Tėvo nikotinas pagerina baimės atmintį, sumažina nikotino vartojimą ir keičia palikuonių hipokampo genetinę ir nervų funkciją
Mar 21, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robertas D. Cole'as3|Valerija Lallai4|Aswathy Sebastian5|Ivanas Albertas5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1
1 Biologinės elgsenos sveikatos departamentas, Penn State universitetas, universiteto parkas, Pensilvanija
2 Farmakologijos skyrius, Vanderbilto medicinos mokykla, Nešvilis, Tenesis
3 Farmacijos koledžas, Kentukio universitetas, Leksingtonas, Kentukis
4 Neurobiologijos ir elgesio katedra, Kalifornijos universitetas Irvine, Irvine, Kalifornija
5 Bioinformatika, biochemija ir molekulinė biologija, Penn State universitetas, universiteto parkas, PA
6 Temple universiteto Psichologijos skyrius, Filadelfija, Pensilvanija
Abstraktus
Nikotino vartojimas vis dar labai paplitęs visame pasaulyje vartojamų tabako ir elektroninių cigarečių gaminiuose. Tačiau vis daugiau įrodymų apie transgeneracinį epigenetinį paveldėjimą rodo, kad nikotino vartojimas gali pakeisti elgesį ir neurobiologiją kitose kartose. Išbandėme lėtinio tėvo nikotino poveikio C57BL6/J pelėms F1 ir F2 palikuonių baimės sąlygotumui, sąlygotą baimės išnykimą ir spontanišką atsigavimą, nikotino savarankišką vartojimą, hipokampo cholinerginį funkcionavimą, RNR ekspresiją ir DNR metilinimą F1. palikuonių. Tėvo nikotino ekspozicija buvo susijusi su sustiprintu kontekstiniu ir užuominos baimės kondicionavimu ir spontanišku užgesusių baimės prisiminimų atsigavimu. Be to, nikotino sutvirtinimas pelėms, turinčioms nikotino, buvo sumažintas, kaip įvertinta savarankiško vartojimo paradigmoje. Šie elgesio fenotipai buvo susieti su pakitusiu atsaku į nikotiną, sureguliuotu hipokampo nikotino acetilcholino receptorių surišimu, sumažėjusiomis hipokampo cholinerginėmis srovėmis ir pakitusiu hipokampo genų metilinimu ir ekspresija, susijusia su nervų vystymusi ir plastiškumu. Genų ekspresijos analizė rodo kelių kartų poveikį platesniems genų tinklams, kurie gali būti susiję su neuroplastiškumu ir psichikos sutrikimais. Baimės kondicionavimo pokyčiai taip pat rodo fenotipus, panašius į nerimo sutrikimus, panašius į potrauminį stresą.
Raktažodžiai: cholinerginis, hipokampas, mokymasis, daugiakartis, nikotinas, transgeneracinė
1. ĮVADAS
Daugėja įrodymų, kad piktnaudžiavimo narkotikais poveikis yra ne tik individas, bet ir neveikiančių palikuonių fiziologiniai ir elgesio fenotipai.{0}} Nikotino poveikio kartoms apibūdinimas yra labai svarbus atsižvelgiant į tabako gaminių vartojimo paplitimą4 ir dramatišką augimą. 5 Dėl poveikio smegenų cholinerginėms sistemoms nikotino poveikis sukelia ryškius smegenų funkcijos pokyčius, dėl kurių gali atsirasti priklausomybė nuo nikotino ir padidėti psichikos sutrikimų, įskaitant depresiją6 ir nerimą, rizika.7 Epigenetinės modifikacijos po cholinerginio aktyvavimo gali leidžia daryti nuolatinį poveikį ląstelių ir grandinės funkcijoms.8,9 Iki šiol buvo manoma, kad šios epigenetinės modifikacijos buvo ištrintos nustačius gemalo liniją ir taip atskirtos nuo vėlesnių kartų. Tačiau epigenetinės modifikacijos, įskaitant DNR metilinimą, histono posttransliacines modifikacijas ir nekoduojančias RNR, įgytos per vieną kartą, gali būti paveldimos kitos kartos metu. .
Daugelio nepriklausomų laboratorijų atlikti graužikų tyrimai pradėjo nustatyti kelių kartų ir kartoms skirtus tėvų nikotino poveikio padarinius. Šis darbas iki šiol nustatė tėvų nikotino poveikio į depresiją ir nerimą panašiems fenotipams,1 kognityviniam lankstumui,2 į dėmesio stokos hiperaktyvumo sutrikimą (ADHD) panašiam elgesiui,3 ir genų ekspresijai.1,2. nikotino poveikis gali turėti įtakos endofenotipams, susijusiems su priklausomybe nuo nikotino ir psichine sveikata. Pavyzdžiui, parodėme, kad nikotino ekspozicija moduliuoja kontekstinį baimės sąlygojimą – nuo hipokampo priklausomo baimės mokymosi modelį, susijusį su pažeidžiamumu dėl psichikos sveikatos sutrikimų, tokių kaip potrauminio streso sutrikimas (PTSD) ir priklausomybė.{5}} Nikotinas. poveikį kontekstinės baimės mokymuisi moduliuoja hipokampas.15,16 Mes nustatėme, kad ūmus nikotino poveikis sustiprina nuo hipokampo priklausomą baimės mokymąsi,15,17 sumažina kontekstinės baimės išnykimą,18,19 ir padidina spontanišką kontekstinės baimės atsigavimą po to. išnykimas.18 Tačiau tėvo nikotino poveikio kelių kartų ir kartų kartoms poveikis šiems fenotipams nebuvo tirtas. Be to, jokie ankstesni tyrimai nebuvo apibūdinę nikotino kelių kartų poveikio cholinerginei funkcijai. Daugiakartinis paveldėjimas reiškia fenotipus, atsirandančius kartoje, iškart po pažeidžiamų asmenų, o tarp kartų paveldėjimą sudaro epigenetinės informacijos paveldėjimas tarp kartų, nesant tiesioginio aplinkos poveikio, dėl kurio atsiranda fenotipinė variacija.11 Čia išnagrinėjome tiek daugiakartes. ir transgeneracinis tėvo nikotino poveikio poveikis kontekstiniam ir baimių mokymuisi F1 ir F2 kartose, taip pat nikotino savarankiškam vartojimui, hipokampo nikotino acetilcholino receptorių (nAChR) prisijungimui, hipokampo cholinerginiam funkcionavimui, hipokampo geno ekspresijai ir metilinimo DNR hipokampo viduje. F1 kartos. Manome, kad tėvo nikotino poveikis turės įtakos baimės sąlygojimui, hipokampo genų ekspresijai ir palikuonių bei senelių palikuonims.
cistanche ekstrakto poveikis
2 METODAI IR MEDŽIAGOS
2.1 Dalykai
Tiriamieji buvo C57BL/6J pelių patinai ir patelės (8–20 savaičių amžiaus, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Išskyrus laikymo vietą haremo veisimui, visi gyvūnai buvo laikomi grupėse su 12 valandų šviesos / tamsos ciklu ir ad libitum prieiga prie maisto ir vandens. Savarankiško vartojimo metu tiriamiesiems buvo ribojamas maistas iki 85–90 procentų laisvai maitinamo kūno svorio, o vanduo buvo tiekiamas ad libitum. Visi elgsenos testai buvo atlikti nuo 9:00 iki 18:00:00 val. Visos procedūros buvo atliktos pagal NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą ir patvirtintos Penn State universiteto, Templo universiteto arba Kalifornijos universiteto Irvine IACUC komitetų.
2.2 Tėvo nikotino poveikis
Patinai (8 savaites) gavo 0,9 proc. sterilaus fiziologinio tirpalo arba nikotino vandenilio tartrato druskos (12,6 mg/kg per dieną, laisvos bazinės masės – Fisher Scientific, Waltham, MA arba MP Biomedical, Santa Ana, CA), ištirpintos 0,9 proc. sterilus fiziologinis tirpalas, tiekiamas po oda per osmosines mini pompas (Alzet, 1004 modelis, Durect, Cupertino, CA) 28 dienas. Ši dozė sukelia nikotino ir kotinino koncentraciją plazmoje, panašią į vidutinį rūkančių žmonių kiekį.20,21
2.3 F1 ir F2 pelių generavimas
Nikotino pusinės eliminacijos laikas pelių organizme yra maždaug 6 minutės.22 Anksčiau buvo įrodyta, kad nikotino pašalinimo poveikis išnyksta praėjus 4 dienoms po nikotino pašalinimo.23-25 Todėl tarp gydymo nikotinu ir nikotino vartojimo reikia 4 dienų atidėjimo. veisimas buvo įgyvendintas siekiant užtikrinti sisteminį nikotino pašalinimą prieš veisimą. Pelių patinai 2 savaitėms buvo patalpinti į narvus su dviem naiviomis C57BL/6 J patelėmis (8–20 savaičių amžiaus), kad susilauktų F1 palikuonių. F2 pelės buvo sukurtos poruojant naivius F1 pelių patinus su naiviomis patelėmis.
2.4 Baimės sąlygojimas
Baimės kondicionavimo ir išnykimo procedūros buvo išsamiai aprašytos anksčiau.19 Trumpai tariant, pelės buvo dresuojamos ir išbandytos triukšmą slopinančiose kamerose (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB foninis triukšmas; MED Associates, St. Albans, VT). F1 ir F2 pelės buvo baimės sąlygotos dviejų sąlyginių dirgiklių (CS, 30 s, 85‐dB baltasis triukšmas) ir besąlyginio stimulo (JAV, 2 s, 0,57 mA pėdos smūgiai) poromis, atskirtomis 120 sekundžių. Norint ištirti ūmų nikotino poveikį F1 ir F2 pelių baimei, palikuonys gavo ūmaus nikotino (0,09 mg/kg, NIC laisvos bazės masė, ip; nikotino vandenilio tartrato druska, Fisher Scientific) arba fiziologinį tirpalą (SAL) prieš 2–4 minutes. į mokymus ir testavimo sesijas. Praėjus dvidešimt keturioms valandoms po treniruotės, pelės buvo grąžintos į treniruočių kontekstą 5 minutėms, kad būtų galima įvertinti kontekstinį užšalimą. Po kontekstinio testavimo pelės buvo patalpintos į atskiras kameras, kad būtų galima įvertinti baimės mokymąsi. Eksperimentuotojai, apakinti nuo sąlygų, įvertino užšalimą, apibrėžiamą kaip savanoriško judėjimo nebuvimą, išskyrus kvėpavimą, taikydami nešališką laiko atrankos metodą.19 Norint ištirti galimus lubų efektus atliekant bandomąjį testą, atskira F1 pelių grupė buvo mokoma identiškai su tik vienu CS‐US. taip pat buvo tiriamas poravimas, kontekstinis baimės išnykimas ir spontaniškas atsigavimas. Baimė išnyko per penkis seansus iš eilės, pradedant kitą dieną po kontekstinio ir užuominos baimės testavimo. Po paskutinės išnykimo sesijos pelės buvo paliktos netrikdomos savo namų narveliuose 7 dienas, o po to pakartotinai išbandytos treniruočių kontekste, kad būtų galima spontaniškai pasveikti. Norint nustatyti, ar pastebėti baimės sąlygojimo skirtumai atsirado dėl jautrumo šokui, nerimo ar platesnio mokymosi trūkumo skirtumų, NIC ir SAL-Sired gyvūnų patinai ir patelės buvo papildomai tiriami atvirame lauke, jautrumas smūgiams, padidėjęs ir labirintas ( EPM) ir naujos objektų atpažinimo paradigmos (visus metodus ir rezultatus žr. Pagalbinėje informacijoje).
2.5 Savarankiškas nikotino vartojimas su maistu ir į veną
A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 granulės per seansą per tris tolesnius seansus), tiriamieji buvo kateterizuojami naudojant izoflurano (1–3 proc.) / deguonies garų anesteziją, kaip aprašyta anksčiau.26 Pelėms buvo leista atsigauti po operacijos daugiau nei 72 valandas prieš patekimą į juos. vėl atsakyti už maisto atlygį. Maisto atsako atkūrimas užtikrina, kad pelės pakankamai atsigavo po intraveninės operacijos ir normaliai reaguoja į operaciją, kai vėluojama patekti į operacinės kameros. Tada pelėms buvo leista savarankiškai švirkšti į veną (IV) nikotino per 1 valandą kasdien, 6–7 dienas per savaitę (nikotino vandenilio tartrato druska, ištirpinta 0,9 proc. steriliame fiziologiniame tirpale, {{1}{101} {12}}}}.03 mg/kg per infuziją, laisvas bazinis svoris; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotinas buvo tiekiamas Razel švirkšto pompa (Med Associates). Kiekviena sesija turėjo dvi ištraukiamas svirtis (viena aktyvi, kita neaktyvi). Užpildžius atsako kriterijus ant aktyvios svirties, buvo atlikta IV nikotino infuzija (0.{{20}}3 ml infuzijos tūris; FR5TO20 sek. grafikas). Neaktyvios svirties atsakymai buvo užfiksuoti, bet neturėjo suplanuotų pasekmių. Po aštuonių 0,03 mg/kg/infuzijos gavimo seansų infuzijos dozė buvo pakeista į 0,1 mg/kg/infuziją šešiems seansams. Kiekvienai dozei statistinei analizei buvo naudojamas vidutinis paskutinių trijų seansų suvartojimas. Kateteriai kasdien buvo plaunami fiziologiniu steriliu fiziologiniu tirpalu (0,9 % m/v), turinčiu heparino (100 USP vienetų/ml). Kateterio praeinamumas buvo patikrintas naudojant Brevital (metoheksitalio natrio druska, Eli Lilly, Indianapolis, IN) po savarankiško nikotino vartojimo fazės. Siekiant įvertinti su atkryčiu susijusį elgesį, pelėms buvo tiriamas potraukis po seanso iškart po paskutinės 0,1 mg/kg/infuzijos IV nikotino dozės; Šioje procedūroje pelėms leidžiama reaguoti aktyviąja svirtimi, bet negaunama nikotino infuzijų. Pirmosios pradinės inkubacijos sesijos metu (1 diena) pelės buvo patalpintos į operacines kameras pagal FR5TO20 sek grafiką su kontingentu įjungus signalo šviesą. Po to pelės 20 dienų buvo laikomos namų narvuose. 21 abstinencijos dieną pelės buvo tiriamos dėl potraukio inkubacijos, o aktyvi svirties signalo lemputė buvo perduodama pagal FR5TO20 sekundžių grafiką. Tyrimus atliko eksperimentuotojai, apakinti nuo grupės sąlygų, o elgsenos reakcijas automatiškai užregistravo MedAssociates programinė įranga.
2.6 Nikotino acetilcholino receptorių prisijungimas
Radioligando surišimo tyrimas16 buvo atliktas naudojant hipokampus iš 8 savaičių NIC-Sired (5 M ir 10F) ir SAL-Sired (9 M ir 6F) F1 pelių. Mėginiai buvo homogenizuoti naudojant lizės buferį (5 mM Tris plius 5 mM EDTA plius 5 mM EGTA), centrifuguojami 100 000 g 30 minučių 4 laipsnių kampu, resuspenduojami lizės buferyje ir vėl centrifuguojami. Granulės buvo resuspenduotos Tris/10 procentų sacharozės buferyje ir inkubuojamos su [3H] epibatidinu ([3H]EB) (~2 nM, remiantis 27,28) (specifinis aktyvumas 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) 1 val. valandą kambario temperatūroje. [3 H]EB buvo pasirinktas nAChR surišimui, nes ankstesni rezultatai parodė, kad hipokampo heteromeriniai 4 2 nAChR tarpininkauja nikotino poveikiui baimės sąlygojimui.17 Nespecifinis jungimasis buvo įvertintas esant 300 μM nikotino (nikotino vandenilio tartrato druskos). ištirpintas Tris buferyje, laisvos bazės koncentracija). [3H]EB surišti nAChR buvo filtruojami (24 šulinėlių ląstelių rinktuvas, Brandel Co, Gaithersburg, MD), o skysčių scintiliacijos skaitiklis (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) matavo filtro radioaktyvumą. Specifinis surišimas, išreikštas fmol/mg audinio, buvo apskaičiuotas kaip skirtumas tarp bendro ir nespecifinio surišimo.16
2.7 In vivo amperometriniai cholinerginiai įrašai
Hipokampo cholinerginio perdavimo pokyčiams įvertinti naudojant amperometriją buvo naudojama atskira naivių 10–20 savaičių NIC-Sired ir SAL-Sired F1 pelių grupė. Keraminiai mikroelektrodai (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), su 4 (15 × 333 μm) platinos įrašymo vietomis, išdėstytomis poromis (viršutinė ir apatinė), buvo padengti cholino oksidaze (EC numeris 1.1.3.17; Sigma‐). Aldrichas, Sent Luisas, MO), kaip buvo pranešta anksčiau.29 Elektrodai buvo elektropolimerizuoti metafenilendiaminu (m-PD; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO), siekiant padidinti selektyvumą nustatant cholino sroves. Acetilcholino (ACh) išsiskyrimo jautriam indeksui nustatyti buvo naudojami mikroelektrodai, kurių jautrumas didesnis arba lygus 3 pA/μM, o aptikimo riba yra mažesnė arba lygi 400 nM cholinui.30 Gyvūnai buvo anestezuoti uretanu (1,2–1,5). g/kg, ip) ir fermentais padengti mikroelektrodai buvo stereotaksiškai nuleisti į nugarą (A/P –1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V –2,3 mm) arba ventralinius (A/P –3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hipokampas. Ventralinis ir nugarinis hipokampas buvo vertinami atskirai, nes jie skirtingai prisideda prie kontekstinės baimės sąlygojimo: ventralinis hipokampas (vHPC) vaidina svarbesnį vaidmenį susiejant ir išreiškiant baimę, o nugaros hipokampas (DHCP) yra labai svarbus kontekstinei atminčiai.31 Ag/ AgCl etaloniniai elektrodai buvo implantuoti į kontralateralinę rostralinę žievę.
Amperometriniai įrašai buvo atlikti 2 Hz dažniu, taikant fiksuotą potencialą plius 0,7 V, o duomenys buvo suskaitmeninti (FAST-16 potenciostatas, Quainton, Nicholasville, KY). Fono srovės buvo stabilizuotos 60 minučių, tada į hipokampą buvo įlašinami vaistai, naudojant stiklinį kapiliarą (galiuko skersmuo: 15 μm), pritvirtintą prie elektrodo. Depoliarizacijos sukeltas ACh išsiskyrimas buvo matuojamas naudojant trumpus kalio (KCl 70 mM; 100 NL) arba NIC (1 mM laisvos bazės, nikotino tartratas; 100 NL) impulsus 2–10 psi kas 2 minutes. Hipokampo regiono (nugaros arba ventralinio) ir vaisto (kalio arba NIC) įrašai buvo atsverti. Cholino signalo amplitudės buvo išmatuotos pagal srovės pokytį fermentu padengtame kanale nuo pradinės srovės ir, remiantis in vitro kalibravimu, konvertuojamos į μM cholino ekvivalentus. Savireferencija buvo priimta siekiant pašalinti artefaktus, atimant sroves iš kontrolinių kanalų.29 Mikroelektrodų išdėstymas buvo patikrintas vainikinių hipokampo pjūvių dažymu Nissl (S1 pav.). Statistinei analizei buvo naudojami dviejų atsakymų, gautų vienam gyvūnui manipuliuojant vaistu, vidurkiai.
2.8 Statistinė analizė
Statistiniai palyginimai buvo atlikti naudojant SPSS (IBM, Armonk, NY) arba GraphPad Prism (La Jolla, CA, JAV). Nukrypimai buvo nustatyti pagal vertes, 2 standartinius nuokrypius virš vidurkio. Jei aptikta nukrypimų, informacija įtraukiama į rezultatų skyrių. Reikšmingumo kriterijus nustatytas=0,05. Iš pradžių buvo atlikta statistinė analizė, įtraukiant lytį kaip veiksnį visuose eksperimentuose, kuriuose tikrinami tiek patinai, tiek patelės. Analizės dėl sekso žlugo, kai nebuvo aptikta trijų ar dvipusių sąveikų su seksu (P > 0,05). Duomenys buvo analizuojami naudojant t-testą, 1-kryptį arba 2-kryptį ANOVA. Po reikšmingų pagrindinių arba sąveikos efektų buvo atlikti LSD post hoc palyginimai. Po pakartotinių matavimų ANOVA buvo atliktas Bonferroni post hoc palyginimas su kelių palyginimų korekcija. Jei buvo aptiktos nevienodos dispersijos, buvo naudojamas Welcho t testas nelygioms dispersijoms nustatyti ir laisvės laipsniai buvo suapvalinti.
2.9 RNR/DNR išskyrimas
Suaugusios F1 pelės (8 savaičių amžiaus; n=3 M ir 3 F vienoje grupėje) buvo eutanazuotos per gimdos kaklelio išnirimą. Hipokampai buvo greitai išpjaustyti į pilvo ir nugaros dalis (santykiu 1: 1), sujungti iš kairės ir dešinės pusės ir greitai užšaldyti ant sauso ledo. DNR ir RNR buvo izoliuotos ir išgrynintos naudojant „AllPrep DNA/RNA Mini Kit“ (Qiagen, Valencia, CA). RNR ir DNR koncentracija ir kokybė buvo įvertinti naudojant NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) ir Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). RNR ekstrahavimo atveju minimalus RNR vientisumo skaičius (RIN) buvo 8,5.
2.10 Transkripto analizė per
RNR sekos nustatymo bibliotekas parengė Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) 150 bp vieno galo skaitymui naudojant Illumina TruSeq Stranded mRNR Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) ir sekvenuota Illumina HiSeq 2500 greitojo paleidimo režimu (trys paleidimai iš eilės, maždaug 10 mln. nuskaitymų kiekviename pavyzdyje). FASTQ failų kokybė buvo patikrinta naudojant FASTQC, o vidutinis skaitymo Phred kokybės balas buvo didesnis nei 30 (ty mažiau nei 0,1 proc. sekos klaida). FASTQ failai buvo suderinti su pelės etaloniniu genomu (mm10; UCSC genomo naršyklė), naudojant TopHat (v2.1.0)32 Galaxy Project33. Rankogalių segtukai ir Cuffmerge (v2.2.1.0)34 buvo naudojami surinkti nuorašus iš susietų skaitymų ir sujungti transkripcijos failus galutiniam transkripto surinkimui. Klaidingos aptikimo dažnio (FDR) pakoreguotos P vertės buvo apskaičiuotos diferencinei genų ekspresijai iš NIC-Sired ir SAL-Sired mėginių, naudojant Cuffdiff (v2.2.1.3),34 su standartine FDR ribine 0,05,35 Transkripto duomenų rinkiniai. į genų ekspresijos omnibusą.
2.11 Sodrinimo analizė
Skirtingai išreikšti genai buvo analizuojami naudojant išradingumo kelio analizę (IPA, paleista 2018 m. gruodžio mėn.; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, JAV)36, siekiant atskleisti galimą asociatyvinių biologinių tinklų praturtėjimą. Vykdymo parametrai nurodė ne daugiau kaip 35 molekules viename genų tinkle ir apribojo žinduolių CNS audinių arba ląstelių linijų analizę. Statistinis sodrinimo reikšmingumas buvo nustatytas naudojant tikslųjį Fišerio testą dešinėje pusėje, pakoreguotą atliekant kelis bandymus.
2.12 Tikslinis bisulfitų sekos nustatymas
DNR metilinimo analizei buvo naudojama DNR, izoliuota kartu su RNR (žr. 2.9 skyrių). RNA-seq nustatė atitinkamai 952 ir 162 skirtingai išreikštus genus vHPC ir DHCP. 1010 unikalūs genai iš šių sujungtų sąrašų buvo atrinkti praturtinti bisulfito seka naudojant pasirinktinę SeqCap Epi sodrinimo sistemą (Roche, Pleasanton, CA, JAV; S1 lentelė).38 Tikslinis bisulfitas. sekvenavimas buvo atliktas Penn State Huck Institute of the Life Sciences Genomics Core Facility. Bibliotekos buvo sukurtos naudojant KAPA Hyper Prep rinkinį (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Natrio bisulfitu konvertuotos bibliotekos buvo amplifikuotos ir praturtintos pasirinktuose genomo regionuose, naudojant pasirinktinį fiksavimo zondo rinkinį (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, JAV). Pagauta DNR buvo sekvenuota naudojant Illumina HiSeq 2500, naudojant 100 nt suporuoto galo nuskaitymus. FASTQ failų kokybė buvo patikrinta naudojant FASTQC. „Illumina“ adapterių sekos buvo pašalintos, o žemos kokybės pagrindai apkarpyti naudojant „Trimmomatic“.39 Žemos kokybės pagrindo apipjaustymas buvo atliktas naudojant slankiojančio lango metodą, kai vidutinė kokybė keturių bazių porų lange nukrito žemiau 20 slenksčio. minimalus skaitymo ilgis yra 35. Po apkarpymo FASTQ failų vidutinis skaitymo Phred kokybės balas buvo didesnis nei 30 (ty mažiau nei 0,1 proc. sekos klaida). Apkarpyti rodmenys buvo susieti su pelės etaloniniu genomu (mm10), naudojant Bowtie240, įdiegtą Bismark.41 Metil{20}}Bismark ekstraktas buvo naudojamas CpG metilinimo informacijai išgauti ir metilinimo ataskaitoms kurti. MethylKit42 buvo naudojamas skirtingai metilintų regionų (DMR) analizei. Metilinimo būsena buvo apibendrinta per nepersidengiančius 500 bazinių porų langus ir atlikta diferencinė metilinimo analizė su standartiniu FDR 0,05,35. Duomenų rinkiniai buvo deponuoti Gene Expression Omnibus.
Cistanche ekstrakto nauda
3 REZULTATAI
3.1 Tėvo nikotinas sustiprina kontekstinę baimę ir panaikina ūmų nikotino stiprinimą kontekstinės baimės sąlygojimui F1 ir F2 kartos pelėms
NIC-Sired ir SAL-Sired F1 pelių patinai ir patelės buvo sąlygotos baimės po ūmaus SAL arba NIC vartojimo (0.09 mg/kg ip, 1A pav.). Išsami pradinio, prieš CS ir CS užšalimo analizė įtraukta į pagalbinę informaciją. 3 krypčių kontekstinio užšalimo ANOVA, kai buvo gydomi tėvais, ūminis gydymas vaistais ir seksas kaip veiksniais, atskleidė reikšmingą tėvo × ūmaus gydymo vaistais sąveiką (F(1,36)=32.75, P < ).{27="" }}01).="" kadangi="" nebuvo="" reikšmingos="" sąveikos="" tarp="" lyties="" ir="" tėvo="" ar="" ūminio="" gydymo="" vaistais,="" buvo="" atlikta="" dviejų="" krypčių="" anova,="" kurios="" žlugimas="" tarp="" lyties,="" ir="" atskleidė="" reikšmingą="" tėvo="" gydymą="" ×="" ūmi="" gydymo="" vaistais="" sąveika="" (f(1,40)="20.96)." ,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" palyginimai="" parodė,="" kad="" fiziologiniu="" tirpalu="" gydytų="" nic-sired="" f1="" pelių="" kontekstinė="" baimė="" buvo="" sustiprinta,="" palyginti="" su="" fiziologiniu="" tirpalu="" gydomomis="" sal-sired="" f1="" pelėmis="" (t20="2.73," p="">< 0,05).="" remiantis="" ankstesniais="" duomenimis,="" 43="" ūminis="" nic,="" esant="" 0,09="" mg/kg,="" padidino="" sal-sired="" pelių="" kontekstinę="" baimę="" (t22="2.99," p="">< 0,01).="" tačiau="" ūminis="" nic,="" vartojant="" 0,09="" mg/kg,="" sumažino="" nic="" turinčių="" pelių="" kontekstinę="" baimę="" (t18="3.36," p="">< .01).="" apskritai,="" nic-sired="" nic="" pelių="" konteksto="" užšalimo="" lygiai="" buvo="" panašūs="" į="" tuos,="" kurie="" buvo="" stebimi="" sal-sired="" sal="" pelėms,="" kai="" buvo="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).
Be to, buvo išbandyti NIC ir SAL-Sired gyvūnų patinai ir patelės pagal jautrumą smūgiams (S2 pav.), padidintą ir labirintą (EPM, S3 pav.), atvirą lauką ir naujas objektų atpažinimo paradigmas (S4 pav., Visiems metodams žr. Pagalbinę informaciją). ir rezultatai). Išskyrus NIC-Sired pateles, sergančias EPM (kurioms pasireiškė padidėjęs į nerimą panašus elgesys) ir NIC-Sired gyvūnus, kurių jautrumas šokui (kurių sumažėjęs vokalinis reaktyvumas į šoką, o tai nesumaišytų sustiprinto baimės mokymosi kelių kartų fenotipo), skirtumų nėra. buvo aptikta tarp NIC- ir SAL-Sired pelių.
1 PAVEIKSLAS Tėvo nikotinas sustiprina kontekstinį baimės sąlygojimą ir susilpnina ūminį baimės sąlygojimo nikotino poveikį. Kontekstinis užšalimas buvo žymiai didesnis NIC-Sired plus SAL, palyginti su SAL-Sired plus SAL kontrolėmis. Ūminis nikotinas (0,09 mg/kg) sustiprino kontekstinę baimę SAL-Sired, bet žymiai sumažino kontekstinę baimę NIC-Sired gyvūnams (n=10-12 grupėje). B, Kontekstinis užšalimas buvo žymiai didesnis NIC-grandsire ir SAL, palyginti su SAL-grandsire plus SAL kontrolinėmis grupėmis (n=9-11 grupėje). Klaidų juostos rodo standartinę vidurkio paklaidą (SEM), *P <>
Norint nustatyti, ar sutrikęs kontekstinės baimės kondicionavimas tęsėsi ir kitos kartos (F2), NIC senelių ir SAL senelių F2 pelių patinai ir patelės buvo išvestos iš naivių F1 pelių patinų. Išsami pradinio, prieš CS ir CS užšalimo analizė įtraukta į pagalbinę informaciją. Buvo atlikta 3 krypčių kontekstinio užšalimo ANOVA, kai buvo nepriklausomi veiksniai, ūminis gydymas vaistais ir seksas (1B pav.). Kadangi nebuvo reikšmingos sąveikos tarp lyties ir tėvo ar ūminio gydymo vaistais, buvo atlikta dviejų krypčių ANOVA žlugimas tarp lyties. Buvo nustatytas reikšmingas pagrindinis tėvo poveikis (F(1,37)=9.88, P < .01),="" o="" post="" hoc="" palyginimai="" parodė,="" kad="" nic="" senelių="" pelėms="" pasireiškė="" sustiprintas="" kontekstinis="" baimės="" sąlygojimas,="" palyginti="" su="" su="" sal-grandsire="" pelėmis="" (t39="3,04," p="">< 0,01).="" be="" to,="" sal-grandsire="" pelėms,="" kurioms="" buvo="" skiriamas="" ūmus="" nic,="" pagerėjo="" kontekstinė="" baimės="" sąlyga="" (t19="2.41," p="0.026)," tačiau="" ūminis="" nic="" nepadidino="" kontekstinės="" baimės="" sąlygojimo="" nic-grandsire="">
2 PAVEIKSLAS Tėvo nikotinas pagerina baimės jausmą ir spontanišką baimės atminties atsigavimą. Norint ištirti galimus lubų efektus atliekant bandomuosius bandymus, atskira F1 pelių grupė buvo treniruojama identiškai su tik viena CS-US pora. NIC-Sired pelėms, palyginti su SAL-Sired pelėmis, treniruotomis su 1 CS-US poravimu (n=8-10 grupėje), buvo sustiprintas ir kontekstinis, ir užuominos baimės kondicionavimas. B, Tėvo nikotino ekspozicija neturėjo įtakos kontekstinės baimės išnykimui, bet sustiprino spontanišką baimės atminties atsigavimą praėjus 7 dienoms po paskutinio išnykimo seanso (n=8–10 grupėje). Klaidų juostos rodo standartinę vidurkio paklaidą (SEM), *P <>
3.2 Tėvo nikotinas sustiprina F1 kartos pelių sukeliamą baimę
Norint ištirti, ar lubų efektas neleidžia aptikti grupių skirtumų, susijusių su baimės sąlygojimu (žr. Pagalbinę informaciją), atskira F1 pelių grupė buvo apmokyta su viena CS-US pora. Šioje grupėje NIC-Sired pelėms (t6=2.41, P < 0,05)="" buvo="" nustatytas="" kontekstinės="" baimės="" kondicionavimo="" (t7="3.21," p="">< 0,05)="" ir="" užuominos="" baimės="" kondicionavimo="" stiprinimas.="" 05;="" 2a="">
3.3 Tėvo nikotinas pagerina spontanišką kontekstinės baimės atminties atsigavimą F1 kartos pelėms
F1 pelių grupė, kuri gavo vieną CS-US poravimą, vėliau buvo išbandyta, ar ji išnyko ir spontaniškai atsigauna kontekstinės baimės atmintis. F1 NIC-Sired pelėms pasireiškė normalus baimės išnykimas, tačiau spontaniškai atsigavo kontekstinė baimės atmintis, palyginti su SAL-Sired pelėmis (t7=3.38, P < 0.05;="" 2b="">
3.4 Tėvo nikotinas sumažina nikotino savarankišką vartojimą
Prieš pradedant savarankiško nikotino vartojimo mokymą, tiriamųjų buvo analizuojamas jų gebėjimas išmokti operatyvinę užduotį, kad gautų atlygį už maistą, ir jokių skirtumų nepastebėta (pagalba, S5 pav.). Norint patikrinti galimą nikotino poveikio tėvo poveikį nikotino sustiprėjimui F1 palikuonims, nikotino įvedimas į veną (0,03 mg/kg per infuziją) buvo įvertintas dvipusio mišraus dizaino ANOVA, kuris nustatė. pagrindinis seanso efektas (F(7,119)=13.60, P < .001)="" ir="" seansas="" ×="" gydymo="" sąveika="" (f(7,119)="5,00," p="">< .001).="" tačiau="" post="" hoc="" testai="" neatskleidė="" jokių="" statistiškai="" reikšmingų="" skirtumų="" tarp="" grupių="" kiekvienoje="" iš="" aštuonių="" gavimo="" seansų="" (3a="" pav.).="" tada="" buvo="" analizuojamas="" aktyvių="" ir="" neaktyvių="" svirties="" paspaudimų="" skaičius,="" siekiant="" nustatyti,="" ar="" grupės="" išlaikė="" aktyvios="" svirties="" pirmenybę="" per="" visą="" seansą="" gavimo="" metu="" (3b="" pav.),="" o="" tai="" nustatė="" pagrindinį="" seanso="" poveikį="" (f(7="" 238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" ir="" seansas="" ×="" gydymo="" sąveika="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc="" analizė="" atskleidė,="" kad="" pirmąją="" nikotino="" savarankiško="" vartojimo="" dieną="" grupės="" skyrėsi.="" nic-sired="" grupė="" pasižymėjo="" aktyvesniu="" svirties="" paspaudimu,="" palyginti="" su="" sal-sired="" grupe.="" šis="" poveikis="" gali="" reikšti="" didesnį="" narkotikų="" ieškojimo="" elgesį="" pirmąją="" poveikio="" dieną,="" atkaklumą="" atsakant="" už="" atlygį="" už="" maistą="" ir="" (arba)="" sumažėjusį="" pažinimo="" lankstumą="" pereinant="" nuo="" maisto="" prie="" narkotikų.="" tačiau="" šis="" skirtumas="" neišliko="" per="" tolesnius="" seansus.="" sal-sired="" pelėms="" buvo="" nuosekliai="" statistiškai="" reikšminga="" pirmenybė="" aktyviajai="" svirties,="" palyginti="" su="" jų="" neaktyvia="" svirtimi="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" tačiau="" nic-sired="" pelėms="" šios="" pirmenybės="" nepasižymėjo="" nuo="" 3="" iki="" 8="">
3 PAVEIKSLAS Tėvo nikotinas sumažina nikotino savarankišką vartojimą. NIC ir SAL-Sired pelių patinai (n=9-10 grupėje) nesiskyrė pagal bendrą infuzijų skaičių, uždirbtą per kiekvieną seansą per gavimo laikotarpį 0 .03 mg/kg/infuzijos dozė. B, Įsigijimo metu aktyvių ir neaktyvių svirties paspaudimų skaičius per pirmąjį seansą labai skyrėsi, o NIC-Sired pelių nikotino aktyvių svirties paspaudimų skaičius buvo didesnis, palyginti su SAL-Sired pelėmis. Tačiau per vėlesnius seansus NIC-Sired pelių atsakas sumažėjo, todėl nebuvo reikšmingų skirtumų tarp jų aktyvaus ir neaktyvaus svirties paspaudimų skaičiaus per 3–8 seansus. Priešingai, SAL-Sired gyvūnai teikė pastovų statistiškai reikšmingą pirmenybę aktyviajai svirties. virš jų neaktyvios svirties. C, Vidutinis nikotino infuzijų skaičius per tris paskutinius gavimo seansus NIC ir SAL-Sired pelėms reikšmingai nesiskyrė. D, Vartodamos vidutinę 0,1 mg/kg/infuzijos dozę, NIC-Sired pelės pačios suleido žymiai mažiau nikotino infuzijų. E, Potraukio inkubacijos įvertinimas atskleidė reikšmingą atsaką į anksčiau aktyvią svirtį po 21 dienos abstinencijos tik SAL-Sired pelėms. Klaidų juostos rodo standartinę vidurkio paklaidą (SEM), *P <>
Norint toliau tirti galimus grupių skirtumus, kontroliuojant kintamumą pradiniame įsigijimo etape, buvo tiriamas vidutinis nikotino infuzijų skaičius per paskutinius tris seansus, kai tiriamieji rodė nuoseklesnius atsakus į nikotiną (3C pav.). Grupės reikšmingai nesiskyrė pagal vidutinį nikotino infuzijų skaičių (P > .05). Po to pelėms buvo pritaikyta 0,1 mg/kg per infuzinė nikotino dozė, kuri anksčiau buvo geriausia suaugusioms C57BL6/J pelėms.44 Vartojant šią dozę, NIC-Sired pelėms buvo leista mažiau infuzijų (t{ {7}}.20, P < .05;="" 3d="" pav.).="" siekiant="" inkubuoti="" potraukį,="" kuris="" laikomas="" padidėjusio="" narkotikų="" vartojimo="" abstinencijos="" metu="" matu,="" dvipusio="" mišraus="" dizaino="" anova="" su="" seansu="" ir="" gydymu="" tėvu="" nustatė="" pagrindinį="" seanso="" poveikį="" (f(1,17)="" {{16}="" },90,="" p="">< .001).="" nors="" sal-sired="" gyvūnai="" pasižymėjo="" inkubaciniu="" efektu="" ir="" didesniu="" atsaku="" 21="" abstinencijos="" dieną,="" palyginti="" su="" 1="" diena,="" nic-sired="" pelėms="" nepadidėjo="" nikotino="" ieškojimo="" elgesys="" (p=""><>
3.5 Tėvo nikotino poveikis keičia hipokampo cholinerginį jungimąsi ir funkciją
Didelio afiniteto hipokampo heteromerinis nAChR surišimas buvo padidintas NIC-Sired F1 pelėms (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0.044).="" vienas="" tiriamasis="" (nic-sired)="" buvo="" pašalintas,="" nes="" surišimo="" vertės="" buvo="" du="" standartiniai="" nuokrypiai="" virš="">
Kalio ir nikotino sukeltų ACh srovių amperometriniai įrašai buvo įvertinti F1 dHPC ir vHPC. Dėl nevienodo lyties imties dydžio lytis nebuvo įtraukta kaip preliminarus veiksnys į šias analizes. KCl depoliarizacijos sukelti cholinerginiai signalai nesiskyrė tarp SAL- ir NIC-Sired pelių dHPC (P > 0,05; 4A pav.); tačiau vietinis nikotino naudojimas žymiai sumažino cholinerginio signalo amplitudę NIC-Sired pelėms (t8=2.33, P < .05;="" 4c="" pav.).="" esant="" vhpc,="" ach="" išsiskyrimas="" sumažėjo="" nic-sired="" pelėms="" po="" kcl="" (t8="2.60," p="">< 0,05;="" 4b="" pav.)="" arba="" nikotino="" (t8="2.98," p="">< .05).="" 4d="">
4 PAVEIKSLAS Tėvo nikotinas sumažina cholinerginį signalą hipokampe. DHPC populiacijos cholino signalai, kuriuos sukelia KCl sukelta galinė depoliarizacija. Nebuvo aptikta jokių reikšmingų skirtumų tarp NIC ir SAL-Sired gyvūnų (n=5 grupėje). B, vHPC populiacijos cholino signalai, kuriuos sukelia KCl sukelta galinė depoliarizacija, buvo sumažinti NIC-Sired pelėse. C, Nikotino sukeltos populiacijos dHPC cholino signalai sumažėjo NIC-Sired pelėms. D, nikotino sukeltos populiacijos vHPC cholino signalai sumažėjo NIC-Sired pelėse. Sekso poveikio cholinerginiams signalams nepastebėta. Klaidų juostos rodo standartinę vidurkio paklaidą (SEM), *P <>
3.6 Tėvo nikotino poveikis skirtingai keičia nugaros ir ventralinio hipokampo geno ekspresiją
F1 hipokampo transkripto analizė naudojant RNR seką atskleidė 952 skirtingai išreikštus genus vHPC (FDR=0.05; S2 lentelė). Iš šių genų 612 buvo sumažintas ir 340 buvo padidintas NIC-Sired pelėse. Naudojant dHPC, tik 162 genai buvo skirtingai išreikšti NIC-Sired pelėse, palyginti su SAL-Sired pelėmis (FDR=0.05). Iš šių 162 genų 86 buvo sumažintas, o 76 – padidintas. Šimtas trys genai su pakitusia genų ekspresija sutapo tarp vHPC ir dHPC.
3.7 Tėvo nikotino poveikis keičia transkripcijos būdus, susijusius su nervų sistemos vystymusi
Vykdant vHPC, IPA analizė nustatė didžiausią tinklą „Neurologinės ligos, organų pažeidimai ir anomalijos, ląstelių mirtis ir išgyvenimas“ (balas=41, S3 lentelė) ir antrąjį tinklą „Nervų sistemos vystymasis ir funkcijos, audinių morfologija, neurologiniai Liga“ (balas=23). Penkios geriausios molekulinių ir ląstelių funkcijų kategorijos buvo šios: „Ląstelių morfologija“ (88 molekulės), „Ląstelių surinkimas ir organizacija“ (79 molekulės), „Ląstelių vystymasis“ (96 molekulės), „Ląstelių funkcijos ir priežiūra“ (79 molekulės), ir „Ląstelių augimas ir dauginimasis“ (87 molekulės). Populiariausios fiziologinės sistemos raidos ir funkcijos buvo „Nervų sistemos vystymasis ir funkcijos“ (175 molekulės), o kai kurios iš svarbiausių ligų ir sutrikimų funkcijų yra „Neurologinė liga“ (antra, 191 molekulė) ir „Psichologiniai sutrikimai“ (ketvirta, 90 molekulių). ) (S4 lentelė).
Be IPA rezultatų, sodrinimo analizė naudojant Enrichr pateikė papildomų įrodymų apie ląstelių augimo ir vystymosi pokyčius vHPC, naudojant geriausius GO biologinius terminus, įskaitant „RNR susiliejimą“, „reakciją į išsiskleidusį baltymą“, „ląstelių augimo reguliavimą“ ir „ baltymų stabilizavimas“ (S5 lentelė). Atitinkamai „spliceosominis kompleksas“ buvo nustatytas kaip geriausias GO ląstelių terminas. KEGG kelio analizė naudojant Enrichr taip pat nurodė, kad spliceosomų veikimas ir MAPK signalizacija yra potencialiai paveikti būdai.
Nepaisant žymiai trumpesnio skirtingai išreikštų genų sąrašo dHPC, palyginti su vHPC, buvo nustatyti panašūs dHPC praturtinti keliai ir terminai (S3 ir S4 lentelės). IPA analizė nustatė didžiausią tinklą „Elgesys, neurologinės ligos, organų sužalojimai ir anomalijos“ (balas=24) ir antrasis populiariausias tinklas „Neurologinės ligos, organų pažeidimai ir anomalijos bei psichologiniai sutrikimai (balas=20). .
Penkios geriausios dHPC molekulinių ir ląstelių funkcijų kategorijos buvo "ląstelių vystymasis" (29 molekulės), "ląstelių augimas ir dauginimasis" (29 molekulės), "ląstelių morfologija" (27 molekulės), "ląstelių surinkimas ir organizacija" (23 molekulės). , ir „Ląstelių funkcija ir priežiūra“ (25 molekulės). „Nervų sistemos vystymasis ir funkcijos“ vėl buvo identifikuotas kaip labiausiai praturtintas terminas pagal fiziologinės sistemos vystymosi ir funkcijų klasifikaciją (antra, 44 molekulės). Labiausiai praturtinti terminai pagal ligų ir sutrikimų funkcijų klasifikaciją apėmė neurologinę ligą (1-a, 51 molekulė) ir "psichologinius sutrikimus" (penktoji, 31 molekulė). Sodrinimo analizė naudojant Enrichr nustatė kelis skirtingus GO biologinius dHPC terminus, palyginti su vHPC, įskaitant "neuronų mirties reguliavimą" ir "smegenų vystymąsi" (S5 lentelė), kurie papildo IPA molekulinę ir ląstelių funkciją "Ląstelių mirtis ir išgyvenimas".
Siekiant toliau ištirti skirtingai išreikštų transkriptų, persidengiančių tarp dHPC ir vHPC, funkcinį vaidmenį, buvo įvertinti skirtingai išreikšti genai, bendri abiem regionams (iš viso 103). Sutampantys skirtingai išreikšti transkriptai tarp dviejų regionų buvo sureguliuoti arba padidinti ta pačia kryptimi, o tai rodo bendrus transkripcijos takų pokyčius NIC turinčių pelių smegenų regionuose. Penkios pagrindinės IPA nustatytos molekulinių ir ląstelių funkcijų kategorijos buvo „ląstelių mirtis ir išgyvenimas“ (17 molekulių), „ląstelių judėjimas“ (10 molekulių), „ląstelių signalai ir sąveika“ (17 molekulių), „ląstelių augimas“. and Proliferation“ (18 molekulių) ir „Ląstelių morfologija“ (17 molekulių) (S4 lentelė)
Skirtingai išreikšti genai, būdingi tik dHPC ir vHPC, vėliau buvo analizuojami atskirai IPA, siekiant patikrinti, ar nėra skirtingų neurobiologinių adaptacijų tarp dviejų regionų (S6 lentelė). Jokie praturtinti kanoniniai būdai nesutampa tarp unikalių vHPC unikalių dHPC analizių. Populiariausi patobulinti kanoniniai būdai, unikalūs vHPC (iš viso 44), apėmė „kalcio signalizaciją“ ir „gliukokortikoidų receptorių signalizaciją“, o geriausi dHPC kanoniniai keliai (iš viso aštuoni) – „skydliaukės hormonų metabolizmas“ ir „retinoinės rūgšties tarpininkaujamas apoptozės signalas“. Į unikalias vHPC ligas ir funkcijas (iš viso 295) buvo įtraukta „[hipokampo] Amono rago susidarymas“ ir „ląstelinių išsikišimų kiekis“, o unikaliai dHPC praturtintų ligų ir funkcijų terminai (iš viso 111) apima „baltosios medžiagos uždegimą“ ir „demielinizaciją“. “.
3.8 Tėvo nikotino poveikis keičia hipokampo DNR metilinimą
Buvo atlikta tikslinė DNR metilinimo analizė, siekiant nustatyti, ar pakitęs DNR metilinimas atitinkamuose reguliavimo regionuose lėmė skirtingą genų ekspresiją NIC-Sired F1 palikuoniuose. Taikiniai apėmė 1114 skirtingai išreikštų genų, nustatytų dHPC arba vHPC. vHPC buvo aptikta 11 skirtingai metilintų regionų (DMR), iš kurių aštuoniuose buvo padidėjęs metilinimas, o trijuose - sumažėjęs metilinimas (1 lentelė). Iš 11 DMR 10 buvo regionuose, susietuose su genu, kurio vHPC ekspresija pasikeitė. dHPC buvo aptikta 30 DMR, iš kurių 15 parodė padidėjusį metilinimą ir 15 - sumažėjusį metilinimą. Iš 30 DMR 29 buvo regionuose, susietuose su genu, kurio dHPC ekspresija pasikeitė.
Benascistanche echinakozido veiksmingumas
4. DISKUSIJA
Padidėjęs epigenetinių procesų supratimas kartu su naujausiais duomenimis, įskaitant dabartines išvadas, metė iššūkį tradiciniam paveldėjimo supratimui. Vien tik genotipą papildantys veiksniai gali nulemti fenotipus kitose kartose, o vienos kartos ekspozicija negali būti atskirta nuo palikuonių. Šis tyrimas rodo, kad žalingas nikotino poveikio sveikatai poveikis gali viršyti individualų poveikį ir turėti įtakos vėlesnėms kartoms. Mes nustatėme C57BL / 6J pelių C57BL / 6J pelėms būdingo daugialypį ir transgeneracinį poveikį Pavlovo baimės sąlygoms, todėl F1 ir F2 palikuonių baimės prisiminimai yra stipresni. Tėvų nikotino ekspozicija taip pat sumažino nikotino savarankišką vartojimą ir susilpnino su atkryčiais susijusį elgesį, o tai rodo, kad nikotinas buvo labiau aversinis. Siekiant paremti šiuos elgesio skirtumus, buvo pastebėti kelių kartų hipokampo cholinerginės funkcijos ir epigenetinių procesų pokyčiai. Kartu šie rezultatai rodo nikotino paveiktų pelių palikuonių nervų sistemos funkcijos pokyčius, dėl kurių pasikeičia elgesio fenotipai.
Pelių patinų, paveiktų nikotino, F1 ir F2 palikuonys pasižymėjo patobulintu kontekstu ir jaučiamą baimę. Nepaisant kontekstinio baimės išnykimo skirtumų tarp NIC- ir SAL-Sired F1 pelių, NIC-Sired pelėms pasireiškė geresnis spontaniškas kontekstinės baimės prisiminimų atsigavimas. Svarbu tai, kad NIC ir SAL-Sired pelių jautrumo smūgiams skirtumų, kurie galėtų lemti padidėjusią baimės sąlygą, nenustatyta. Sustiprintas baimės sąlygojimas gali reikšti bendrą mokymosi procesų tobulinimą, o ne procesų, labiau būdingų baimei mokytis, moduliavimą. Tačiau NIC-Sired pelių naujų objektų atpažinimo, operantinio maisto mokymo ar judėjimo atvirame lauke pokyčių nepastebėta, nors buvo nustatytas lyčiai būdingas padidėjusio EPM atviros rankos laiko poveikis NIC-Sired pelių patelėms. Nors tai neatmeta galimų kitų mokymosi sistemų ar pažinimo procesų modifikacijų, šios išvados kartu rodo, kad baimės mokymasis gali būti jautresnis daugialypiam ir transgeneraciniam tėvo nikotino poveikio poveikiui. Be to, šie radiniai rodo, kad NIC-Sired gyvūnų cholinerginė funkcija pasikeitė. Nikotinas moduliuoja kontekstinę baimę. Kadangi ūmus nikotinas sustiprina kontekstinę baimę, 15,45 lėtinio nikotino vartojimo nutraukimas sutrikdo kontekstinę baimės sąlygą.16,21 Šiame tyrime ūminis nikotinas sustiprino F1 ir F2 pelių kontekstinę baimę iš fiziologiniu tirpalu gydytų pelių. Priešingai, ūmus nikotinas sutrikdė kontekstinę baimę NIC-Sired pelėms ir neturėjo jokio poveikio NIC-grandsire pelėms, o tai gali reikšti pakitusį cholinerginį funkcionavimą hipokampe.
Tėvo nikotino poveikio įtaka vėlesniam nikotino skyrimui F1 kartoje taip pat rodo, kad sutrikusi cholinerginė funkcija. Įsigijus nikotino savaiminio švirkštimo į veną mažesne doze, grupėse nesiskyrė nikotino infuzijų skaičius, nors NIC-Sired grupėje buvo nustatytas aktyvių svirties paspaudimų skaičiaus padidėjimas. Tai rodo, kad NIC-Sired pelės galėjo pasižymėti atkaklumu reaguodamos už atlygį už maistą ir (arba) sumažėjusį pažintinį lankstumą pereinant nuo maisto prie vaistų. Tačiau taip pat verta pažymėti, kad grupės nesiskyrė 1-ąją potraukio inkubacijos dieną, o tai reiškia išnykimo seansą (pvz., seanso metu nebuvo infuzuojama nikotino), todėl atrodo, kad šis poveikis buvo, kai buvo naudojami stiprintuvai. perjungiamas, bet ne, kai gesinimo seanso metu nėra stiprintuvo. NIC-Sired pelėms taip pat buvo sumažėjęs nikotino vartojimas, vartojant vidutinę dozę, o tai atitinka naujausią darbą, nustatantį alkoholio, kokaino ir opioidų vartojimo sumažėjimą, susijusį su tėvų alkoholio, kokaino ir morfino poveikiu (pvz., Vassoler ir kt.,46 apžvelgta Goldberg ir Gould47). Pastebėtas nikotino savarankiško vartojimo sumažėjimas gali būti siejamas su sumažėjusiu jautrumu maloniam nikotino poveikiui ir (arba) padidėjusiu jautrumu neigiamam nikotino poveikiui. Iš tiesų, grupės skyrėsi vartodamos vidutinę nikotino dozę, bet ne mažesnę nikotino dozę, o tai patvirtina padidėjusį aversinį atsaką vartojant didesnę dozę. Įdomu tai, kad 21 dieną NIC-Sired pelėms po to, kai jos buvo sušvirkštos vidutine doze, potraukis nejaučiamas, o tai rodo, kad sumažėjęs nikotino ieškojimo elgesys gali būti susijęs su su pasibaisėjimu susijusia atmintimi nikotinui. Nors įvairūs nerviniai substratai gali lemti šį poveikį nikotino suvartojimui ir su atkryčiais susijusiam atsakui, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad sumažėjęs DNR metiltransferazės kiekis hipokampo CA1 srityje sumažino morfino įsisavinimą.48 Šis atradimas kartu su žinoma cholinerginės hipokampo funkcijos funkcija mokymosi ir atminties procesus, toliau palaiko nikotino sukelto apdorojimo sutrikimo idėją NIC-Sired pelių hipokampe.
Be to, NIC-Sired pelėms pasireiškė padidėjęs hipokampo didelio afiniteto nAChR surišimas. Mes taip pat nustatėme, kad sumažėjo kalio sukeltas ACh išsiskyrimas naudojant vHPC, taip pat nikotino sukeltas ACh išsiskyrimas tiek dHPC, tiek vHPC NIC-Sired gyvūnų. Depoliarizacijos sukelto ACh išsiskyrimo pokyčiai atspindi pakitusią cholinerginę funkciją po receptorių surišimo, o nikotino sukelto ACh išsiskyrimo pokyčiai atspindi pakitusią nAChR funkciją. Šie duomenys atitinka ankstesnius duomenis apie padidinto didelio afiniteto nAChR jungimosi reguliavimą po sumažėjusios nAChR funkcijos.49 Kadangi ir kalio sukeltas, ir nikotino sukeltas ACh išsiskyrimas buvo pakitęs NIC-Sired pelių vHPC, vHPC gali būti jautresnis tėvo nikotino poveikio kelių kartų kartoms. Yra žinoma, kad DHPC moduliuoja kontekstinės baimės sąlygojimą.31,50 vHPC slopinimas sutrikdo ir įspėjamą, ir kontekstinę baimės būseną,51,52 ir vHPC cholinerginiai pažeidimai pablogina baimės sąlygojimą.
Žolelių cistanche
Taip pat parodėme, kad tiesioginė nikotino infuzija į dHPC sustiprina kontekstinės baimės kondicionavimą, o infuzija į vHPC sutrikdo kontekstinės baimės sąlygotumą.15 vHPC taip pat gali moduliuoti spontanišką kontekstinės baimės prisiminimų atsigavimą, nes vHPC-prelimbinės grandinės inaktyvavimas sumažina spontanišką kontekstinės baimės prisiminimų atsigavimą. 54 Nors tėvo nikotino poveikis gali turėti įtakos ir kitiems smegenų regionams, susijusiems su baimės formavimu, pavyzdžiui, migdolai55, šie duomenys kartu su dabartiniais duomenimis rodo, kad vHPC funkcijos pokyčiai gali būti atsakingi už pakitusią baimės sąlygą NIC-Sired pelėms. . Iškėlėme hipotezę, kad daugelio kartų tėvo nikotino poveikio poveikis gali būti susijęs su transkripcijos efektorių, veikiančių prieš šias nervų sistemas, pokyčiais. Viso genomo transkripcijos seka F1 kartos pelių vHPC ir dHPC nustatė 1114 skirtingai išreikštų genų tarp NIC ir SAL-Sired pelių. Šis skirtumas buvo didesnis vHPC (952), palyginti su dHPC (162), atsižvelgiant į didesnį vHPC pokytį, palyginti su dHPC cholinergine funkcija, ir kontekstinio bei nulemtos baimės sąlygojimo pokyčius. Vėlesnė kelio analizė parodė didelius transkripcijos takų pokyčius, susijusius su gliukokortikoidų signalizavimu ir nervų vystymusi / plastiškumu abiejuose hipokampo regionuose.
Siekiant nustatyti galimus vHPC pritaikymus, kelio analizė buvo atlikta naudojant tik nuorašus, būdingus bet kuriam hipokampo subregionui. Jokie praturtinti IPA kanoniniai keliai nesutapdavo tarp vHPC ir dHPC, kurie yra funkciškai skirtingi hipokampo subregionai.31 Pašalinus genus, kurie sutapo tarp dHPC ir vHPC, labiausiai praturtinti kanoniniai keliai, unikalūs vHPC, apėmė „unikalią gliukokortikoidų receptorių signalizaciją“, o tai rodo. , papildomas gliukokortikoidų veikimo pasikeitimas šiame regione, palyginti su dHPC. Siekdami nustatyti prieš srovę esančius epigenetinius reguliatorius, galinčius veikti genų ekspresiją, atlikome tikslinę DNR metilinimo seką, naudodami sudarytą dHPC ir vHPC skirtingai ekspresuotų genų, identifikuotų iš RNR sekos, sąrašą. Keista, bet tarp NIC ir SAL-Sired gyvūnų radome tik 11 DMR vHPC ir 30 DMR dHPC. Nors tai netikėta, turint omenyje daug didesnį skirtingai išreikštų transkriptų skaičių vHPC, DNR metilinimas yra tik vienas iš kelių reguliavimo veiksnių, galinčių turėti įtakos genų ekspresijai, o DNR metilinimas nenuosekliai virsta pakitusia genų ekspresija.56 Iš 11 vHPC DMR septynios. pasižymėjo metilinimo modeliais, atitinkančiais diferencinės transkripcijos kryptį (sumažėjusi transkripcija padidėjus DNR metilinimui ir padidėjusi transkripcija su sumažėjusiu metilinimu). Skirtingai metilinti genai vHPC apėmė Fkbp5, Ksr1 ir Pnpla2. Įdomu tai, kad Fkbp5 ir Ksr1 transkripcija buvo sutrikdyta viename PTSD elgsenos pelės modelyje57, kur pelės buvo paveiktos elektriniu smūgiu, o po to buvo pateikti situacijos priminimai. Fkbp5 koduoja gliukokortikoidų receptorių chaperoną, kurio veikimas buvo susijęs su netinkamu ilgalaikiu streso atsaku asmenims, sergantiems PTSD ir kitais nerimo sutrikimais.
Tiksliau, tyrimai su žmonėmis rodo, kad Fkbp5 metilinimas ir transkripcija koreliuoja su PTSD simptomų sunkumu, todėl padidėjęs metilinimas ir sumažėjusi transkripcija prognozuoja sunkesnius PTSD simptomus.59,60 Fkbp5 ekspresija moduliuoja HPA ašies funkcionavimą, o tai, kaip manoma, tarpininkauja jos dalyvavimui PTSD.59,61 Mūsų išvados, kad pagerėjo spontaniškas baimės atminties atsigavimas kartu su transkripcijos takų, susijusių su gliukokortikoidų signalizavimu, NIC-Sired gyvūnuose, gali rodyti padidėjusį pažeidžiamumą į PTSD panašiems fenotipams. Naudojant dHPC, DMR modeliai iš esmės neatitiko diferencinės transkripto ekspresijos krypties, nustatytos atliekant RNR seką, o tai rodo, kad vHPC DNR metilinimo pokyčiai, atsirandantys dėl tėvo nikotino poveikio, turi daugiau įtakos genų ekspresijai nei dHPC. Tai atitinka mūsų identifikuotą didesnį skirtingai išreikštų transkriptų skaičių ir perdėtus cholinerginio perdavimo pokyčius NIC-Sired vHPC, palyginti su dHPC. Mūsų tikslinis sekos nustatymo metodas galėjo apriboti galimybę aptikti galimą transkripcijos reguliavimą distaliai metilintomis sekomis. Būsimi tyrimai, įskaitant viso genomo DNR metilinimo, histonų modifikacijų ir mažos RNR ekspresijos analizę, suteiks išsamesnį šių išvadų aiškinimą.
Galimas mūsų nikotino poveikio plano apribojimas yra dėmesys tėvo nikotino poveikiui, siekiant ištirti nikotino poveikio daugialypį ir transgeneracinį poveikį. Nors kituose tyrimuose, kuriuose nustatyta, kad po tėvo poveikio narkotikams, įskaitant kokainą46 ir morfiną, buvo kelių arba transgeneraciniai fenotipai, motinos priežiūros skirtumų nenustatyta, gali būti, kad tėvo nikotino poveikis gali turėti įtakos motinos priežiūrai. Būsimi tyrimai, tiriantys poveikį motinos priežiūrai, yra pagrįsti. Kadangi šiuo metu daugiausia dėmesio skyrėme tėvo poveikiui, būsimame darbe taip pat reikėtų palyginti tėvo ir motinos poveikio poveikį. Apskritai, šios išvados suteikia naują supratimą apie nikotino poveikio kelioms kartoms ir kartoms skirtą poveikį, kurį patvirtina vis gausėjanti literatūra, apibūdinanti kelių kartų ir kartoms skirtą narkotikų poveikio poveikį (kaip apžvelgta Goldberg ir Gould47). Šis tyrimas buvo pirmasis, kuriame buvo išbandytas kontekstinis baimės sąlygojimas nikotino paveiktų patinų F1 ir F2 palikuonims ir nustatytas stipresnis baimės atminties formavimasis ir spontaniškas baimės prisiminimų atsigavimas. Šis tyrimas taip pat buvo pirmasis, kuriame nustatytas pakitęs nikotino savarankiškas vartojimas ir potraukio inkubacija F1 nikotino paveiktiems palikuonims.
NIC-Sired pelėms buvo nustatytas diferencinis metilinimas genuose, susijusiuose su PTSD ir HPA ašies disreguliacija, taip pat tuo pačiu metu su stresu susijusių transkripcijos takų sutrikimai. Tėvo nikotinas taip pat buvo susijęs su sumažėjusia hipokampo cholinergine funkcija ir padidėjusiu hipokampo nAChR surišimu. Įdomu tai, kad PTSD pacientai, kurie nerūko, rodo žymiai didesnį meziotemporalinį žievės didelio afiniteto nAChR surišimą63, o PTSD yra susijęs su didesne baimės sąlyga ir spontanišku užgesusių baimės prisiminimų atsigavimu.64 Mūsų išvados rodo, kad nikotino poveikis gali turėti įtakos kelioms kartoms. didėjantis palikuonių jautrumas į PTSD panašiems simptomams. Šis atradimas kartu su kitais naujausiais atradimais, rodančiais kelių kartų nikotino poveikį pažinimo lankstumui2, rodo, kad neigiami nikotino poveikio padariniai sveikatai yra platesni, nei manyta anksčiau.
Cistanche ekstraktas
NUORODOS
1 Dai J, Wang Z, Xu W ir kt. Tėvo nikotino ekspozicija apibrėžia skirtingą elgesį tolesnėje kartoje dėl mmu-miR-15b hipermetilinimo. Sci Rep. 2017;7(1):7286.
2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE ir kt. Nikotino poveikis pelių patinams sukelia kelių palikuonių kartų elgesio sutrikimus. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.
3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Hiperaktyvumo perdavimas kartoms naudojant ADHD pelės modelį. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.
4. Cummings KM, Proctor RN. Kintantis rūkymo įvaizdis JAV: 1964–2014 m. Cancer Epidemiol Biomarkers Ankst. 2014;23(1):32-36.
5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Elektroninių cigarečių vartojimas tarp vidurinių mokyklų moksleivių ir jo ryšys su cigarečių vartojimu ir metimu rūkyti, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 ir 2013. Ankstesnis Chronic Dis. 2016;13:E103.
6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG ir kt. Ilgalaikis lėtinio nikotino poveikis emociniam ir pažintiniam elgesiui bei pelių hipokampo ląstelių morfologijai: suaugusiųjų ir paauglių nikotino ekspozicijos palyginimas. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.
7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Ryšys tarp cigarečių rūkymo ir nerimo sutrikimų paauglystėje ir ankstyvoje pilnametystėje. JAMA. 2000;284:2348-2351.
8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM ir kt. Epigenetinis mechanizmas tarpininkauja vystymosi nikotino poveikiui neuronų struktūrai ir elgesiui. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.
9. Gitik M, Holliday ED, Leung M ir kt. Cholinas pagerina suaugusiųjų mokymosi trūkumus ir panaikina chromatino remodeliavimo veiksnių, susijusių su paauglių nikotino poveikiu, epigenetinę modifikaciją. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239-248.
10. Paukštis A. Epigenetikos suvokimas. Gamta. 2007;447:396-398.
11. Skinner MK. Aplinkos epigenetinis transgeneracinis paveldėjimas ir somatinis epigenetinis mitozinis stabilumas. Epigenetika. 2011; 6:838-842.
12. Davis JA, Gould TJ. Asociatyvus mokymasis, hipokampas ir priklausomybė nuo nikotino. Curr Drug Abuse Rev. 2008; 1:9-19.
13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikotino priklausomybė ir psichikos sutrikimai. Int Rev Neurobiol. 2015; 124:171-208.
14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. nAChR disfunkcija kaip įprastas šizofrenijos ir gretutinės priklausomybės nuo nikotino substratas: dabartinės tendencijos ir perspektyvos. Schizophr Res. 2016; 171:1–15.
15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotino receptoriai nugaros ir ventraliniame hipokampe skirtingai moduliuoja kontekstinės baimės sąlygojimą. Hipokampas. 2012; 22:1681-1690.
16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetinis fonas įtakoja abstinencijos nuo lėtinio nikotino poveikį mokymuisi ir didelio afiniteto nikotino acetilcholino receptorių jungimuisi nugaros ir ventraliniame hipokampe. Psichofarmakologija (Berlis). 2013; 225 (1): 201–208.
17. Davis JA, Gould TJ. DHBE ir MLA poveikis nikotino sukeltam kontekstinės baimės sąlygojimui C57BL/6 pelėse. Psichofarmakologija (Berlis). 2006; 184:345-352.
18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Iki paauglystės ir paauglystės pelės yra mažiau jautrios ūminiam nikotino poveikiui išnykimui ir spontaniškam pasveikimui. Brain Res Bull. 2018;138:50-55.
19. Kutlu MG, Gould TJ. Ūmus nikotinas atitolina pelių kontekstinės baimės išnykimą. Behav Brain Res. 2014; 263:133-137.
20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikotino chemija, metabolizmas, kinetika ir biomarkeriai. In: Nikotino psichofarmakologija. Berlynas, Heidelbergas: Springeris; 2009:29-60.
21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Pasitraukimas nuo lėtinio nikotino vartojimo sumažina kontekstinę baimę C57BL / 6 pelėms. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.
22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Lyginamasis nikotino ir jo metabolitų pasiskirstymo trijose inbredinėse pelių padermėse tyrimas. Drug Metab Dispos. 1984; 12:725-731.
23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM ir kt. Su nikotino abstinencija susijusių trūkumo konteksto baimėje trukmė lygiagrečiai su hipokampo didelio afiniteto nikotino acetilcholino receptorių reguliavimo pokyčiais. Neurofarmakologija. 2012; 62: 2118-2125.
24. Kutlu MG, Oliveris C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Kontekstinės baimės išnykimas dėl lėtinio nikotino ir lėtinio nikotino atsisakymas yra susijęs su hipokampo nAChR reguliavimu. Neurofarmakologija. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Spontaniško ir nusodinto nikotino pasitraukimo iš pelės apibūdinimas. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 307:526-534.
26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenular alfa5 nikotino receptorių subvieneto signalizacija kontroliuoja nikotino suvartojimą. Gamta. 2011; 471:597-601.
27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Kiekybinė heteromerinių neuronų nikotino receptorių analizė žiurkės hipokampe. J Neurochem. 2010; 115:625-634.
28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Lygiagretus anksiolitinis poveikis ir neuronų nikotino acetilcholino receptorių reguliavimas po lėtinio nikotino ir vareniklino. Nicotine Tob Res. 2011;13:41-46.
29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontaliniai beta2 subvienetų turintys ir alfa7 nikotino acetilcholino receptoriai skirtingai kontroliuoja glutamaterginį ir cholinerginį signalizavimą. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.
30. Parikh V, Starter M. Priekinės smegenų cholinerginės sistemos ir pažinimas: naujos įžvalgos, pagrįstos greitu cholino šuolių aptikimu naudojant fermentų pagrindu veikiančius biojutiklius. In: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013: 257-277.
31. Fanselow MS, Dong HW. Ar nugaros ir ventralinis hipokampas yra funkciškai skirtingos struktūros? Neuronas. 2010;65(1):7–19.
32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: tikslus transkriptų išlygiavimas esant įterpimams, ištrynimams ir genų susiliejimui. Genome Biol. 2013;14(4): R36.
33. Afgan E, Baker D, van den Beek M ir kt. „Galaxy“ platforma prieinamai, atkuriamai ir bendradarbiaujančiai biomedicininei analizei: 2016 m. atnaujinimas. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.
34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G ir kt. Transkripto surinkimas ir kiekybinis RNA-Seq nustatymas atskleidžia nekontuotus transkriptus ir izoformų perjungimą ląstelių diferenciacijos metu. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.
35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Klaidingų atradimų dažnio valdymas elgesio genetikos tyrime. Behav Brain Res. 2001 m.; 125 (1–2): 279–284.
36. Kramer A, Green J, Pollard Jr, Tugendreich S. Priežastinės analizės metodai išradingumo kelio analizėje. Bioinformatika. 2014;30(4): 523-530.
37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD ir kt. Enrichr: išsamus genų rinkinio praturtinimo analizės žiniatinklio serverio 2016 atnaujinimas. Nucleic Acids Res. 2016 m.; 44 (W1): W90–W97.
38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Tikslinis bisulfito sekos nustatymas naudojant SeqCap epi sodrinimo sistemą. Metodai Mol Biol. 2018 m.;1708:383-405.
39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: lankstus žoliapjovė, skirta Illumina sekos duomenims. Bioinformatika. 2014;30(15):2114-2120.
40. Langmead B, Salzberg SL. Greitas skaitymo tarpų suderinimas su Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9(4):357-359.
41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: lankstus lygintuvas ir metilinimo skambutis, skirtas Bisulfite-Seq programoms. Bioinformatika. 2011;27(11):1571-1572.
42. Akalin A, Kormaksson M, Li S ir kt. methylKit: išsamus R paketas, skirtas viso genomo DNR metilinimo profilių analizei. Genome Biol. 2012;13(10): R87.
43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotinas sustiprina kontekstinę baimę ir pagerina etanolio sukeltą trūkumą kontekstinėje baimės sąlygoje. Neurosci elgesys. 2003;117(6):1276-1282.
44. Fowlerio kompaktinis diskas, Kenny PJ. Savarankiškas nikotino įvedimas į veną ir sukeltas atkūrimas pelėms: nikotino dozės poveikis, vaisto infuzijos greitis ir ankstesnis instrumentinis mokymas. Neurofarmakologija. 2011;61(4):687-698.
45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotinas sustiprina kontekstinę baimę. Behav Brain Res. 1999; 102 (1–2): 31–39.
46. Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Kokainui atsparaus fenotipo epigenetinis paveldėjimas. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.
47. Goldberg LR, Gould TJ. Daugiakartinis ir transgeneracinis tėvo poveikio narkotikais poveikis elgesiui ir nervų funkcijoms. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.
48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W ir kt. DNMT3a hipokampo CA1 yra labai svarbus norint įsisavinti morfiną žiurkėms. Addict Biol. 2019 m.;▪:▪‐▪.
49. Schwartz RD, Kellar KJ. Nikotino cholinerginių receptorių surišimo vietos smegenyse: reguliavimas in vivo. Mokslas. 1983; 220 (4593): 214-216.
50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hipokampo pažeidimai sukelia mokymosi trūkumą įgimtoms pelėms Moriso vandens labirinte ir sąlygotos baimės užduotį. Neurosci elgesys. 1997;111(1):104-113.
51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventrinis hipokampas ir baimės kondicionavimas žiurkėse: skirtingos anterogradinės baimės amnezijos po N-metil-D-aspartato arba jo nekonkurencinio antagonisto MK-801 infuzijos į ventralinį hipokampą. Behav Brain Res. 2001; 126 (1–2): 159–174.
52. Maren S, Holtas WG. Hipokampo ir Pavlovo baimės sąlygojimas žiurkėms: muscimolio infuzijos į ventralinį, bet ne nugarinį hipokampą sutrikdo sąlyginio sustingimo įgijimą iki klausos sąlyginio dirgiklio. Neurosci elgesys. 2004;118(1):97-110.
53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Vidurinės pertvaros ir Broca cholinerginių projekcijų į ventralinį hipokampą įstrižainės juostos sutrikdo klausos baimės atmintį. Neurobiol Learn Mem. 2018; 152:71-79.
54. Vasquezas JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Konkrečiam keliui būdingas ventralinių hipokampo ląstelių, išsikišusių į prelimbinę žievę, aktyvavimas sumažina baimės atsinaujinimą. Neurobiol Learn Mem. 2019; 161:63-71.
55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Šoninis migdoloidinis branduolys: migdolinio kūno jutimo sąsaja baimės sąlygomis. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.
56. Jones PA. DNR metilinimo funkcijos: salos, pradžios vietos, genų kūnai ir ne tik. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.
57. Tanaka M, Li H, Zhang X ir kt. Nuo regiono ir laiko priklausomas genų reguliavimas į PTSD panašaus pelės modelio migdolinėje ir priekinėje cingulinėje žievėje. Mol Smegenys. 2019;12(1):25.
58. Segtuvas EB. FKBP5, gliukokortikoidų receptorių bendradarbio, vaidmuo afektinių ir nerimo sutrikimų patogenezėje ir terapijoje. Psichoneuroendokrinologija. 2009;34 (1 priedas): S186-S195.
59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM ir kt. Genetiniai PTSD rizikos ir atsparumo žymenys tarp išgyvenusių Pasaulio prekybos centro išpuolius. Dis žymekliai. 2011; 30 (2–3): 101–110.
60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F ir kt. Epigenetiniai biomarkeriai kaip simptomų pagerėjimo prognozės ir koreliacijos po psichoterapijos kovos veteranams, sergantiems PTSD. Priekinė psichika. 2013; 4:118.
61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA ir kt. Genų ekspresijos modeliai, susiję su potrauminiu streso sutrikimu po Pasaulio prekybos centro išpuolių. Biol Psichiatrija. 2009; 66:708-711.
62. Li CQ, Luo YW, Bi FF ir kt. Į nerimą panašaus elgesio vystymasis per hipokampo IGF-2 signalizaciją palikuonims, patiriantiems tėvų morfino poveikį: praturtintos aplinkos poveikis. Neuropsichofarmakologija. 2014;39(12):2777-2787.
63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S ir kt. beta2 Nikotino acetilcholino receptorių prieinamumas potrauminio streso sutrikimo atveju. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.
64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB ir kt. Neurobiologinis pagrindas, kodėl nepavyksta prisiminti išnykimo atminties sergant potrauminio streso sutrikimu. Biol Psichiatrija. 2009;66(12):1075-1082.
