gsdme KO) ląstelių linijos buvo palaikomos pilnoje terpėje, papildytoje 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). WM35 ir WM793 ląstelės buvo kultivuojamos MCDB terpėje 153 (MilliporeSigma, M7403), turinčioje 10 % FBS 1 × Leibovitz L-15 terpėje (Corning, 10-045-CV), 7,5 % m/v natrio bikarbonato ( Corning, 25-035-CI), 1 × antibiotikų priešgrybelinis tirpalas (Gibco, 15140-122) ir 5 ug/ml insulino (MilliporeSigma, I0516). Ląstelės buvo auginamos 37 laipsnių temperatūroje, esant 5% CO2. Cheminės medžiagos ir reagentai. Įsigytos cheminės medžiagos buvo HCQ sulfatas (Spectrum Chemicals, 747-36-4) ir DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) buvo naudojamas ląstelėms nudažyti kalciu pagal gamintojo instrukcijas. Antikūnų ir inhibitorių sąrašas pateiktas 1 papildomoje lentelėje ir 2 papildomoje lentelėje.

6 pav. NAC apverčia LLP priklausomai nuo MFSD{1}}. (A–C)

Baltymų ekstrahavimas ir skaidymas skysčių chromatografijai – tandeminė masės spektrometrinė analizė proteomikai. {{0}},7 × 106 A375P melanomos ląstelės buvo kultivuojamos 60 mm auginimo lėkštelėse. Ląstelės buvo apdorojamos DMSO (kontrolė), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) arba HCQ (3{{70}} μM) 24 valandas maždaug 5{{ 112}} % santaka. Sušaldytos ląstelių granulės buvo lizuojamos naudojant 50 mM Tris pH 7,4, 1 % SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatino, ir 1 ug/ml leupeptino. Išvalyti lizatai (kiekvienas 10 ug) buvo elektroforezuojami 0,5 cm į bis-tris gelį, po to fiksuojami ir dažomi koloidiniu Coomassie. Kiekviena 0,5 cm gelio juosta buvo iškirpta, pašalinta, redukuota tris (2- karboksietil) fosfinu, alkilinta jodacetamidu ir virškinama tripsinu, kaip aprašyta anksčiau (36). Virškinimai (1 ug) buvo analizuojami naudojant skysčių chromatografiją – tandeminę masės spektrometriją (LC-MS/MS) naudojant Q-Exactive Plus masės spektrometrą (Thermo Fisher Scientific) pagal nanoAQUITY UPLC (Waters). Analitinis atskyrimas buvo atliktas 1,7 μm × 250 mm peptido BEH C18 kolonėlėje (Waters, 186003546), naudojant 245-minutės gradientą su 0,1 % skruzdžių rūgšties vandenyje (judrioji fazė A) ir acetonitrilu (judrioji fazė B), kaip nurodyta toliau. : 5–30 % B per 225 minutes, 30–80 % B per 5 minutes, 15-min. palaikykite ties 80 % B ir grįžkite į pradines sąlygas. Visi MS spektrai buvo gauti esant 70,000 skyrai, nuskaitymo diapazonas 400–2,000 m/z, automatinis stiprinimo kontrolės tikslas – 3 × 106 jonai ir didžiausia įpurškimo trukmė 50 milisekundžių. Nuo duomenų priklausomi MS2 spektrai buvo gauti 20 labiausiai paplitusių jonų esant 17 500 skiriamajai gebai, kurių izoliacijos plotis yra 1, 5 m / z, automatinis stiprinimo kontrolės tikslas - 5 × 104 jonai ir didžiausias įpurškimo laikas - 50 milisekundžių. Pirmenybė buvo nustatyta peptidų atitikčiai, o nepriskirti ir vieną krūvį turintys jonai buvo atmesti (37). Neapdoroti MS duomenys buvo analizuojami naudojant MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) su Uniprot žmogaus sekų duomenų baze (prieiga 2019 m. spalio 10 d.) ir įprastų teršalų duomenų baze, įskaitant tripsiną, keratinus, galvijų baltymus, ir mikoplazmos (38). Paieškoje buvo naudojamas triptinio peptido specifiškumas su ne daugiau kaip 2 praleistais skilimais, fiksuota cisteino modifikacija (karbamidometilinimas) ir kintama metionino oksidacija arba N-galo acetilinimas (39). Peptidams ir baltymams buvo naudojamas 1% FDR riba. Rungtynės tarp važiavimų buvo įjungtos; baltymai buvo kiekybiškai įvertinti, naudojant kiekybinį nustatymą be etiketės (40). Statistinė analizė atlikta naudojant Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Baltymai turėjo būti identifikuoti pagal bent 3 unikalius peptidus ir turėti 3 galiojančias vertes (ne nulinį kiekybinį nustatymą) mėginių grupėje, o teršalai ir atvirkštiniai baltymai buvo išfiltruoti iš duomenų rinkinio. Trūkstamos reikšmės buvo priskirtos normaliam pasiskirstymui. Porinis sąlygų palyginimas buvo atliktas baltymų lygmeniu, naudojant 2-uodeginį Stjudento t-testą su permutacija pagrįstu FDR su s0=0.1 ir 250 atsitiktinių imčių. Reikšmingi pokyčiai buvo apibrėžti kaip FDR mažesnis nei 5%, o absoliutus kartos pokytis didesnis nei 1,5 arba 2,0, kaip nurodyta. Lyso-IP. A375P ląstelės buvo užkrėstos pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirusu ir atrinktos naudojant 1 mg/ml puromicino (MilliporeSigma, P4512). Maždaug 3 × 106 HA pažymėtos A375P ląstelės buvo apdorotos 10 mM NAC arba vandens nešiklio kontrole 24 valandas anksčiau aprašytomis auginimo sąlygomis. Po apdorojimo ląstelės buvo plaunamos PBS, surenkamos 0, 5 ml šalto KPBS ir švelniai homogenizuotos naudojant 20 smūgių 2 ml Dounce homogenizatoriuje. Maždaug 2,5 % homogenato buvo skirta visos ląstelės lizato analizei, o likusi dalis buvo centrifuguojama 3,{120}}g 2 minutes 4 laipsnių kampu, kad būtų pašalintos ląstelės membranos nuolaužos. Po to homogenatas supernatantas buvo perkeltas į švarų 1, 5 ml mėgintuvėlį ir 15 minučių 4 laipsnių temperatūroje inkubuojamas su 50 μL anti-HA granulėmis (Pierce, 88836) arba anti-DDK/Flag granulėmis (OriGene, TA150042). Tada mėginiai buvo nusodinti uždedant mėgintuvėlius ant DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) ir 2 minutes švelniai kratomi kambario temperatūroje. Supernatantas buvo skirtas nesurištų frakcijų analizei. IP buvo plaunamas 3 kartus KPBS, turinčiu 8 mM CaCl2. Lyso-IP buvo ekstrahuotas 80% MeOH metabolomikos analizei. Lipidų ekstrahavimas ir analizė naudojant LC-MS/MS pasauliniam lipidomui. Melanomos A375P ląstelės buvo pasėtos į 60 mm lėkštes po 0, 7 × 106 ląstelių viename inde. Kai ląstelės buvo maždaug 50% susiliejimo, jos buvo apdorotos DMSO (kontrolė), DC661 (3 μM) arba HCQ (30 μM) 24 valandas. Ląstelės buvo 2 kartus plaunamos HBSS, nugramdomos į ledo šaltą metanolį ir perkeltos į stiklinius mėgintuvėlius lipidų ekstrahavimui chloroformu/metanoliu/0,88% NaCl (2:1:1), turinčiu EquiSPLASH vidinį lipidų etaloną (Avanti Polar Lipids). Mėginiai buvo maišomi sūkuryje, o po to 5 minutes kaitinami vandens vonioje ant ledo. Po centrifugavimo 500 g 15 minučių 40 laipsnių temperatūroje, apatinė fazė buvo perkelta į kitą stiklinį mėgintuvėlį. Viršutinė fazė buvo iš naujo ekstrahuota naudojant sintetinę apatinę fazę. Po apdorojimo ultragarsu ir centrifugavimo apatinė fazė buvo sujungta su pirmuoju apatinės fazės rinkiniu. Mėginiai buvo išdžiovinti azotu, resuspenduojami 10% chloroforme/90% metanolyje ir perkeliami į stiklinius LTQ buteliukus. Lipidų mėginiai buvo analizuojami naudojant Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X masės spektrometrą ir Vanquish Horizon UHPLC sistemą. Analitiniam atskyrimui naudota Accucore C30 kolonėlė (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) su 50:50 acetonitrilo/vandens ir 88:10:2 izopropanolio/acetonitrilo/vandens santykiu, kurių kiekvienoje yra 5 mM amonio formiato ir 0,1 % skruzdžių rūgšties. LC-MS/MS duomenys buvo gauti atskirai teigiamu ir neigiamu poliškumu, naudojant šiuos prietaiso parametrus: MS1 skenavimas 120, 000 skiriamoji geba; nuo duomenų priklausomas MS2 20 labiausiai paplitusių jonų esant 15,000 skyrai; 0,4 m/z izoliacijos plotis; ir pakopinė normalizuota susidūrimo energija 20:30:40 (43).

7 pav. N-acetilcisteinas neleidžia DC661-sukeltai kalretikulino paviršiaus ekspresijai. (REKLAMA)

Lipidai buvo nustatyti ir kiekybiškai įvertinti naudojant LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Nustatytos lipidų rūšys buvo filtruojamos pagal numatomus aduktus ir identifikavimo laipsnį pagal klasę. Smailių sritys buvo normalizuotos pagal palaikomų klasių EquiSPLASH standartus ir toliau normalizuotos pagal bendrą kiekvieno mėginio plotą, kad būtų ištaisytas ląstelių skaičiaus kitimas. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant log-transformuotus duomenis naudojant Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Metabolitų ekstrahavimas ir analizė naudojant LC-MS/MS metabalonui. Poliniai metabolitai buvo ekstrahuoti iš sveikų ląstelių, nesurištų lizo-IP frakcijų ir su Lyso-IP surištų mėginių naudojant 80% metanolį ir prieš skysčių chromatografiją buvo laikomi –8{{30}} laipsnių temperatūroje. – masių spektrometrijos (LC-MS) analizė. Ekstraktai buvo analizuojami LC-MS naudojant Thermo Scientific Q-Exactive HF-X masės spektrometrą su HESI II zondu, suderintu su Thermo Vanquish Horizon UHPLC sistema. LC atskyrimas buvo atliktas naudojant ZIC-HILIC kolonėlę (2,1 mm × 150 mm, 5 μm dalelių dydis, EMD Millipore) su ZIC-HILIC apsaugine kolonėle (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore), laikytą 45 laipsnių kampu su srauto greičiu 0,2 ml/min. Chromatografija buvo atlikta rūgštinėmis sąlygomis, siekiant sumažinti tiolio grupių reaktyvumą. Judanti fazė A buvo vanduo, o B – acetonitrilas, abiejuose yra 0,1 % skruzdžių rūgšties. LC gradientas buvo 85 % B 2 minutes, 85 % B iki 20 % B per 15 minučių, 20 % B iki 85 % B per 0,1 minutės ir 85 % B 8,9 minutės. Automatinis mėginių ėmiklis buvo laikomas 4 laipsnių kampu, o vienai analizei buvo įšvirkščiama 4 μL kiekvieno mėginio. Buvo naudojami šie MS parametrai: apvalkalo dujų srautas, 40 AV; pagalbinių dujų srautas, 10 AV; valymo dujų srautas, 2 AV; pagalbinio dujinio šildytuvo temperatūra, 350 laipsnių; purškimo įtampa, 3,75 kV teigiamam režimui ir 3,5 kV neigiamam režimui; kapiliarinė temperatūra, 375 laipsniai; ir piltuvo RF lygis, 40 proc. Visi mėginiai buvo analizuojami visa MS su poliškumo perjungimu. Visiškas MS nuskaitymas buvo gautas nuo 65 iki 975 m/z esant 120, 000 skiriamajai gebai su automatiniu stiprinimo kontrolės tikslu 1 × 106 jonais ir maksimaliu 100 milisekundžių įpurškimo laiku. Neapdoroti duomenys buvo analizuojami naudojant TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Tiksliniai metabolitai buvo nustatyti pagal tikslią masę ir sulaikymo laiką pagal pageidaujamą poliškumą, remiantis analitiniais standartais. Smailių aptikimui buvo naudojamas ICIS algoritmas su išlyginimu 1. Santykinis kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant integruotą smailės plotą, ir šios vertės buvo pakoreguotos į bendrą mėginio kiekį (apibrėžtą kaip bendrą smailės plotą). PPT1-CRISPR/Cas9 redagavimas. A375P PPT1-netikslinės ir KO ląstelės buvo paruoštos, kaip aprašyta anksčiau (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) buvo Feng Zhang dovana (Addgene plazmidė, 48139). Vadovaujantis RNR oligos (IDT) buvo atkaitintos, fosforilintos, o po to surištos į BbsI suardytą ir defosforilintą pX459 plazmidę pagal Zhang laboratorijos protokolus, kuriuos galima įsigyti per Addgene. Liguotos plazmidės buvo transformuotos į Stbl3 ląsteles (Invitrogen). Plazmidės paruošimo sekų nustatymas patvirtino norimų vadovaujančių RNR sekų buvimą. A375P ląstelės buvo transfekuotos naudojant Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), po to buvo atlikta puromicino atranka. Tyrėjų tyrimai patvirtino PPT1 geno redagavimą naudojant CRISPR / Cas9, o PPT1 numušimas buvo patvirtintas Western blot būdu naudojant PPT1 antikūną (Origene). Vadovo RNR oligo sekos yra šios: nukreipimo į RNR netikslinė (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), netaikinio nukreipiančioji RNR atvirkštinė (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), žmogaus PPT1 vadovo RNR 1 pirmyn (CACCGTTTGGACTCCTCTCGATGCCC), žmogaus PPT1 nukreipiančioji RNR į priekį (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), žmogaus PPT1 nukreipianti RNAGAACGATCCAG1 (AAGAACGATCCAG1). 3 pirmyn (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), o žmogaus PPT1 vadovo RNR 3 atvirkščiai (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Šiame darbe naudojami klonai, išauginti iš pavienių ląstelių, yra šie: klonas C8 yra žmogaus vadovas 1, o klonas B5 yra žmogaus vadovas 3. Imunoblotavimas. Vienas milijonas ląstelių buvo pasodintos į 10 cm lėkštelę, o gydymas buvo atliktas kitą dieną; ląstelės buvo surinktos grandant. Visų ląstelių lizatai buvo paruošti naudojant SDS lizės buferį. Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30–50 ug baltymo buvo naudojamas SDS-PAGE ir buvo perkeltas ant PVDF membranos (Bio-Rad, 1620177). Membrana buvo užblokuota naudojant 5% BSA arba 5% nugriebto pieno, atsižvelgiant į optimizuotas sąlygas, ir inkubuojama su pirminiu antikūnu per naktį 4 laipsnių temperatūroje. PVDF membranos buvo plaunamos 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) ir 1 valandą inkubuojamos kambario temperatūroje su rūšiai specifiniu HRP konjuguotu antriniu antikūnu. Vėliau membranos buvo plaunamos ir išryškinamos naudojant Pierce ECL Western Blotting substratą (Thermo Fisher Scientific, 32106) ir autoradiografines plėveles (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Piroptozės tyrimams baltymų lizatai buvo atskirti SDS-PAGE ir perkelti į PVDF membranas. Po blokavimo 5% BSA, PVDF membranos buvo inkubuojamos su nurodytais pirminiais antikūnais per naktį 4 laipsnių temperatūroje, plaunamos PBS / Tween ir inkubuojamos su peroksidaze sujungtais antriniais antikūnais. Imunoreaktyvumas buvo nustatytas naudojant HRP konjuguotus antrinius antikūnus (CalBioTech), chemiliuminescencinį substratą (Thermo Fisher Scientific) ir ChemicDoc MP vaizdo gavimo sistemą (Bio-Rad). Eksperimentams, kuriuose dalyvavo supernatantas, ląstelės buvo kultivuojamos terpėje be FBS, kad būtų išvengta SDS-PAGE iškraipymo. Ląstelių supernatantai buvo surinkti ir centrifuguojami 10 minučių 500 g 4 laipsnių kampu, kad būtų pašalintos ląstelių liekanos. Gauti supernatantai buvo koncentruoti 10 kartų, naudojant Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma), centrifuguojant 30 minučių 4500 g 4 laipsnių kampu. Koncentratai buvo sumaišyti su mėginio buferiu ir analizuojami Western blot metodu, kaip aprašyta aukščiau. Baltymų gelio dažymas buvo atliktas naudojant Ponceau raudoną dažymą. LMP ir katepsino L aktyvumo tyrimas. Žmogaus pEGFP-hGal3 plazmidė buvo Tamotsu Yoshimori dovana (Addgene plazmidė, 73080) ir buvo naudojama A375P-Galectin{139}} linijai sukurti. Buvo nupirktas pEGFP-C1 kontrolinis plazmidės vektoriaus pagrindas (novo prolabs, V012024). Plazmidės buvo transfekuotos (1 ug/ml) į A375P ląsteles naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) pagal gamintojo protokolą; transfekuotos ląstelės buvo stabiliai atrinktos naudojant G418 (Gibco, 10131035). LMP atveju iš viso buvo suskaičiuotos 25 A375P-galektino{152}} taškinės teigiamos ląstelės keliuose vaizdo laukuose. Punktateigiamų ląstelių procentas buvo skaičiuojamas kiekviename lauke atskirai, o vidutinis procentas buvo apskaičiuotas kiekvienai grupei. Magic Red Cathepsin L tyrimo rinkinys (Abcam, ab270774) buvo naudojamas pagal gamintojo protokolą. Ląstelės buvo vaizduojamos apverstu Zeiss Axio Observer 7 mikroskopu. Magic Red neapdorotas integruotas intensyvumas buvo apskaičiuotas naudojant Fiji - ImageJ programinę įrangą (NIH). MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5 difeniltetrazolio bromidas) ląstelių gyvybingumo tyrimas. 2 000 ląstelių buvo pasodinta trimis egzemplioriais į kiekvieną 96-šulinėlio plokštelės šulinį, o 3-dienos MTT tyrimai buvo atlikti naudojant ląstelių gyvybingumo rinkinį (Roche, 11465007001) pagal gamintojo protokolą. Išankstinis inhibitorių apdorojimas buvo atliktas 1 valandą, po to ląstelės buvo apdorojamos inhibitoriais su DC661 arba be jo. IC50 apskaičiuoti buvo naudojamas netiesinės regresijos (kreivės pritaikymo) metodas.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kolonijų susidarymo tyrimas. 2,000 ląstelės vienoje duobutėje buvo pasėtos į 6-šulinėlių plokštelę ir apdorotos kitą dieną; ląstelės buvo gydomos iš viso 8 dienas. Kiekviename šulinyje susidariusios kolonijos buvo plaunamos PBS, fiksuojamos šaltu metanoliu –20 laipsnių temperatūroje 20 minučių ir nudažomos kristaliniu violetiniu 0,5 % vandeniniu tirpalu (V5265; MilliporeSigma).

Trypano mėlynojo dažų pašalinimo tyrimas. Tripano mėlynojo tyrimo reakcijos mišinys buvo paruoštas sumaišant 1 dalį 0,4% tripano mėlynojo (25- 900-CI, Corning) ir 1 dalį praskiestų ląstelių mėginių. Mišinys buvo inkubuojamas 1 minutę, o ląstelės buvo suskaičiuotos naudojant Cellometer Vision (Nexcelom, Vision{6}}).

8 pav. DC661-sukelta kalretikulino paviršiaus ekspresija suaktyvina T ląsteles prieš naviko ląsteles. (A)

9 pav. DC661-apdorotų ląstelių inokuliacija sukelia naviko atmetimą tam tikrose situacijose. (A)

PUTOS-LPO. LLP buvo tiriamas naudojant fluorescencinį zondą FOAMLPO. FOAM-LPO buvo susintetintas, kaip aprašyta anksčiau (26). Ląstelės buvo kultivuojamos ant 8 šulinėlių μSlide (ten pat, 80807) ir apdorotos inhibitoriais ir su DC661 arba be jo. Ląstelės buvo inkubuojamos terpėje, turinčioje FOAM-LPO (1 M), 5% CO2 ir 95% oro atmosferoje 5 minutes 37 laipsnių temperatūroje. Ląstelės buvo du kartus plaunamos terpe, o po to ląstelės buvo stebimos mikroskopu (Zeiss Axio Observer 7 apverstas mikroskopas), kad būtų galima nustatyti fluorescencijos poslinkį nuo 586 iki 512 nm, reaguojant į LLP. qRT-PGR ir pradmenys. A375P (3 × 105 ) ląstelės buvo kultivuojamos 60 mm induose ir 24 valandas buvo apdorotos DMSO arba DC661 (3 μM). Bendra RNR buvo išskirta naudojant RNR izoliavimo rinkinį (QIAGEN, 74134) pagal gamintojo protokolą. cDNR buvo susintetinta naudojant iScript atvirkštinės transkriptazės rinkinį su 500 ng išgrynintos RNR pagal gamintojo protokolą (Thermo Scientific, K1642). qPCR reakcija buvo nustatyta naudojant SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121), turintį 1 μL cDNR. Visi matavimai buvo atlikti trimis egzemplioriais, o BACTIN buvo naudojamas kaip vidinis standartas ΔCT skaičiavimams. Genų ekspresijos analizė buvo atlikta naudojant šiuos pradmenis: PTGS2/COX-2 pirmyn (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 atgal (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS pirmyn (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS į priekį (CHACAGTAGGATGTC). (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 atgal (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN pirmyn (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) ir BACTIN atgal (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

siRNR transfekcija. Žmogaus ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 ir MFSD12 genetiniai numušimo tyrimai buvo atlikti A375P ląstelių linijose. Pelės Ppt1 ir Calreticulin genetiniai slopinimo tyrimai buvo atlikti MC38 ląstelėse. Netikslinė siRNR (sc{{10}}), žmogaus ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), pelės Ppt1/Cln1 (sc-142398) ir kalretikulinas /Calregulin (sc-29895) siRNR buvo įsigytos iš Santa Cruz Biotechnology. Šios siRNR susideda iš 3–5 tikslinių siRNR telkinių. Srauto citometrija. Feroptozės indukcija buvo matuojama naudojant C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). A375P ląstelės buvo pasėtos į 6-šulinėlių plokštelę ir apdorotos DMSO, ferostatinu{{40}} (10 μM), lūpų roksstatinu-1 (2 μM), elastinu (5 μM). ), DC661 (3 μM) arba derinį 24 valandas. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant 300 g 5 minutes. Ląstelės buvo resuspenduotos 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV), turinčio 1 μM C11-BODIPY, ir inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje 15 minučių. Ląstelės buvo granuliuotos ir resuspenduotos 500 μL 1X HBSS, o fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas BD LSRII citometru, naudojant 530/30 Blue (Pensilvanijos universiteto Flow Core Facility). Kalretikulino ekspresijos ląstelių paviršiuje kiekybinis įvertinimas imunogeninei ląstelių mirčiai buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau (45), naudojant srauto citometriją. B16F10 arba MC38 ląstelės buvo kultivuojamos ir 24 valandas apdorotos NAC (10 mM) arba DC661 (3 μM). MC38 ląstelės buvo apdorotos siPpt1 arba siNT 48 valandas, esant arba nesant 10 mM NAC 24 valandas. Ląstelės buvo nudažytos CALR antikūnu (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 ožkos antruoju antikūnu prieš triušius (Invitrogen) ir propidžio jodidu (PI) (Biolegend, 421301). Dažyti mėginiai buvo paimti naudojant BD LSRII srauto citometrą, naudojant 710/50 mėlyną ir 670/30 raudoną, kad būtų užfiksuota atitinkamai PI ir CALR fluorescencija (Pensilvanijos universiteto „Flow Core“ įrenginys), o analizė buvo atlikta tik CALR teigiamoms ir PI neigiamoms ląstelėms. kad būtų išvengta klaidingai teigiamų įvykių. T ląstelių pirmavimas ir procentinis citotoksiškumas. B16 arba MC38 naviko ląstelės (5 × 104) buvo kultivuojamos ir apdorotos NAC (10 mM) arba DC661 (1 μM arba 3 μM) atitinkamai 24 valandas. Calr genetiniam slopinimui MC38 ląstelės buvo apdorotos Calr siRNR arba netiksline siRNR (siNT) 48 valandas, po to 24 valandas buvo apdorotos DMSO arba 3 μM DC661. Tada splenocitai buvo kultivuojami su DC661 su B16 arba MC38 ląstelėmis arba be jų, dalyvaujant IL-2 (5 TV/mL) ir kartu kultivuojami 72 valandas. Užpildymas buvo patvirtintas supernatanto IFN-ELISA (Biolegend, 430815). Tada gruntuoti splenocitai buvo kultivuojami su šviežiai kultivuotomis B16 arba MC38 ląstelėmis, kurių tikslinio ir efektoriaus (B16 arba MC38 ir splenocitų) santykis buvo atitinkamai 1:20 ir 1:50 B16 ir MC38 ląstelėms. Su B16 arba MC38 ląstelių mirtimi susijęs LDH išsiskyrimas ir procentinis citotoksiškumas buvo matuojamas pagal gamintojo protokolą (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Priešnavikinės vakcinacijos tyrimai ir chemoterapijos tyrimai su nustatytais vėžio modeliais. Šešių – aštuonių savaičių WT C57BL/6 pelių patelės, NOD/SCID ir BALB/c pelės buvo gautos iš The Jackson Laboratory. Priešnavikinės vakcinacijos eksperimentams WT B16F10, MC38 ir CT26 ląstelės buvo apdorotos DC661 (3 μM) 36 valandas 175 cm2 kolbose. Tada supernatantai ir atskirtos ląstelės buvo surinktos į 50 ml falcon mėgintuvėlį. Ląstelės buvo centrifuguojamos ir plaunamos lediniu PBS. Vakcinacijai 150 μL ląstelių suspensijos buvo švirkščiama į kairįjį imunokompetentingų C57BL/6 pelių, imunodeficito NOD/SCID pelių (1,8 × 104 B16F10 ląstelių, 1,5 × 106 MC38 ląstelių vienai pelei) arba syngene BALB0c. × 106 CT26 ląstelės vienai pelei). Užšaldytos ir atšildytos ląstelės, pakartotinai suspenduotos PBS, buvo švirkščiamos kaip neigiama kontrolė. Po savaitės į dešinįjį šoną buvo sušvirkštos to paties tipo gyvos vėžio ląstelės (3 × 104 B16F10 ląstelės, 2 × 105 MC38 ląstelės arba 5 × 105 CT26 ląstelės vienai pelei) su tokiu pat kiekiu Matrigel (Corning, 354248). vakcinuotų pelių. Navikai buvo matuojami naudojant elektroninius suportus, o tūris buvo apskaičiuotas kaip L × W2 × 0, 5. Kitomis dienomis auglio augimas buvo reguliariai stebimas, o navikų nebuvimas buvo laikomas veiksmingos priešnavikinės vakcinacijos požymiu. DC661-MC38 vakcinacijos tyrimai buvo pakartoti su NOD/SCID pelėmis. Statistika. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas naudojant Stjudento nesuporuotą, 2-tailed t-testą lyginant 2 grupes. Palyginus daugiau nei 2 grupes, buvo naudojamas 1-ANOVA testas. Nulinė hipotezė buvo reikšmingai atmesta, jei P vertė buvo mažesnė nei 0, 05. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SEM. Studijų patvirtinimas. Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti pagal Pensilvanijos universiteto Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto patvirtintus protokolus.

Kinijos žolė cistanche augalas-Antitumor

Nuorodos

1. Zeh HJ ir kt. Randomizuotas II fazės priešoperacinis autofagijos slopinimo tyrimas su didelėmis hidroksichlorokvino ir gemcitabino / Nab-paklitakselio dozėmis kasos vėžiu sergantiems pacientams. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW ir kt. PPT1 skatina naviko augimą ir yra chlorokvino darinių molekulinis taikinys sergant vėžiu. Vėžio atradimas. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S ir kt. GNS561, naujas autofagijos inhibitorius, veikiantis prieš vėžio kamienines ląsteles sergant kepenų ląstelių karcinoma ir kepenų metastazėmis nuo gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio. J Vėžys. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S ir kt. GNS561, klinikinės stadijos PPT1 inhibitorius, yra veiksmingas prieš kepenų ląstelių karcinomą, moduliuodamas lizosomų funkcijas. Autofagija. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C ir kt. Lizosomų membranos pralaidumas ir katepsino išsiskyrimas yra nuo Bax / Bak priklausomas, sustiprinantis apoptozę fibroblastuose ir monocituose. Ląstelių mirties skirtumas. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Lizosomų membranos pralaidumas ląstelių mirties atveju. Onkogenas. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW ir kt. Vieningas požiūris į lizosomų degradavimo ir augimo signalizacijos vaidmenis. Vėžio atradimas. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R ir kt. Feroptozė, nekroptozė ir piroptozė priešvėžiniame imunitete. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K ir kt. Autofagija skatina imuninį vengimą nuo kasos vėžio, mažindama MHCI. Gamta. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J ir kt. ULK1 slopinimas įveikia pažeistą antigeno pateikimą ir atkuria priešnavikinį imunitetą LKB1 mutantinio plaučių vėžio atveju. Natas Vėžys. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M ir kt. Ubikvitino kinazė PINK1 įdarbina autofagijos receptorius, kad sukeltų mitofagiją. Gamta. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB ir kt. TAX1BP1 sulaiko viruso sukeltą apoptozę, palengvindamas niežulio sukeltą mitochondrijų adapterio MAVS degradaciją. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S ir kt. Bnip3 pažeidžia mitochondrijų bioenergetiką ir skatina mitochondrijų apykaitą. Ląstelių mirties skirtumas. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI ir kt. Mechaninis sutrikusios ferroptozės pagrindas ląstelėse, ekspresuojančiose į Afriką orientuotą p53 S47 variantą. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA ir kt. Mutantiniai BRAF ir MEK inhibitoriai reguliuoja naviko imuninę mikroaplinką piroptozės būdu. Vėžio atradimas. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Lizosomų membranos pralaidumas ląstelių mirtyje: nauji įrodymai ir pasekmės sveikatai ir ligoms. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P ir kt. Kvinakrino sukelta autofagija sergant kiaušidžių vėžiu sukelia katepsino-L sukeltą lizosomų / mitochondrijų membranų pralaidumą ir ląstelių mirtį. Vėžys (Bazelis). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC ir kt. Nuo katepsino priklausoma apoptozė, kurią sukelia supraoptimalus T limfocitų aktyvavimas: galimas didelės dozės tolerancijos mechanizmas. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A ir kt. Ppt1-trūkumas sutrikdo lizosomų Ca++ homeostazės reguliavimą, prisidedant prie patogenezės pelių CLN1 ligos modelyje. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM ir kt. Fosfolipazės ir reaktyviosios deguonies rūšys išvedė lipidų biomarkerius sveikiems ir sergantiems žmonėms ir gyvūnams – daugiausia dėmesio skiriama lizofosfatidilcholinui. Priekinė fiziol. 2021;12:732319.

21. Fu R ir kt. N-acetilcisteino veiksmingumas C1 tipo Niemann-Pick ligos pelių modelių fenotipiniam slopinimui. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z ir kt. N-acetilcisteinas apsaugo nuo olanzapino sukelto oksidacinio streso mHypoA-59 pagumburio neuronuose. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S ir kt. ASS1 ir ASL slopina aiškių ląstelių inkstų ląstelių karcinomos augimą, pakeisdami azoto metabolizmą. Vėžys Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A ir kt. Apsauginio askorbo rūgšties poveikio redokso ir endokanabinoidų sistemų sąveikai palyginimas in vitro kultivuotiems žmogaus odos fibroblastams, veikiamiems UV spinduliuotės ir vandenilio peroksido. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T ir kt. Vėžinių ląstelių pažeidžiamumo išnaudojimas kuriant kombinuotą terapiją, skirtą RA sukeliamiems navikams. Vėžio ląstelė. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X ir kt. Lipidų peroksidacijos stebėjimas putplasčio ląstelėse naudojant lizosomų tikslinį ir ratiometrinį zondą. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY ir kt. Bioinformatika pagrįsta analizė atskleidžia padidėjusį MFSD12 kaip pagrindinį ląstelių proliferacijos skatintoją ir galimą terapinį tikslą sergant melanoma. Onkogenas. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G ir kt. N-acetilcisteinas kaip antioksidantas ir disulfidą laužantis agentas: priežastys, kodėl. Nemokama Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M ir kt. Lizosomų metabolomika atskleidžia nuo V-ATPazės ir mTOR priklausomą aminorūgščių ištekėjimo iš lizosomų reguliavimą. Mokslas. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J ir kt. Imunogeninė ląstelių mirtis vėžio terapijoje: esami ir atsirandantys induktoriai. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G ir kt. PPT1 slopinimas padidina anti-PD-1 antikūnų priešnavikinį aktyvumą sergant melanoma. JCI įžvalga. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM ir kt. BAMM (BRAF autofagija ir MEK slopinimas sergant melanoma): I/II fazės dabrafenibo, trametinibo ir hidroksichlorokvino tyrimas pažengusiai BRAFV600-mutantinei melanomai. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M ir kt. Makroautofagijos baltymai kontroliuoja I klasės MHC lygį dendritinėse ląstelėse ir formuoja antivirusinius CD8 (+) T ląstelių atsakus. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P ir kt. Lizosomų cisteino mobilizacija formuoja TORC1 reakciją ir audinių augimą nevalgius. Mokslas. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetilcisteinas: klinikinio naudingumo apžvalga (senas vaistas su naujais triukais). J Nutr Metab. 2021; 2021: 9949453.

36. Alus LA ir kt. Sistemingas negimdinio nėštumo serumo biomarkerių atradimas naudojant 3-D baltymo profiliavimą kartu su kiekybiniu nustatymu be etiketės. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR ir kt. Pagrindinis poveikis ARID1A mutavusios kiaušidžių skaidraus ląstelių karcinomos proteomui yra mevalonato kelio reguliavimas po transkripcijos. Mol ląstelių proteomika. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant leidžia nustatyti didelius peptidų identifikavimo rodiklius, individualizuotą ppb diapazono masės tikslumą ir proteomo masto baltymų kiekį. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J ir kt. Andromeda: peptidų paieškos sistema, integruota į MaxQuant aplinką. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J ir kt. Tikslus proteomo masto kiekybinis nustatymas be etiketės, naudojant atidėtą normalizavimą ir maksimalaus peptidų santykio ekstrakciją, vadinamą MaxLFQ. Mol ląstelių proteomika. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S ir kt. Perseus skaičiavimo platforma, skirta išsamiai (prote)omikos duomenų analizei. Nat metodai. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformatikos platforma, skirta integruotai vėžio tyrimų proteomikos duomenų analizei. Metodai Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM ir kt. Senyvų fibroblastų lipidų metabolizmo pokyčiai sukelia nuo amžiaus priklausomą melanomos ląstelių atsparumą tikslinei terapijai per riebalų rūgščių transporterį FATP2. Vėžio atradimas. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA ir kt. Genomo inžinerija naudojant CRISPR-Cas9 sistemą. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P ir kt. Kalretikulino ekspozicijos, susijusios su imunogenine ląstelių mirtimi, kiekybinis įvertinimas. Metodai Enzymol. 2020;632:1–13.