Going Micro sergant leptospiroze, inkstų liga Ⅱ

4. Šeimininko imuniteto atsakas į Leptospira spp.

Pagrindinis Leptospira kelias yra tiesioginis prasiskverbimas į gleivines ar atvirą odą per kraują, audinius, šlapimą ar užterštą vandenį, kuris pasklinda po visą sisteminę kraujotaką ir išplinta į kelis organus, pvz.kepenys, plaučiai ir proksimaliniai kanalėliainefronas inkstuose, kur gali daugintis ir išgyventi mėnesį [51]. Pradinėje infekcijos fazėje,įgimtas imuninis atsakasvaidina pagrindinį vaidmenį kaip pirmoji gynybos linija sergant leptospiroze, paveikdama atsaką įmodelio atpažinimo receptoriai, makrofagų fagocitozė, tarpląstelinio indukcijaneutrofilų kaupimasis, irkomplemento sistemos įsikišimas [52].

TheImuninis atsakasŽmonėms atlieka esminį vaidmenįklinikinių požymių vystymasis, kaip ir kai kurių patogeninių padermių virulentiškumo faktoriai. Dauguma žmonių leptospirozės yra besimptomės arba lengvos, ir tik 10 % atvejų išsivysto sunkios formos su daugelio organų nepakankamumu ir padidėjusiu mirtingumu, susijusiu sucitokinų audrair imunoparalyžiaus būsena. Patogeninės rūšys skatina humoralinį atsaką bakteriemijos fazėje, nors vėlesnis elgesysImuninis atsakasyra neaišku. Tiriant pacientus, kuriems buvo daug klinikinių leptospirozės pasireiškimų, klinikinio vaizdo sunkumas buvo susijęs su įvairiais citokinų kiekiais serume, pvz., TNF-, IL-10 ir IL-6 [53], tačiau ši išvada tebėra prieštaringa [54]. Šios sąlygos padidino susidomėjimą suprasti imuninį atsaką apskritai ir biologinius įvykius, atsirandančius infekcijos metu.

KIEK TRUKE, KAD CISTANCHE VEIKTI?

4.1. Leptospira ir komplementų sistema

Leptospiralinių proteazių proteolitinis aktyvumas prieš tarpląstelinę matricą leidžia infekcijai patekti į kraujotakos srautą. Komplemento sistema kraujotakos sistemoje yra vienas iš pagrindinių įgimto imuninio atsako į patogeninę leptospirą mechanizmų. Tačiau Leptospira sukūrė strategijas, kaip išvengti komplemento sistemos atakos, jungdama baltymus prie komplemento molekulių ir gamindama proteazes, tokias kaip termolizinas, termostabilus neutralus metaloproteinazės fermentas, veikiantis C3 baltymų grandinę. Patogeninės padermės suriša H faktorių (FH), su komplemento faktoriumi susijusį baltymą 1 (FHR-1), į faktorių H panašų baltymą 1 (FHL-1) ir C4b surišantį baltymą (C4BP). iš kurių yra atsakingi už komplemento sistemos slopinimą [55]. Yra trys pagrindinės strategijos, kaip išvengti patogeninės Leptospira [55, 56] komplemento, trukdant šeimininko komplemento reguliatoriams, šeimininko proteazei ir bakterinei proteazei. Komplemento reguliatoriams Leptospira naudoja faktorių H (FH; alternatyvaus komplemento kelio reguliatorius) ir C4 surišantį baltymą (C4BP; klasikinio ir lektino komplemento kelių reguliatorius), kad paspartintų C3 konvertazių skilimą ir taip pat veiktų kaip I faktoriaus kofaktoriai. C3b ir C4b skilimui [57,58]. Leptospiralinis baltymas (LcpA) kartu su vitronektinu (Vn; galinio kelio reguliatorius) jungiasi su C9 ir slopina jo polimerizaciją [59], todėl galimai blokuoja membraną aktyvuojančio komplekso (MAC) susidarymą [60]. Be to, patogeninė Leptospira jungiasi su keliomis šeimininko proteazėmis, tokiomis kaip Urokinazės tipo plazminogeno aktyvatorius (uPA), kurios indukuoja aktyvų plazminą [61] (serino proteazę) C3b, C4b ir C5 virškinimui Leptospira paviršiuje [62]. Be to, metaloproteazės ir termolizinas, endogeninė Leptospira proteazė, gali suskaidyti ir inaktyvuoti kelis komplemento baltymus (C2, C3, C4 ir faktorių B) [60]. Komplemento reguliatorių iš šeimininko ir patogeninės Leptospira derinys palengvina bakterijų kolonizaciją tiksliniuose šeimininko organuose [63].

4.2. Leptospira ir neutrofilai

Infekcijos metu patogeninės Leptospira rūšys sukelia stiprų neutrofilų aktyvavimą ir priešuždegiminį atsaką. Neutrofilai yra svarbūs mikroorganizmų kontrolei, tačiau jie taip pat prisideda prie šeimininko audinių pažeidimo. Buvo įrodyta, kad mažas ekstraląstelinio neutrofilų kaupimosi lygis dėl mažo neutrofilų aktyvumo kraujotakoje padidina leptospiremiją, o tai rodo, kad intravaskulinis neutrofilų susikaupimo formavimasis gali būti labai svarbus siekiant užkirsti kelią ankstyvam patogeninės Leptospira plitimui [64].

4.3. Leptospira ir makrofagai

Pradinėje Leptospira infekcijos fazėje makrofagai atlieka svarbų vaidmenį pašalinant spirochetą. Šis efektoriaus mechanizmas kartu su efektyviu citokinų atsaku yra susijęs su fagocitų kontrole ir infekcijos plitimu, nors Leptospira spp. buvo įrodyta, kad jis sukelia apoptozę makrofaguose per Fas/FasL-kaspazės-8/-3 kelią ir palengvina jų išgyvenimą bei dauginimąsi šeimininke dėl mitochondrijų faktorių indukuojančios apoptozės ir endonukleazės išsiskyrimo užsikrėtusiuose makrofagai [65]. Neseniai buvo atlikti Leptospira užkrėstų makrofagų mikrotranskripto tyrimai, siekiant nustatyti epigenetinius mechanizmus, tokius kaip potranskripcijos reguliavimas RNR. Makrofagai, užkrėsti Leptospira, parodė, kad mikroRNR (miRNR) reguliuoja infekcija su spirocheta, o tai rodo, kad šis reguliavimas yra gyvybiškai svarbus šių imuninės sistemos ląstelių atsakui į Leptospira infekciją [66]. Žmogaus makrofaguose uždegimas, kurį sukelia reaktyviosios deguonies rūšys ir lizosominis katepsinas B, kurį sukelia Leptospira infekcija, turi didelį NLRP3 ir IL-18 kiekį, skatina IL-1 gamybą ir lemia didelį fagocitozės galimybė ir greitas kai kurių citokinų modeliavimas koreliavo su atsparumu leptospirozei [67].

4.4. Humorinis atsakas į leptospirą

Specifinis humoralinis atsakas prieš Leptospira būdingas IgM ir IgG antikūnų gamybai trečią simptomų atsiradimo dieną. Be to, buvo pranešta apie IgA gamybą nuo pirmos dienos iki devintojo mėnesio po užsikrėtimo; Tiesą sakant, IgM padidėjimas buvo naudojamas kaip alternatyvi priemonė ankstyvai leptospirozės diagnozei [68]. Humoralinio atsako poveikis žmonėms, sergantiems leptospiroze, leidžia nustatyti serologinę diagnozę po natūralios infekcijos [69]. Svarbiausias humoralinio atsako į Leptospira infekciją aspektas gali būti apsauginių antikūnų susidarymas. Šiuo metu vakcinos nuo leptospirozės yra sudarytos iš pilnų ląstelių preparatų ir turi apribojimų, tokių kaip mažas veiksmingumas, daug šalutinių poveikių, maža imuninės atminties generacija ir kryžminės apsaugos nuo serovarų skirtumų trūkumas. Taigi ligų kontrolei būtina kurti naujas vakcinas, o šiuo metu atliekami tyrimai, siekiant pagaminti vakcinas iš genetinės imunizacijos [70]. Leptospiros OMP buvo laikomi antigenu, pasižyminčiu geresniu imunogeniškumu B limfocitams, įskaitant struktūrinius epitopus OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} ir LipL41263-282 [71]. Šie epitopai yra perspektyvūs kandidatai kuriant universalią vakciną.

4.5. Adaptyvusis imuninis atsakas į Leptospira: T ląstelės ir citokinai

Patogeninės Leptospira rūšys sukelia imuninį atsaką, kurį sukelia T ir B limfocitai, kartu su citokinų ekspresija, kuri gali būti susijusi su gravitacijos diagramomis. T ląstelių aktyvinimas užsikrėtus Leptospira inicijuoja uždegiminį atsaką, daugiausia dėl citokinų gamybos. Tai labai svarbu anksti pašalinant infekciją, tačiau nekontroliuojama priešuždegiminių citokinų gamyba taip pat gali sukelti perteklinę citokinų gamybą, o po to gali pasireikšti imunoparalyžius, kuris gali sukelti sepsį ir daugelio organų nepakankamumą. T limfocitai gamina IL-1, IL-6, IL-12, interferoną (IFN) ir TNF-, kurie veikia kaip chemoterapiniai atraktantai, pritraukiantys leukocitus infekcijos vietoje. Įdomu tai, kad ex vivo naivios δ T ląstelės dauginosi periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PBMC) kultūrose, stimuliuojamose Leptospira antigenais, kartu gamindamos ir IL-17, ir IFN [72]. Be to, kadangi leptospiroze užsikrėtusiose laukinio tipo pelėse buvo daug citokinų, įskaitant IL-4, IL-10 ir IL-13, palyginti su neužkrėstomis pelėmis, Leptospira sukeltos pelių lėtinės ligos. nefritas (Daf1-/- pelėms) parodė didesnę lygiųjų raumenų aktino, IL-10, IL-13 ekspresiją, bet nesiskyrė IL-12 ir IL{{21} } lygiai [73]. Taigi Daf1 ir IL-17 gali atlikti lemiamą apsauginį vaidmenį CKD progresavime kaip ryšys tarp Leptospira sukeltos pelių CKD ir inkstų fibrozės [72,73]. Tačiau hipotezė apie pasirinktą citokinų atsaką į ligos progresavimą vis dar nėra įtikinama sergant žmogaus leptospiroze. Pacientams, sergantiems sunkia leptospiroze ir plaučių pažeidimais, buvo nustatytas padidėjęs IL-6, CXCL8 ir IL-10 lygis, palyginti su pacientais, sergančiais lengva leptospiroze [53]. Šios didelės citokinų koncentracijos pacientams, sergantiems leptospiroze, pabrėžia jų pagrindinį vaidmenį sunkios leptospirozės vystymuisi.

Pacientams, sergantiems sunkia infekcija, randami priešuždegiminio profilio CD4+ T limfocitai ir IL-2 bei IFN- gamintojai, o CD4+ CD25 – daug IL-10 beveik nėra. Atrodo, kad T limfocitų sukelto imuninio atsako reguliavimas neužkerta kelio audinių pažeidimams, kuriuos sukelia uždegiminis atsakas į Leptospira. Žmonių, sergančių sunkia leptospiroze, CD4+ T limfocituose TNF ir kitų priešuždegiminių citokinų gamyba yra didesnė nei sergančiųjų lengva ligos forma, o tai rodo, kad šie citokinai gali būti naudojami kaip sunkumas imunologinėje infekcijos fazėje [74]. IL-10 gamyba siejama su leptospiroze sergančių žmonių mirties rizika; tačiau tyrimas, atliktas su paveiktais ir besimptomiais žmonėmis, susiejo šio citokino gamybą su uždegiminio atsako kontrole ir išgyvenimu [74]. Leptospira infekcijos metu uždegiminiai mediatoriai ir kai kurių leukocitų ląstelių, tokių kaip T limfocitai, veikimas yra greitai reguliuojami atspariems asmenims, priešingai nei asmenims, sergantiems sunkia leptospirozės forma [75].

Apibendrinant galima pasakyti, kad imuninis atsakas į Leptospira infekciją nėra visiškai suprantamas dėl leptospiroze sergančių pacientų, kurie sąveikauja su skirtingais bakterijų genomo virulentiškumo veiksniais, klinikinio elgesio, o tai suteikia Leptospira tvirtą patogeniškumą.

5. Klinikinės apraiškos

Klinikinės leptospirozės apraiškos yra įvairios: nuo lengvų, nespecifinių simptomų, tokių kaip į gripą panašūs simptomai (karščiavimas, mialgija ir galvos skausmas), iki sunkių simptomų kartu su galutinės stadijos organų pažeidimais (pvz., AKI, ūminis kepenų nepakankamumas). ir kraujavimo diatezė, dar vadinama Weil sindromu), ūminė hemoptizė dėl plaučių kraujavimo, ūminis sumišimas dėl aseptinio meningoencefalito ir ūminis širdies nepakankamumas dėl ūminio ar poūmio miokardito [7]. Atitinkamai, trys įtariamos leptospirozės infekcijos rodikliai susideda iš (i)ūminė karščiavimo liga, ii) gelta ir iii)ūminis inkstų pažeidimas[12]. Sunkios leptospirozės formos prognozės yra sunki mialgija pradžioje, stiprus polinkis kraujuoti ir ryški gelta. Įdomu tai, kad buvimas arba iš anksto egzistuojančiųlėtinė inkstų liga(mažas inksto dydis) arba padidėję, užsikimšę inkstai su anurija yra susiję su blogiausia baigtimi [12]. Taigi pacientus, sergančius su leptospiroze susijusia inkstų liga, reikia nedelsiant gydyti.

6. Diagnozė

6.1. Klinikinė diagnozė

Leptospirozės diagnozė pagrįsta ekspozicijos istorija, rizikos veiksniais ir klinikinėmis apraiškomis. Didelis įtarimo rodiklis gali apeiti vėlesnį organų pažeidimą. Tačiau leptospirozės simptomai dažnai painiojami su kitomis ūminio febrilinio sindromo priežastimis, tokiomis kaip dengės karštligė, maliarija, hepatitas ir aktyvi autoimuninė liga. Patognomoninių leptospirozės požymių nebuvimas reiškia, kad diagnozė preliminariai pagrįsta karščiavimo ir mialgijos įvertinimu pacientams iš endeminės vietovės. Dėl šios priežasties būtina laboratorinė leptospirozės diagnostika.

6.2. Laboratorinė diagnozė

Laboratoriškai leptospirozę sunku diagnozuoti, ypač ūminės fazės metu. Tai gali būti atliekama tiesiogiai identifikuojant spirochetas arba jų komponentus kūno skysčiuose arba audiniuose, išskiriant leptospirus kultūroje arba aptinkant tam tikrus antikūnus įvairiose klinikinėse fazėse. Leptospirozę sunku atskirti nuo ligų, tokių kaip maliarija, dengės karštligė, riketsija, gripas, hepatitas ir geltonoji karštinė dėl jos neaiškios klinikinės išvaizdos. Dėl to diagnozei patvirtinti reikalingi laboratoriniai tyrimai. Šių tyrimų (DNR) pagrindas yra antikūnų prieš leptospires, pačių leptospirų ar jų dezoksiribonukleino rūgšties nustatymas. Dabartinė laboratorinė diagnostika apima ir tiesioginį identifikavimą (Leptospira spirochetų ar DNR aptikimą mėginiuose arba organizmo išskyrimą iš mėginių), ir netiesioginį aptikimą (serologinę diagnozę arba serologiją Leptospiralinei infekcijai nustatyti, kuri pagrįsta specifinių antikūnų prieš įvairias ligas nustatymu. Leptospiraliniai antigenai) (1 lentelė).

6.2.1. Tiesioginis mikroskopinis tyrimas, kultūra ir antigenų aptikimas

Leptospirai yra plonos, ryškios, aktyviai judrios spiralės, turinčios būdingą greitą sukimąsi (trūkčiojantį judrumą) pagal įprastą tamsaus lauko mikroskopą (DFM), o apytiksliai 10 leptospirų / ml reikia norint aptikti vieną ląstelę viename lauke. Infekcijos trukmei pailgėjus vienai savaitei, DFM miršta maždaug 10% (nuo 100 iki 90%). Jautrumui padidinti naudojami keli specialūs dažymo būdai; Warthin – Starry sidabro dažymas [76] ir imuninis dažymas (imunohistochemija, imunofluorescencija, imunomagnetinio antigeno gaudymas ir dažymas imunoperoksidaze [77]), kuriems reikalingi serovarui specifiniai pirminiai antikūnai (atskirai arba derinyje).

1 lentelė. Laboratoriniai leptospirozės diagnostikos tyrimai.

LAMP, kilpinis izoterminis stiprinimas; PGR, polimerazės grandininė reakcija; NGS, naujos kartos sekvenavimas; IHA, netiesioginė hemagliutinacija; ELISA, su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas; IgM, imunoglobulinas M; MAT, makroskopinis agliutinacijos testas; MCAT, mikrokapsulių agliutinacijos testas; DNR, dezoksiribonukleorūgštis; DFM, tamsaus lauko mikroskopija

Lygiagrečiai Leptospira pasėlis iš kraujo, šlapimo, smegenų skysčio ir biopsinio audinio galimas per pirmąsias kelias dienas iki 10 dienų po ligos simptomų atsiradimo (leptospirozės stadijos). Kadangi jie auga lėtai (6–8 val. padvigubėjimo laikas), išrankūs ir linkę į užteršimą, kultūros mėginiai turi būti laikomi mažiausiai 3–4 mėnesius prieš išmetant kaip neigiamus), tik 23 % jautrumo, bet tai būtina. jautrumo vaistams testui [6]. EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) terpė (oleino albumino kompleksas) susideda iš galvijų serumo albumino (V frakcija), Tween 80, amonio chlorido tiamino, monokalio fosfato, dinatrio fosfato ir įvairių maistinių medžiagų [78]. dažniausiai naudojama, o kai kuriems serovarams reikalinga labiau specializuota T80/40/LH terpė (polisorbatas 40, laktalbumino hidrolizatas, superoksido dismutazė ir triušio serumas) [79]. Atrodo, kad Hornsby – Alt – Nally (HAN) pirminei didelio ir įvairaus sudėtingų patogeninių leptospirų asortimento izoliacijai yra gera terpė [80].

Leptospiralinių antigenų aptikimas naudojant imunoperoksidazę, imunofluorescenciją arba imunomagnetinio antigeno gaudymo sistemą buvo sukurtas mėginiams, kuriuose yra mažai bakterijų, arba tamsaus lauko mikroskopija negali būti naudojama, tačiau tai nėra įprastai atliekama dėl pirminių antikūnų apribojimo [77]. Priešingai, nukleorūgščių atpažinimas su nauja DNR amplifikacija; polimerazės grandininė reakcija (PCR) (ty įdėtoji PGR, kiekybinė PGR [qPCR]), kilpos tarpininkaujama izoterminė amplifikacija (LAMP) ir naujos kartos sekos nustatymas (NGS) yra vertingi ankstyvai ir tiksliai laboratorinei diagnostikai, ypač Leptospiros išskyrimas naudojant biologinės terpės inokuliaciją ir DNR hibridizaciją (DNR zondas) [81,82]. Diagnozei nustatyti galima amplifikuoti įvairius leptospiralinius taikinius (pvz., 16S ribosomų RNR) arba DNR [83], o realaus laiko PGR (RT-PGR) yra jautresnė ir specifiškesnė nei standartinė PGR [84]. Kadangi kai kurie RT-PGR pradmenys gali prisijungti prie nespecifinės vietos, todėl gaunami klaidingai teigiami rezultatai, naujausi realaus laiko multipleksiniai PGR tyrimai buvo sukurti naudojant du pradmenų rinkinius [85]. Įdėtasis PGR taip pat padeda aptikti specifiškesnes ir jautresnes DNR vietas naudojant papildomus pradmenų rinkinius [86,87]. Tačiau dabartinės leptospirozės diagnozavimo tendencijos yra tiek serologinių, tiek molekulinių metodų, tokių kaip PGR ir ELISA (paprastesnis nei auksinis serologinis MAT), naudojimas šalyse, kuriose riboti ištekliai [88, 89]. Be to, LAMP metodas [90], skirtas 16S rRNR genui (rrs) aptikti, yra ekonomiškas, greitas ir efektyvus būdas aptikti patogenines leptospires šlapime. Šiuo metu NGS yra tiksliausiai pagrįstas nuo kultūros nepriklausomas kūno skysčių (kraujo ir šlapimo) genomo analizės metodas [91], o būsima leptospirozės tyrimų kryptis būtų pereiti prie molekulinės leptospirų klasifikacijos, kuri įveikia ribotumą. leptospirų kultūros išskyrimas iš klinikinių mėginių. Taigi PGR reikšmė klinikinėje leptospirozės diagnozėje yra ypač gera ir atsiranda keletas modernių metodų.

6.2.2. Antikūnų nuo leptospiros aptikimas

Naudojamos kelios serologinės diagnozės; pavyzdžiui, genčiai specifinių antikūnų tyrimai (netiesioginė hemagliutinacija [IHA], su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas [ELISA], Lepto Dri Dot [latekso agliutinacija], mikrokapsulių agliutinacija [MCAT]) ir serovarui specifinių antikūnų tyrimai (mikroskopinis agliutinacijos testas). MAT]) [92,93]. Iš esmės MAT kriterijai diagnozuojant yra (i) keturis kartus padidėjęs suporuotų serumų titras (dabartinės infekcijos serokonversija) arba (ii) vienas aukštas titras (didesnis arba lygus 1:400 arba 1:800, didesnis epidemijos metu srityse) (seropozityvumas) (antikūnai gali išlikti tam tikrą laiką po užsikrėtimo arba kryžminės reakcijos su kitomis ligomis). Be to, MAT reikalauja gyvos visų regiono Leptospira serovarų grupės su lokaliai standartizuotų serovarų skydeliu [93,94] pagal Pasaulio gyvūnų sveikatos organizaciją (19 antigenų, atstovaujančių 15 serogrupių) [95]. Kadangi antikūnai aptinkami praėjus 5–7 dienoms po užsikrėtimo, MAT testas gali būti neigiamas (titras < 1:50) per pirmąsias kelias užsikrėtimo dienas. Leptospirozės diagnozę galima atlikti imant šlapimo mėginius [96], naudojant tiek serologinį, tiek molekulinį aptikimą (16S rRNR), ypač pacientams, neseniai užsikrėtusiems (MAT yra didesnis arba lygus 1:800 arba ELISA IgM teigiamas arba abu) [97] .

Esant ribotiems ištekliams, klinikinės prognozės balas [98], pagrįstas atitinkama klinikine istorija ir susijusiais laboratoriniais tyrimais su septyniais balais: hipotenzija (3), gelta (2), raumenų skausmas (2), AKI (1,5). , siūlomas mažas hemoglobino kiekis (3), hipokalemija su hiponatremija (3) ir neutrofilija (1) (4 balų apibendrintas plotas po imtuvo veikimo charakteristikos kreive yra {{10}}.78 () 95 % PI 0,68–0,89) leptospirozės diagnozei [77]). Šis Tailando-Lepto priėmimo tikimybės balas galėtų būti diagnostikos priemonė ankstyvai spėjamai leptospirozės diagnozei pacientams, kuriems yra rimtas klinikinis įtarimas dėl ligos.