Alyvuogių lapų ekstrakto (OLE) sutrikęs vazopresino sukeltas akvaporinas-2 judėjimas per kalcio jutimo receptorių aktyvavimą

Norėdami gauti daugiau informacijos. kontaktas:tina.xiang@wecistanche.com

Vazopresinas (AVP) padidina vandens pralaidumąinkstųsurinkimo kanalą reguliuojant neteisėtą akvaporino{0}} (AQP2) prekybą. Keletas sutrikimų, įskaitant hipertenziją ir netinkamą antidiurezinio hormono sekreciją (SIADH), yra susiję su vandens homeostazės sutrikimais. Įrodyta, kad tam tikri fitojunginiai yra naudingi žmonių sveikatai. Čia alyvuogių lapų ekstrakto (OLE) poveikis buvo įvertintas naudojant in vitro ir in vivo modelius. Konfokaliniai tyrimai parodė, kad OLE užkerta kelią vazopresino sukeltai AQP2 perkėlimui į plazmos membraną MCD4 ląstelėse ir žiurkėse.inkstus. Inkubuojant su OLE sumažėja nuo AVP priklausomas osmosinio vandens pralaidumo koeficiento (Pf) padidėjimas. Siekiant išsiaiškinti galimus OLE efektorius, buvo įvertintas viduląstelinis kalcis. OLE padidina ląstelėje esantį kalcio kiekį aktyvuodamas kalcio jutimo receptorių (CaSR).NPS2143 , selektyvus CaSR inhibitorius, panaikino slopinamąjį OLE poveikį nuo AVP priklausomam vandens pralaidumui. Eksperimentai in vivo atskleidė, kad gydymas OLE padidina CaSR mRNR ekspresiją ir sumažina AQP2 mRNR, lygiagrečiai su AQP2-taikančios miRNR-137 padidėjimu. Kartu šie atradimai rodo, kad OLE antagonizuoja vazopresino veikimą stimuliuodamas CaSR, o tai rodo, kad šis ekstraktas gali būti naudingas susilpninant sutrikimus, kuriems būdingas nenormalus CaSR signalizavimas ir turintis įtakos vandens reabsorbcijai inkstuose.

Alyvuogių lapai buvo plačiai naudojami kaip tradicinė priemonė nuo kelių ligų, ypač Viduržemio jūros šalyse. Lapai dažniausiai vartojami žmonių mityboje kaip ekstraktas arba milteliai, skirti ruošti užpilus ar žolelių arbatą. Cheminės charakteristikos analizė atskleidė, kad alyvmedžių lapuose yra keletas biologiškai aktyvių junginių, kurie gali turėti teigiamą poveikį sergant tam tikromis ligomis, tokiomis kaip metabolinis sindromas, dislipidemija ir hipertenzija. Sergantiesiems pirmine hipertenzija OLE sumažino kraujospūdį ir šiek tiek sumažino glikemiją bei kalcemiją. Daugybė polifenolių, tokių kaip oleuropeinas, hidroksitirozolis ir tirozolis, yra praturtinti žaliųjų alyvuogių lapų ekstrakte (OLE)5, ir yra žinoma, kad jie dalyvauja tam tikrų ligų, kurioms būdingas oksidacinis stresas, prevencijai. Todėl per pastaruosius kelerius metus įvairių mokslinių tyrimų sričių mokslininkų susidomėjimas galimo teigiamo alyvuogių lapų ekstrakto poveikio tyrimu didėja. OIE parodė reikšmingą antiproliferacinį poveikį piktybinėms mezoteliomos ląstelėms, pakeisdamas ląstelėje esančio kalcio dinamiką, galbūt nukreipdamas į T- tipo Ca2 plius kanalai. Įdomu tai, kad OLE daro antihipertenzinį poveikį genetinei hipertenzijai spontaniškai hipertenzinėms žiurkėms (SHR), susijusiai su kraujagyslių funkcijos pagerėjimu*. Per didelis vandens reabsorbcija vaidina svarbų vaidmenį padidėjusio kraujospūdžio patogenezėje. Hipertenzija sergantiems pacientams, gydytiems alyvuogių lapų ekstraktu, nustatytas reikšmingas kelių uždegiminių veiksnių, susijusių su kraujospūdžio sumažėjimu, sumažėjimas. Be to, per didelis vandens susilaikymas apibūdina keletą sutrikimų, tokių kaip kepenų cirozė, širdies nepakankamumas ir netinkama antidiurezinio hormono sekrecija (SIADH). Kūno vandens homeostazę griežtai kontroliuoja antidiurezinis hormonas vazopresinas (AVP), kuris išsiskiria esant dehidratacijai. AVP suriša savo giminingą V2R receptorių, lokalizuotą bazolaterinėje membranojeinkstųpagrindinės ląstelės, taip suaktyvindamos cAMP signalo kelią, dėl kurio akvaporiną{0}}(AQP2) turinčios pūslelės perkeliamos iš tarpląstelinio telkinio į viršūninę plazmos membraną, kur vyksta vandens reabsorbcija. Molekuliniu lygmeniu keli veiksniai gali keisti inkstų vandens balansą. Padidėjęs luminalinio kalcio kiekis sumažino trumpalaikį nuo vazopresino priklausomą AOP2 judėjimą, aktyvindamas kalcio jutimo receptorių (CaSR)1,12. Kita vertus, CaSR aktyvacija sąlygiškai įamžintose inkstų proksimalinėse kanalėlių epitelio ląstelėse, išskirtose iš žmogaus šlapimo, sukėlė reikšmingą citozolinio kalcio padidėjimą ir žymiai sumažino cAMP padidėjimą, kurį sukelia forskolinas (FK), tiesioginis adenilato cvklazės aktyvatorius3. , inkstų surinkimo kanalo MCD4 ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose vandens kanalą AOP2, CaSR stimuliavimas susilpnino nuo cAMP priklausomą AQP2 fosforilinimo padidėjimą serine 256, kuris yra pagrindinis įvykis signalo perdavimo kaskadoje, kurią aktyvuoja vazopresinas ir kuris galiausiai padidino vandens pralaidumą4. ,15 Be to, ininkstasskilteles iš vidinio pelės smegenų inksto, CaSR aktyvavimas naudojant kalcimimetinį NPS-R568 sukėlė reikšmingą AQP2-taikinio miRNR-137 padidėjimą, patvirtindamas glaudų CaSR signalo kelio ir AQP{ sąveiką. {4}}priklausomas vandens pralaidumas.17. Šiame tyrime buvo įvertintas alyvuogių lapų ekstrakto, gauto iš vietinės Coratina veislės, poveikis vazopresino sukeltai AQP2 funkcijai inkstų surinkimo kanalo MCD4 ląstelėse, kurios stabiliai ekspresuoja AOP2, ir dDAVP. gydytų žiurkių, kurioms buvo suleista ekstrakto. Pateikiame įrodymų, kad gydymas OLE neutralizuoja vazopresino atsaką inkstų ląstelėse, o tai iš dalies gali paaiškinti jo diuretinį poveikį. Įdomu tai, kad šis poveikis yra susijęs su OLE sukeltu CaSR aktyvavimu, receptoriumi, kuris, kaip žinoma, turi neigiamą sąveiką su vazopresino receptoriais2.

Sužinokite daugiau apie cistanche poveikį inkstams

Rezultatai

OLE poveikis vazopresino sukeltai AQP2 funkcijai MCD4 ląstelėse. Norint ištirti galimą OLE įtaką nuo vazopresino priklausomai AQP2 funkcijai,inkstųKaip eksperimentinis modelis buvo naudojami surinkimo kanalo MCD4 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios vazopresino receptorių 2 (V2R) ir žmogaus AQP2. Konfokaliniai tyrimai (1A pav.) atskleidė, kad, palyginti su dDAVP apdorotomis ląstelėmis, kuriose AQP2 dažymas lokalizuotas viršūninėje plazmos membranoje, gydymas OLE užkirto kelią AOP2 membranos lokalizacijai, kurią sukelia stimuliacija dDAVP. Remiantis šiais stebėjimais, gydymas OLE sumažino dDAVP sukeltą laikinojo osmosinio atsako padidėjimą (1B pav. pažymėtą 1/t) (OLE/dDAVP=88.70±1.{15}} proc.), n=292 langelių, palyginti su dDAVP=206.8±5,49 proc. ,n=186 langelių;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

OLE poveikis žiurkių, kurioms buvo suleista OLE, inkstams.

Siekiant toliau tirti OLE veiksmus, buvo atlikti in vivo tyrimai. Tiksliau, žiurkėms buvo švirkščiama OLE (25{8}} mg/kg per dieną) vieną kartą per dieną tris dienas. Arba žiurkės buvo kartu gydomos OLE 3 dienas ir dDAVP 3 0 min. Įvertinus CaSR mRNR, kuri buvo išskirta iš žiurkių inkstų surinkimo kanalo ir apdorota PGR realiuoju laiku (6 pav.), nustatyta, kad OLE (OLE=1.87±0.29, n{{) labai padidėjo CaSR mRNR kiekis. 10}} žiurkės, palyginti su PR=1,02±0,17, n=5 žiurkės; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">inkstas, atlikta Western blot analizė ir konfokaliniai tyrimai (9 pav.). Žiurkėms, kurioms buvo sušvirkšta OLE/dDAVP, AQP2 fosforilinimas ties 256 serine buvo žymiai sumažintas, palyginti su dDAVP gydytų gyvūnų inkstų audiniais (OLE/dDAVP=0). 77±0,16, n=5 žiurkės, palyginti su dDAVP=2,16±0,25, n=5 žiurkėmis; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskusija

Kalcis yra svarbus tarpląstelinis pasiuntinys, moduliuojantis daugybę ląstelių funkcijų2. Nenormalus kalcio signalas gali sukelti keletą ligų, įskaitant širdies nepakankamumą, vėžį ir hipertenziją23. Įrodyta, kad specifinė baltymų, kontroliuojančių daugybę intracelulinių kalcio signalų, ekspresijos ir aktyvumo kontrolė sėkmingai susiduria su daugeliu sutrikimų, todėl yra patraukli vaistų kūrimui. Šis tyrimas suteikia naujų įžvalgų apie OLE veikimo mechanizmą, parodydamas jo gebėjimą moduliuoti intracelulinį kalcio signalą stimuliuojant CaSR, kuris yra susijęs su vazopresino sukeltos AQP2 prekybos ir ekspresijos koregavimu. Fiziologinėmis sąlygomis AQP2 vaidina svarbų vaidmenį kontroliuojant kūno vandens homeostazę25. Intraląstelinio mechanizmo stimuliavimas, dėl kurio AQP2 lokalizuojasi viršūninėje plazmos membranoje, sukelia nenormalų vandens susilaikymą ir dėl to hiponatremiją, pvz., esant netinkamos antidiurezinio hormono (SIADH) sekrecijos sindromui, kepenų cirozei ir staziniam širdies nepakankamumui. SIADH modelio, susijusio su policistine inkstų liga 1 haploinsuficiumu, bazinis tarpląstelinis kalcio kiekis buvo žymiai sumažintas, palyginti su lygiu, išmatuotu laukinio tipo pelių surinkimo kanaluose. Mažas intracelulinis kalcio kiekis sumažino tam tikrų fermentų, įskaitant baltymo fosfatazę PP2A, aktyvumą, todėl serine 2561 sustiprėjo AOP2 fosforilinimas. CaSR aktyvinimas kalcimimetiku NPS-R568 padidino intracelulinę kalcio koncentraciją ir sumažino cAMP lygį ląstelėse, kuriose trūksta PKD1. Svarbu tai, kad citozolinis kalcis gali sumažinti kalciu slopinamą adenilinto ciklazę3 ir taip tiksliai sureguliuoti cAMP tarpląstelinį lygį. Iš tiesų, MCD4 ląstelėse CaSR stimuliavimas NPS-R568 sumažino AQP2-pS256, nes slopina adenilatą. ciklazė4. Šiame tyrime gydymas OLE užkirto kelią nuo vazopresino priklausomam cAMP ir AOP2-pS256 padidėjimui, galbūt antriniam dėl kalcio koncentracijos padidėjimo ląstelėse. Pažymėtina, kad išorinio cAMP šaltinio poveikis, naudojant pralaidų 8-Br-cAMP, žymiai sumažino slopinamąjį OLE poveikį V2R keliui.

Padidėjęs citozolinio kalcio kiekis gali sukelti ląstelių mirtį ir apoptozę. Tačiau nuolatinis intracelulinio kalcio padidėjimas nuo 25{4}} nM iki daugiau nei 600 nM paskatino neuronų išgyvenimą4. MCD4 ląstelėse gydymas OLE 0,1 mg/ml nerodomas. citotoksinis poveikis. Esant tokiai koncentracijai, OLE (0,1 mg/ml) šiek tiek padidino tarpląstelinį kalcio kiekį. Kalcio vaizdavimas atskleidė, kad ūminis stimuliavimas OLE sukėlė laikiną intracelulinio kalcio padidėjimą dėl CaSR aktyvavimo, kuris išnyksta, kai ląstelės buvo iš anksto inkubuojamos su selektyviu CaSR antagonistu NPS2143. Inkstų proksimalinėse kanalėlių ląstelėse CaSR suaktyvėjo alosteriškai su I-ornitinu. sumažino ROS gamybą ir taip sumažino mitochondrijų oksidacinį stresą, kuris sukėlė ląstelių apoptozę356. Be to, mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad CaSR funkcijų padidėjimo variantų išraiška sumažino ROS išsiskyrimą ir AQP237 S-glutationilinimą. Inkubavimas su OLE sumažino ROS susidarymą MCD4 ląstelėse35, parodydamas jo antioksidacinį gebėjimą. Nepaisant to, šiuo metu neaišku, ar OLE veikia AOP2-S-glutationilinimą. Daugybė tyrimų atskleidė, kad OLE arba oleuropeinas, kuris yra pagrindinė OLE sudedamoji dalis, gali atlikti apsauginį vaidmenį slopindamas ląstelių mirtį39. Tačiau žiurkėms, vartojančioms OLE, buvo aprašytas nuo dozės priklausomas poveikis. Teigiamas atsakas gautas vartojant 250 ir 500 mg/kg dozes. Priešingai, esant didesnėms koncentracijoms, gydymas OLE gali turėti žalingą poveikį galbūt dėl ​​kelių fitojunginių prooksidacinio poveikio. Šiame tyrime žiurkėms tris dienas buvo švirkščiama 250 mg/kg OLE dozė, o tai parodė padidėjusį CaSR reguliavimą. CaSR ekspresijos lygį padidina tam tikri junginiai, kurie veikia kaip allosteriniai receptorių aktyvatoriai. Kalcimimetikai iš tikrųjų sumažino kraujagyslių kalcifikaciją, padidindami CaSR biosintezę žmogaus kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse. Šiame konkurse negalima atmesti galimybės, kad tam tikri OLE junginiai gali veikti kaip alosteriniai CaSR moduliatoriai. Kita vertus, stimuliavimas vazopresinu gali sukelti IL-6 išsiskyrimą, kuris gali prisidėti prie CaSR42 ekspresijos lygio padidėjimo.

Inkstuose CaSR signalizacijos stimuliavimas yra susijęs su AQP2 ekspresijos sumažėjimu, galbūt per miR-137 generaciją. miRNR yra pagrindiniai potranskripcijos moduliatoriai. Taip pat buvo aprašytos kelios nuo vazopresino priklausomos miRNR, nukreiptos į AQP2 ekspresiją43. Transfekcija su miR-32 ir miR-137 žymiai sumažino AOP2 ekspresijos lygį mpkCCDc14 ląstelėse. Įdomu tai, kad OLE gali susilpninti uždegiminius signalus ir daryti apsauginį poveikį, moduliuodamas kelių miRNR ekspresijos lygį." Visų pirma daugiaformėse glioblastomos ląstelėse OLE skatino skirtingų miRNR, įskaitant miR-13745, kurios yra susijusios su mažėjančiu Akt/mTOR signalizacijos kelias 46. Pažymėtina, kad gydymas oleuropeinu užkerta kelią Akt/mTOR signalizacijai aktyvuojant kalcio sukeltą CAMK ir AMPK". CaSR aktyvinimas su NPS-R568 aktyvina AMPK ir sumažina mTOR aktyvumą žmogaus proksimalinėse kanalėlių ląstelėse3. Remiantis šiais duomenimis, inkubacija su OLE padidina citozolinį kalcio kiekį, sumažina PKA aktyvumą ir sumažina cistos dydį 3D ląstelių kultūros modelyje48. Kartu šie rezultatai rodo, kad OLE gali būti naudingas gydant sutrikimus, kuriems būdingas tarpląstelinio kalcio dinamikos reguliavimas, susijęs su CaSR signalizacijos sumažėjimu.

Alyvuogių lapų ekstraktą sudaro keli bioaktyvūs komponentai, įskaitant polifenolius, skaidulas ir mineralus49. Šiuo metu neaišku, ar vienas junginys arba sinerginis fitojunginių derinys OLE gali būti naudingas moduliuojant tarpląstelinius atsakus. Šiame tyrime naudojamas ekstraktas buvo naudojamas kaip galimas maisto priedas, todėl svarbu apibrėžti paties ekstrakto fiziologinį poveikį, atsižvelgiant į tai, kad keli fenoliai, įskaitant hidroksitirozolį, gali būti filtruojami per inkstus ir išsiskiria su šlapimu50. Tolesni tyrimai parodys specifinių komponentų, galinčių aktyviai reguliuoti intracelulinį kalcio signalą per CaSR, veiksmingumą. Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas pateikia įrodymų, kad OLE gali būti laikomas nauju potencialiu adjuvantu, naudingu sušvelninti sutrikimus, kuriems būdingas CaSR ekspresijos sumažėjimas, taip pat signalizacija ir poveikis inkstų vandens pralaidumui.

medžiagos ir metodai

Cheminės medžiagos ir antikūnai.Visos cheminės medžiagos ir antibiotikai buvo įsigyti iš „Merck“ („Merck KGaA“, Darmštatas, Vokietija). Calcein-AM, Fura-2-AM, ląstelių auginimo terpė, vaisiaus galvijų serumas (FBS) ir Super Signal West Pico chemiliuminescenciniai substratai buvo įsigyti iš Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV).Aquaporin{ {2}}(AQP2) buvo aptiktas naudojant specifinius antikūnus (C-tail Ab), sukurtus prieš sintetinį peptidą, atitinkantį paskutines 15 žmogaus AQP2 C-galo aminorūgščių!. AQP2-pS256 antikūnus maloniai padovanojo prof. Peteris Deenas. Antriniai ožkos anti-triušio krienų peroksidazės antikūnai buvo gauti iš Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Vokietija). Antrinis ožkų anti-triušio antikūnas, susietas su Alexa{14}}, buvo įsigytas iš Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV).

Fenolių turtingo ekstrakto gamyba ir cheminis apibūdinimas.Fenolio turtingo ekstrakto iš alyvuogių lapų gamyba buvo atlikta, kaip aprašyta Ranieri ir kt.35. Sumalus maišytuvu (Waring-Commercial, Torrington, CT, JAV), buvo pridėta ddH2O vandens (santykis 1/2 0, w/y) ir tris kartus buvo atliktas ultragarsas (CEIA, Viciomaggio, Italija). , 30 min kiekvieną kartą 35±5 laipsnių kampu. Galiausiai ekstraktai buvo filtruojami per filtravimo popierių, liofilizuojami ir laikomi -20 ° C temperatūroje. Gauti ekstraktai buvo filtruojami nailoniniais filtrais 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Vokietija) ir naudojami cheminiam apibūdinimui. Bendras fenolio kiekis, antioksidacinis aktyvumas ir pavienių fenolinių junginių identifikavimas buvo atliktas pagal Difonzo ir kt.. OLE parodė, kad polifenolių kiekis, nustatytas Folin-Ciocalteu, yra lygus 195 mg. galo rūgšties ekvivalentai (GAE) ir antioksidacinis aktyvumas, nustatytas pagal ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonrūgšties diamonio druska), sudaro 750 μmol TE (trolokso ekvivalentai) .

Ląstelių kultūra ir gydymas.Kaip eksperimentinis modelis buvo naudojamos pelės žievės surinkimo kanalo MCD4 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios žmogaus AQP2 ir chimerinį V2R-Rluc18. Ląstelės buvo auginamos 1:1 Dalbec-cos modifikuotos Eagle terpės ir F-12 mišinyje, papildytu 5 procentais (metus) galvijų vaisiaus serumu. 1 proc. (metai) L-glutamino ir 1 proc. penicilino / streptomicino, 5 μM deksametazono, 400 ug/ml G418 (atsparumui AQP2) ir 1 ug/ml puromicino (atsparumui V2R-Rluc) , drėgnoje 5 procentų CO atmosferoje, 37 laipsnių temperatūroje. MCD4 ląstelės buvo paliktos bazinės būklės (CTR) arba ilgai apdorotos OLE, esant 0,1 mg/ml O/N, dDAVP, esant 100 nM, 30 min., arba kartu apdorotos OLE ir dDAVP arba NPS2143, esant l μM O/N. .Arba ląstelės buvo veikiamos 8-Br-cAMP esant 500 μM 45 min. Trumpalaikiai eksperimentai buvo atlikti su 1 mg/ml OLE 5 min. ir NPS2143 10 μM 15 min. Eksperimentai buvo atlikti 3-5 nepriklausomą kartą, naudojant skirtingų pasažų ląsteles.

Gyvūnų modelis ir gydymas.Visos procedūros buvo atliktos laikantis Danijos nacionalinių eksperimentinių gyvūnų priežiūros ir tvarkymo gairių bei paskelbtų Nacionalinių sveikatos institutų gairių. Protokolus patvirtino Klinikinės medicinos institutas. Orhuso universitetas, pagal Danijos teisingumo ministerijos išduotas licencijas naudoti eksperimentinius gyvūnus (patvirtinimo numeris 2015-15-0201-00658). Tyrimai buvo atlikti su suaugusiais Wistar žiurkių patinais, kurių pradinis svoris buvo 200-225 g. Gyvūnai buvo laikomi standartine graužikų dieta (Altromin, Lage, Vokietija) ir turėjo laisvą prieigą prie vandens iš čiaupo. Eksperimentų metu žiurkės buvo laikomos grupėse po dvi narve, kurių šviesos ir tamsos ciklas buvo 12:12 h, temperatūra 21±2 laipsniai C, o drėgmė 55±2 proc. Penkios žiurkės buvo gydomos poodine injekcija 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danija) 200 ul fiziologinio tirpalo / gyvūnui, o penkios nešikliu gydytos žiurkės buvo kontrolinės. Po 30 minučių žiurkės buvo nužudytos, o inkstai buvo apdoroti, kaip aprašyta toliau.

Ląstelės ir IMCD lizatai.Ląstelės buvo auginamos ant {{0}} mm lėkštelių ir resuspenduojamos buferyje, kuriame yra 220 mM manitolio, 70 mM sacharozės, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4, esant proteazėms (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptino ir 2 mg/ml pepstatino A) ir fosfatazėms (10 mM NaF ir 1 mM natrio ortovanadato) inhibitoriai. Taip pat buvo paruoštos maždaug 0,5 mm inkstų sekcijos ir 10 minučių subalansuotos buferyje, kuriame yra 1,8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM gliukozės, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM. 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Inkstų papilė buvo susmulkinta žirklėmis tame pačiame buferyje, dalyvaujant proteazėms (1 mM PMSF, 2 mg/mlupeptinui ir 2 mg/mlepstatino A) ir fosfatazėms (10 mM NaF ir 1 mM natrio). ortovanadato) inhibitoriai. Po apdorojimo ultragarsu (60 kHz 5 s), lizatai buvo centrifuguojami esant 12, 000 × g 10 min. Supernatantai buvo surinkti ir naudojami imunoblotavimo tyrimams'8.

Konfokalinė mikroskopija.Konfokaliniai tyrimai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau1. Trumpai tariant, ląstelės buvo auginamos ant ląstelių kultūros PET intarpų ir apdorojamos, kaip aprašyta aukščiau. Arba inkstų sekcijos, gautos iš kontrolinių, OLE, dDAVP ir OLE su dDAVP gydytų žiurkių, buvo tiriamos imunofluorescencijos eksperimentais, kaip aprašyta anksčiau. Vaizdai buvo gauti naudojant konfokalinį lazerinį skenavimo fluorescencinį mikroskopą Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Šveicarija). Gelio elektroforezė ir imunoblotingas. Baltymai buvo atskirti 12 procentų dėmių neturinčiais poliakrilamido geliais (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) redukuojančiomis sąlygomis, kaip aprašyta anksčiau =5,52. Trumpai tariant, baltymų juostos buvo perkeltos ant Immobilon-P membranų (Merck KGaA, Darmštatas, Vokietija) ir imunoblotingos naudojant anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) ir anti-AQP2-pS256 antikūnus. Imunoreaktyvūs signalai buvo gauti naudojant Super Signal West Pico chemiliuminescencinius substratus su Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Juostos buvo normalizuotos iki bendro baltymo, naudojant technologiją be dėmių (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, JAV). Densitometrinė analizė buvo atlikta naudojant ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) ir analizuojama naudojant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, JAV).

Vandens pralaidumo tyrimas.Osmosinis vandens pralaidumas buvo matuojamas, kaip aprašyta anksčiau43. Trumpai tariant, MCD4 ląstelės buvo auginamos ant 40- mm stiklo dengiamųjų stiklelių. Po apdorojimo ląstelės buvo apkraunamos 10 μM membranai pralaidžiu Calcein-AM 45 min., esant 37 laipsnių 5 proc. CO, DMEM/F-12. Dengiamieji stikleliai buvo sumontuoti perfuzijos kameroje (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butleris, JAV). Matavimai atlikti naudojant apverstą TE2000-S mikroskopą (Nikon Eclipse microscope, Tokijas, Japonija), pritaikytą vienos ląstelės fluorescencijos matavimams. ir vaizdo analizė. Calcein-AM pakrauti mėginiai buvo sužadinti esant 490 nm. Fluorescencijos matavimai po izosmosinių (140 mM NaCl.5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl, 10 mM Hepes sulfo rūgšties, 5 mM gliukozės, pH 7,4) arba hiperosmosinių (izosmosinių tirpalų, pridėtų 135 mM manitolio) tirpalų. . buvo atlikti naudojant Metafluor programinę įrangą (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Torontas, Kanada). Užregistruoti laiko eigos fluorescencijos duomenys po ląstelių perfuzijos izo- ir hiperosmosiniais tirpalais. Ląstelių susitraukimo laiko eiga buvo matuojama kaip laiko konstanta (Ki, išreikšta 1/r, sek.), parametras, susijęs su vandens pralaidumu, gautas suderinus duomenis su eksponentine funkcija, analizuota naudojant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego). , CA, JAV).

Fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo matavimai.Norint įvertinti viduląstelinius cAMP pokyčius, buvo pritaikyta fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo (FRET) technologija. FRET eksperimentams ląstelės buvo transfekuotos plazmide, koduojančia H96 jutiklį, turintį cAMP surišantį EPAC1 konsensuso motyvą, įterptą tarp ciano fluorescencinio baltymo (CFP) ir cp173Venus-Venus, kaip parodyta anksčiau32.33.54. Plazmidė, koduojanti zondą H96, buvo dovana iš Dr.K. Jalink. ECFP ir (arba) EYFP ekspresuojančių ląstelių vizualizavimas ir FRET aptikimas buvo atliktas naudojant apverstą TE2000-S mikroskopą (Nikon Eclipse mikroskopą, Tokijas, Japonija). Kiekvienas vaizdas buvo pataisytas ir analizuojamas, kaip parodyta anksčiau55.

Intraląstelinis kalcio matavimas. Tarpląsteliniai kalcio matavimai buvo atlikti, kaip parodyta anksčiau56. Trumpai tariant, MCD4 ląstelės buvo apkraunamos 4 μM Fura-2 AM 15 minučių 37 laipsnių temperatūroje DMEM/F-12. Eksperimento metu ląstelėms perfuzuoti buvo naudojamas Ringerio tirpalas, kuriame buvo 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM gliukozės, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Atliekant fluorescencijos matavimus, dengiamieji stikleliai su perkrautomis ląstelėmis buvo sumontuoti perfuzijos kameroje (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, JAV). Matavimai buvo atlikti naudojant apverstą TE2000-S mikroskopą (Nikon Eclipse microscope, Tokijas. Japonija). Nubraižytas fluorescencijos intensyvumo santykis ties 340 ir 380 nm ir apskaičiuotas kaip fluorescencijos pokytis. Visų pirma, stimuliavimas OLE (1 mg/ml) arba NPS2143 (10 μM) to paties tipo ląstelėse buvo lyginamas su stimuliacija, gauta po stimuliacijos maksimalia kalcio tarpininkaujamo agonisto ATP doze (100 μM), kuri buvo naudojama kaip vidaus kontrolė (100 proc.).

Tarpląstelinis kalcio kiekis buvo išmatuotas esant pastoviai būsenai ir kalibruotas, kaip aprašyta Grynkiewicz57. OLE ir NPS2143 buvo naudojami ilgai, atitinkamai 0,1 mg/ml ir l uM, ir kiekvienas mėginys buvo kalibruotas pridedant 5 μM jonomicino, esant 1 mM EGTA (Rm.), po to 5 μM jonomicino 5 mM CaCl (RMA).

AQP2 ir CaSR mRNR realiojo laiko PGR analizė kontrolinėse ir gydomose žiurkėse.Realaus laiko PGR eksperimentai buvo atlikti, siekiant išmatuoti santykinę mRNR ekspresiją vidiniame medulių surinkimo kanale (IMCD), išskirtame iš kontrolinių ir gydomų žiurkės inkstų papilių. Buvo padarytos maždaug 0,5 mm inkstų pjūviai ir 10 minučių subalansuoti buferyje, kuriame yra 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM gliukozės, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 ir 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Inkstų papilė buvo išskirta stereomikroskopu. Kontrolinių ir gydomų žiurkių mėginiai buvo sumalti žirklėmis tiesiai į Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta 2,5 ug visos RNR naudojant SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), pagal gamintojo pasiūlymus (25C 10 min.;42C 60 min.;85C 5 min.). Realaus laiko PGR amplifikacija buvo atlikta naudojant TagMan Fast Advanced Master Mix su CaSR, AOP2 ir GAPDH testus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) StepOne Real-Time PGR sistemoje (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). ), nustatant gamintojo nurodytas terminio ciklo sąlygas (95 ° C 20 s; 40 ciklų alternatyviai 95 ° C temperatūroje 1 s ir 60 ° C 20 s). Rezultatai buvo išreikšti kaip 2- vertės (santykinis kiekybinis įvertinimas) su △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) apdorotu-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

miRNR{0}} įvertinimas kontrolinėje ir gydytoje žiurkėse.miRNR{{0}} kiekis kontroliniame ir gydomame žiurkės vidiniame medulių surinkimo kanale buvo įvertintas naudojant TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID; 477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), kuris leido labai jautriai ir konkrečiai pranešti apie subrendusią miRNR naudojant kiekybinę PGR. Buvo padarytos apie 0,5 mm inkstų griežinėliai ir 10 minučių subalansuojami buferyje, kuriame yra 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM gliukozės, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4. KH2PO4(pH7,4). Stereomikroskopu išskirta inkstų papilė. Tada kontrolinių ir gydytų žiurkių mėginiai buvo sumalti žirklėmis tiesiai į Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), kad būtų išgauta visa RNR. TaqMan Advanced miRNR cDNA sintezės rinkinys (Katalogas n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), buvo naudojamas cDNR sintezei gauti pagal gamintojo pateiktą protokolą (Poly (A) uodegos reakcija; ligavimo reakcija; atvirkštinės transkripcijos reakcija; miR-Amp reakcija). Sintetinę RNR (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) su 59-fosforu susintetino „Thermo Fisher Scientific“ ir naudojo kalibravimo kreivei atlikti, kad interpoliuotų miRNR mėginių vertes ir gautų tikslų miR-137 kiekio įvertinimą nanogramais. samples16, naudojant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, JAV).

Statistinė analizė.Visos reikšmės pateikiamos kaip vidurkiai ± SEM Statistinė analizė buvo atlikta naudojant vienpusį ANOVA, po to Newmano-Keulso daugkartinio palyginimo testą su *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Pareiškimai, etinis patvirtinimas ir sutikimas dalyvauti.Tyrimai su gyvūnais buvo atlikti laikantis Danijos nacionalinių eksperimentinių gyvūnų priežiūros ir tvarkymo gairių bei paskelbtų Nacionalinių sveikatos institutų gairių. Orhuso universiteto Klinikinės medicinos instituto gyvūnų priežiūros etikos komitetas patvirtino tyrimo protokolus pagal Danijos teisingumo ministerijos išduotas eksperimentinių gyvūnų naudojimo licencijas (patvirtinimo numeris 2015-15-0201-00658). Autoriai patvirtina, kad visi metodai buvo atlikti pagal atitinkamas gaires ir reglamentus. Be to, autoriai patvirtina, kad tyrimas buvo atliktas laikantis ARRIVE gairių.

Nuorodos

1. El, SN & Karakaya, S. Alyvuogių medis (Olea europaea) gali turėti teigiamą poveikį žmonių sveikatai. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Alyvuogių lapų ekstrakto poveikis metaboliniam atsakui, kepenų ir inkstų funkcijoms bei uždegiminiams biomarkeriams hipertenzija sergantiems pacientams. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Alyvuogių polifenoliai ir metabolinis sindromas. Molekulės

4. Cherif, S. ir kt. Klinikinis titruoto Olea ekstrakto tyrimas gydant esminę arterinę hipertenziją. J. Pharm. Belg. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA ir kt. Žalieji ekstraktai iš Cortina alyvuogių veislės palieka antioksidacines savybes ir biologinį aktyvumą. J. Funkcija. Maistas 31, 8.

6. Herrero, M. ir kt. Naujos alyvuogių aliejaus šalutinių produktų valorizacijos galimybės. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. ir kt. Oleuropeinu praturtintas alyvuogių lapų ekstraktas veikia kalcio dinamiką ir pablogina piktybinių mezoteliomų ląstelių gyvybingumą. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. ir kt. Antihipertenzinis oleuropeinu praturtinto alyvuogių lapų ekstrakto poveikis spontaniškai hipertenzija sergančioms žiurkėms. Maisto funkcija 7, 584–593.

9. Hall, JE Inkstų disfunkcija, o ne neinkstų kraujagyslių disfunkcija. Tarpininkauja druskos sukeltai hipertenzijai. Tiražas 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopresinas ir akvaporino reguliavimas-2. Clin. Exp. Nefrolis. 17, 751–764.