Kiekybinis proteominis tyrimas atskleidžia fibrinogeno kelią sergant policistine kepenų liga Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Rezultatai
3.1. Inkstai ir kepenys nesilaiko tų pačių cistinių mechanizmų
Ankstesni tyrimai parodė, kad ankstyvas Pkd1 geno inaktyvavimas (iki p12) sukelia greitą policistinės ligos vystymąsi (cistinis langas), o inaktyvacija po p14 sukelia vėlyvą cistų susidarymą po 4–5 mėnesių, o fenotipas yra lengvas (ne cistinis langas). [19]. Naudodami tą patį ortologinį ADPKD modelį (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], ištyrėme, ar šis inkstų vystymosi langas laike atitiko panašų kepenų vystymosi langą. Norint atlikti tiesioginį palyginimą su mūsų ankstesniais tyrimais [37], pelės buvo paskatintos tamoksifenu inaktyvuoti Pkd1 geną 14 (p14) ir 12 (p12) pogimdyminėmis dienomis ir nužudytos 30 dienų amžiaus (p30). Įdomu tai, kad abiejuose laiko momentuose mes stebėjome cistinį fenotipą, kai buvo skirtingas ligos laipsnis (lengvas ir sunkus), o tai rodo, kad inkstai ir kepenys turi nepriklausomus cistinio vystymosi langus (1a pav.) ir (arba) galimus skirtingus ligos laikus ir progresavimą. . Šio skerdimo amžiaus patinų ir patelių skirtumų tarp abiejų inaktyvavimo langų nenustatyta (n=6 buvo naudojamas kiekvienai mutantų grupei). P14 mutantų gyvūnų fenotipas buvo švelnesnis nei p12 mutantų grupė, o cistinis indeksas, cistų skaičius ir kepenų funkcija buvo mažesnė pagal ALP serumo vertę (1b – d pav.). Tai pirmasis tyrimas, rodantis skirtingus Pkd1 kepenų ir inkstų trūkumo vystymosi langus / mechanizmus. Tie molekuliniai skirtumai turės būti nustatyti būsimuose tyrimuose.
1 pav. Cistinės kepenų fenotipo apibūdinimas 3 dieną 0 formos p12 ir p14 stadijose. Pkd1 delecija p12 sukelia sunkesnę cistogenezę. a ) Reprezentatyvūs makroskopiniai ir mikroskopiniai hematoksilino-eozino vaizdai, nudažyti iš Pkd1cond/cond; Tam-Cre pelės laukinio tipo (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) ir mutanto (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+) kepenų. ) su Pkd1 geno delecija, kurią sukėlė tamoksifenas 14 (p14 grupė) ir 12 (p12 grupė) postnatalinę dieną. Visos pelės buvo nužudytos p30. Mastelio juosta, 2 mm (viršutinis skydelis) 100 µm (apatinis skydelis). n reiškia mėginių skaičių vienoje grupėje, o Bd reiškia tulžies lataką. (b, c) Kepenų cistinis indeksas ir skirtingų fenotipų cistų skaičius. (d, e) ALP ir ALT vertės kraujo serume. Juostos visais atvejais reiškia vidurkį ± SEM. p < 0,05 pagal Stjudento t testą (dviejų uodegų) buvo laikomas reikšmingu rezultatu. ns nereiškia reikšmės. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Spustelėkite, jei norite cistanche herba inkstų ligai gydyti
3.2. Šautuvas ir SWATH-MS proteominė analizė PLD
Kaip nurodyta 2 paveiksle, mes atlikome diferencinę proteomų analizę abiejose mutantų (KO) cistinės stadijose (p12 – sunki cistinė liga ir p14 – lengva cistinė liga), palyginti su laukinio tipo (WT) gyvūnais, kad nustatytų ir apibūdinti atitinkamus molekulinius mechanizmus, kuriuose vyksta kepenų cistogenezė ir ligos progresavimas.
2 pav. Iliustruota darbo eigos schema. Naudojome ADPKD pelių modelį (Pkd1cond/cond; Tam‐Cre pelės), kuriame Pkd1 genetinė inaktyvacija buvo sukelta tamoksifeno skyrimo 10-ą dieną po gimdymo (p10) ir p11 (greitas ligos progresavimas) arba p15 ir p16 (uždelstas ligos progresavimas). ) pagal inkstų cistogenezės vystymosi pokytį, apibrėžiant dvi tyrimo grupes, atitinkamai pavadintas p12 ir p14 [19]. Abiejose grupėse kiekvienoje būsenoje naudojome n lygų arba didesnį nei šeši laukinio tipo (WT) ir mutantiniai (KO) individai, o visi gyvūnai buvo paaukoti esant p30. Mes ištyrėme skirtingą WT ir KO kepenų proteomą sergant abiem kepenų cistinės ligos sunkumais (1 pav.), naudodami tiek kiekybinę proteominę SWATH-MS, tiek nuo šautuvo duomenų priklausomą DDA-MS analizę. Iš baltymų, kurių gausa labai pasikeitė, naudojome bioinformatiką 2 pav. Iliustruota darbo eigos schema. Mes naudojome ADPKD pelių modelį (Pkd1cond / cond; Tam-Cre pelės), kuriame Pkd1 genetinė inaktyvacija buvo sukelta tamoksifeno skyrimo 10-ąją postnatalinę dieną (p10) ir p11 (greitas ligos progresavimas) arba p15 ir p16 (uždelstas ligos progresavimas). ) pagal inkstų cistogenezės vystymosi pokytį, apibrėžiantį dvi tyrimo grupes, atitinkamai pavadintas p12 ir p14 [19]. Abiejose grupėse naudojome n, lygų arba didesnį nei šeši laukinio tipo (WT) ir mutantiniai (KO) individai kiekvienoje būsenoje, ir visi gyvūnai buvo paaukoti esant p30. Mes ištyrėme skirtingą WT ir KO kepenų proteomą esant abiem kepenų cistinės ligos sunkumams (1 pav.), naudodami tiek kiekybinę proteominę SWATH-MS, tiek nuo šautuvo duomenų priklausomą DDA-MS analizę. Iš baltymų, kurių gausa labai pasikeitė, naudojome bioinformatikos priemones, kad nustatytų naujus terapinius tikslus ir ligos būdus. Galiausiai, mes patvirtinome tuos tikslus naudodami pirmiausia in silico (DDA vs SWATH analizė) ir galiausiai in vivo strategijas, taip pat RT-qPCR, Western blot ir imunohistochemiją. p reiškia pogimdyminę dieną
Baltymų ekspresijos modelis kepenų cistogenezėje Pirmiausia atlikome proteominės masės spektrometrijos analizę, gaudami nuo šautuvo duomenų priklausomą DDA-MS arba DDA. Ši analizė leidžia apibūdinti proteomą iš pilnų ir atskirų mėginių, nurodant didelio jautrumo baltymų buvimą / nebuvimą, tačiau nepateikiant jų kiekybinio įvertinimo. Mes išskirtinai atsižvelgėme į visus baltymus, išreikštus skirtingai daugiau nei penkiuose nepriklausomuose mėginiuose iš iš viso šešių mėginių, atitinkamai laukinio tipo ir mutantų individų p14 ir p12 stadijoms (S1 pav.). Esant p14, buvo identifikuoti 1 išskirtinis WT (arba sumažintas pagal ligą) ir 7 MUT išskirtiniai (padidinti reguliuojami) baltymai, o p12 - aštuoni WT išskirtiniai ir šeši MUT išskirtiniai baltymai (S1 pav.).
Tada mes panaudojome metodą, kuris leido mums kiekybiškai įvertinti skirtingai išreikštus baltymus. Mes atlikome SWATH – MS kiekybinę proteominę analizę tiems patiems mėginiams, kuriuos naudojome DDA, gaudami ~ 1500 baltymų kiekviename mėginyje ir daugiau nei 2000 baltymų kiekvienoje tyrimo grupėje. Pirmiausia atlikome bendro ploto sumos (TAS) normalizavimą, kad įvertintume, ar mūsų mėginiai atitiko normalų pasiskirstymo modelį, kaip parodyta S2 ir S3 paveiksluose. Toliau mes ištyrėme baltymą su reikšmingais skirtumais tarp laukinio tipo ir mutantų grupių. 1 lentelėje parodyti baltymai, kurių gausos pokytis reikšmingai pasikeitė, padidėjus du kartus (reguliuojamas aukštyn) arba sumažėjimas (reguliuojamas žemyn), ir reikšmingai pakoreguota p vertė (pagal parametrinį Stjudento t testą) WT lyginant su. MUT mėginiai p14 ir p12. Iš viso šeši baltymai parodė reikšmingus baltymų gausos skirtumus tarp WT p14 ir MUT-p14 grupių (penki aukštyn reguliuojami baltymai ir vienas žemyn reguliuojamas baltymas). Tarp WT-p12 ir MUT-p12 26 baltymai (20 baltymų reguliuojami aukštyn ir 6 baltymai reguliuojami žemyn) parodė reikšmingus skirtumus (3a pav. ir 1 lentelė). Grafiškai šiuos pokyčius galima stebėti naudojant ugnikalnių diagramas, kurios buvo sukurtos nubraižant log (2) kartų pokyčius visiems identifikuotiems baltymams pagal jų –log (10) p reikšmę (3b pav.). Reikšmingus baltymų gausos lygių skirtumus galima vizualizuoti šilumos žemėlapyje su individualizuotomis reikšmėmis pagal spektrinės bibliotekos sritis ir jos klasterizacijos lygį klasterio šilumos žemėlapio analizėje (3c ir S4 pav.). Šios klasteriai, aptikti atliekant SWATH-MS analizę, padeda mums nustatyti tuos kokybiškai atskirtus mėginius, į kuriuos reikia atsižvelgti atliekant kiekybinę analizę (S5 pav.). Neprižiūrima daugiamatė statistinė analizė buvo atlikta naudojant pagrindinių komponentų analizę (PCA), siekiant palyginti mėginių duomenis (S6 pav.). Šilumos žemėlapis ir PCA duomenys parodė trijų mėginių atkartojamumą, nes abiejose analizėse trys pakartojimai buvo glaudžiai susitelkę. Galime stebėti tiek PCA, tiek šilumos žemėlapio klasterių analizėje (S5 ir S6 paveikslai), kaip kai kurie mėginiai nebuvo tinkamai sugrupuoti, sutampa tarp abiejų grupių. Nepaisant to, matome tendenciją atskirti duomenis laukinio tipo ir mutantų klasteriuose. Mažesnis baltymų, turinčių reikšmingus p14 ir p12 skirtumus, skaičius gali būti pateisinamas skirtingu sunkumo laipsniu (2 pav.), o tai rodo, kad baltymų ir kelių skaičius didėja atsižvelgiant į cistinio fenotipo sunkumą ir ligos būklę.
3.3. Genų ekspresijos grupavimas, kelio praturtinimas ir baltymų ir baltymų sąveikos analizė PLD
Norėdami nustatyti funkciją, susijusią su skirtingai išreikštais baltymais, nustatytais SWATH-MS analize, naudojome keletą bioinformatinių priemonių ir analizės formų. Genų ontologijos (GO) terminų ir kelių analizė buvo atlikta naudojant FunRich [39, 40], String [41] ir Reactome [42]. Baltymai buvo surūšiuoti FunRich genų praturtinimo analizėje. Kalbant apie biologinį procesą, labiausiai praturtinta baltymų grupė p14 grupei (lengva cistinė) buvo susijusi su riebalų rūgščių transportavimu ir prostaglandinų biosinteze, o p12 (sunki cistinė) grupė su fibrinogeno/fibrino aktyvumu, ląstelių-ląstelių/matricos adhezija ir metabolizmu. procesas (4a pav., viršutinis skydelis). ANXA2 ir fibrinogeno kompleksas buvo du labiausiai praturtinti ląstelių komponentai atitinkamai p14 ir p12 grupėse. Be to, tarpląstelinė erdvė buvo ląstelių komponentas, turintis didžiausią baltymų procentą abiejose grupėse (4a paveikslas, apatinė plokštė). Panašiai ta pati analizė buvo atlikta su stygų analize, nustatant skirtingus metabolinius procesus kaip pagrindinį biologinį procesą, o tarpląstelinę erdvę - kaip labiausiai praturtintą ląstelės komponentą; atitinka GO rezultatus (S7a pav.). Galiausiai pakartojome analizę naudodami „Reactome“ platformą ir nustatėme, kad metabolizmas ir imuninė sistema buvo labiausiai praturtinti būdai (S7b pav.).
Taip pat buvo atlikta baltymų ir baltymų arba grupių analizė, pagrįsta stygų analize, siekiant ištirti galimą baltymų ir baltymų sąveiką (sąveiką su eksperimentiniais įrodymais). Įvairiose grupėse buvo nustatyta daugybė baltymų sąveikų (S8 pav.), tačiau vienas klasteris p14 ir kitas p12 buvo svarbiausios, atsižvelgiant į baltymų sąveikų skaičių ir ekspresijos lygį (4b pav.). P14- klasteryje yra aneksino A2 baltymo (ANXA2_P07356), susijusio su keliomis ląstelių funkcijomis, tokiomis kaip fibrinolizė, ląstelių judrumas (epitelio ląstelėse), baltymas, susijęs su aktinu. citoskeleto ir ląstelės-matricos sąveika [43], sąveikaujanti su dviem kitais baltymais, dalyvaujančiais tarpląsteliniame lipidų transporte (FABP1_P12710 ir FABP5_Q05816). Įdomu tai, kad p12-klasteryje buvo nustatyta kita svarbi baltymų grupė, turinti labai stiprią baltymų ir baltymų sąveiką tarp kelių fibrinogenų (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22). }}E9PV24 ir FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogenai dalyvauja hepatocitų augime ir tarpininkauja trombocitų plitimui kraujyje, intersticiniam kolagenui ir fibroziniams pažeidimams [44]. Be to, buvo nustatyta, kad papildomi baltymai sąveikauja su fibrinogenais (S8 pav.), pvz., serumo amiloido p komponentu (SAMP_P12246), hemopeksinu (HEMO_Q91X72) arba hidroksirūgšties oksidaze 2 (HAOX{). {37}}Q9NYQ2). Remiantis stygų rezultatais, ANXA2 ir fibrinogeno kompleksai taip pat buvo labiausiai praturtinti ląstelių komponentai, nustatyti FunRich analize (4a pav.). Įdomu tai, kad lygindami DDA ir SWATH analizės duomenis, patvirtinome, kad keli baltymai, nustatyti SWATH, taip pat buvo nustatyti atliekant DDA analizę, įskaitant keletą susijusių su fibrinogeno komplekso baltymais (SAMP / Apcs ir S10A9 / S100a9; S3 lentelė).
3.4. SWATH-MS analizės patvirtinimas atskleidžia fibrinogeno kompleksą kaip naują molekulinį mechanizmą, susijusį su PLD
Remdamiesi šiais duomenimis, iš SWATH-MS analizės (S9 pav.) atrinkome pakeistus baltymus, susijusius su fibrinogeno kompleksu p12 ir p14 stadijose, kad būtų galima patvirtinti in vivo naudojant RT-qPCR, Western blot ir imunohistochemiją, kad būtų galima nustatyti jų patvirtinimą. ligos taikiniai. Aštuoni iš 1 0 šių atrinktų baltymų buvo patvirtinti mRNR lygiu RT-qPCR (5 pav.); vienas reguliuojamas 14-stadijoje (ANXA2_P07356) ir p12-grupėje (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 ir FIBG_Q8VCM7) ir vienas žemyn reguliuojama p12 grupėje (HAOX2_Q9NYQ2). Įdomu tai, kad dviejų baltymų, turinčių didesnį atstumą arba mažiau sąveikos su fibrinogeno grupe (ILK ir S10A9), genų ekspresija buvo vienintelė, kuri nebuvo patvirtinta (5c pav.).
Fibrinogeno komplekso (ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG ir HAOX2 baltymų) padidėjimas buvo patvirtintas Western blot (WB) analize (6 pav.). Apskritai genų ekspresija ir WB labai atitiko SWATH-MS proteominius duomenis. Galiausiai, mes taip pat atlikome imunohistocheminį fibrinogeno komplekso patvirtinimą mutantiniuose ir policistiniuose kepenų mėginiuose (7 pav.). Fibrinogeno dažymas buvo stipriai reguliuojamas cistą dengiančiose epitelio ląstelėse ir tulžies latakų išsiplėtimuose (7a pav.). Šie rezultatai pirmą kartą atskleidžia fibrinogeno kompleksą kaip galimą kelią, susijusį su kepenų cistogeneze, ir kaip galimą būsimą terapinį PLD tikslą.
5 pav. Galimų PLD taikinių patvirtinimas RT-qPCR. 8–10 pasirinktų taikinių genų ekspresija koreliavo su SWATH-MS duomenimis. Atrinkto p14 tikslinio aneksino A2 (Anxa2) RT-qPCR (a); Sureguliuotas p12 nukreiptas į amiloido p komponentą, serumą (Apcs, SAMP genas), į fibrinogeną panašų 1 (Fgl1), fibrinogeno beta grandinę (Fgb), hemopeksiną (Hpx), fibrinogeno alfa grandinę (Fga), fibrinogeno gama grandinę (Fgg) (b), su integrinu susijusi kinazė (Ilk) ir S10{{30}} kalcį surišantis baltymas A9 (S100a9) (c); ir sumažinta p12 tikslinė hidroksirūgšties oksidazė 2 (Hao2) (d). n=6 buvo naudojamas kiekvienai baltymų grupei. Gapdh buvo naudojamas kaip namų tvarkymo genas. Juostos reiškia vidurkį ± SEM. Buvo naudojamas Stjudento t testas su dviem uodegomis, o reikšmė p < 0,05 buvo laikoma reikšminga. ns: nereikšmingas (p Didesnis arba lygus 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
7 pav. Fibrinogeno kompleksas yra reguliuojamas cistiniame epitelyje. ( a, b ) Reprezentatyvūs fibrinogeno imunohistochemijos vaizdai tulžies latakuose (viršutinė plokštė) ir kepenų parenchima (apatinė plokštė) (a) ir jo kiekybinis įvertinimas (b). n=6 buvo naudojamas kiekvienai grupei. Imunohistocheminė analizė parodė padidėjusį fibrinogeno reguliavimą per cistinį epitelį. Mėginiai atitiko p12 grupę. Mastelio juostos reiškia 100 µm. Bd reiškia tulžies lataką. Juostos reiškia vidurkį ± SEM. Buvo naudojamas Stjudento t testas su dviem uodegomis, o reikšmė p < 0,05 buvo laikoma reikšminga. *** p < 0,001.
„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:
El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp / Tel:+86 15292862950
Įsigykite daugiau specifikacijų:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
