Vienalaikis aktino citoskeleto stabilizavimas keliose nefronui specifinėse ląstelėse apsaugo inkstus nuo įvairių sužalojimų

Lėtinės inkstų ligosirūminis inkstų pažeidimasyra mechaniškaiskirtingos inkstų ligos. Nors lėtinės inkstų ligos yra susijusios supodocitų pažeidimas, ūminis inkstų pažeidimasveikia inkstų kanalėlių epitelio ląsteles. Nepaisant šių skirtumų,kardinalus bruožasAbiejųūminės ir lėtinės inkstų ligosyra nereguliuojamas aktino citoskeletas. Mes tai parodėmefarmakologinis GTPazės dinamino aktyvinimaspagerina podocitų pažeidimąlėtinių inkstų ligų pelių modeliaipateikėskatina aktino polimerizaciją. Čia mes nustatome dinamino vaidmenį moduliuojant standumą ir poliškumąinkstų kanalėlių epitelio ląstelėssujungiant aktino gijas į šakotus tinklus. Mažos molekulės agonistu suaktyvinus dinamino skersinį ryšį, viršūninės membranos aktomiozino žievė stabilizuojasi nuo sužalojimo, o tai savo ruožtuišsaugo inkstų funkcijąįvairiuose ūminio inkstų pažeidimo pelių modeliuose. Pažymėtina, kad dinamino agonistas tuo pačiu metu susilpnina podocitus irkanalėlių pažeidimasAlporto sindromo genetiniame pelių modelyje. Mūsų tyrimas pateikia pagrįstumo įrodymų ir pabrėžianaujų holistinių nefronus saugančių terapijų privalumai.

SPUSTELĖKITE ČIA, KAD SUŽINOTE ŽOLĖLĖS CISTANČIŲ FORMUOTI, TINKAMI ŪMINIAI INKSTU PAŽALOJIMAI

Thepagrindinės ūminio inkstų pažeidimo priežastys(AKI) yraišemija, hipoksija, arbanefrotoksiškumas 1. Nors tai gali būti pakeista, AKI yra didelė sveikatos priežiūros problema, kuriai būdingas didelis mirtingumas ir galutinio gydymo nėra. Nepriklausomai nuo jo etiologijos, AKI pirmiausia pažeidžia poliarizuotas inkstų kanalėlių epitelio ląsteles, kurių viršūniniai mikrovileliai sudaro kanalėlių šepetėlio kraštą, kuris dalyvauja koordinuojant esminį elektrolitų ir vandens transportavimą . Ankstyvas AKI morfologinis bruožas yra šepetėlio krašto ir ląstelių poliškumo praradimas dėl aktomiozino žievės skilimo viršūninėje membranoje1.

Ląstelių poliškumo nustatymas ir palaikymas apima signalizacijos kaskadas, membranų judėjimą ir citoskeleto dinamiką, kurios visos yra labai suderintos . Viršūninės membranos organizavimą daugiausia lemia aktomiozino tinklų4 architektūra, kuri nustato žievės standumą ir taip palengvina poliškumo baltymų grupavimą. Nors miozino II varikliai laikomi pagrindiniu žievės standumo generatoriumi5,6, aktomiozino žievės architektūrą nustato daugybė aktiną surišančių baltymų (ABP)7.

Be žinomų GKŠP, inkstų kanalėlių šepetėlio kraštas yra labai praturtintas dinaminu8, GTPaze, geriausiai žinoma dėl savo vaidmens endocitozėje9. Dinaminas turi būdingą polinkį susiburti į kelias oligomerizacijos būsenas, tokias kaip dimerai, tetramerai, žiedai ir spiralės9. Pirmą kartą nustatėme tiesioginę dinamino ir aktino sąveiką10 ir parodėme, kad dinamino oligomerizacija reguliuoja aktino polimerizaciją podocituose 11, 12, specializuotose ląstelėse, būtinose inkstų filtro selektyvumui. Naudodami pelių CKD modelius, parodėme, kad nuo dinamino priklausomos aktino polimerizacijos aktyvinimas atkuria podocitų sužalojimą, atkurdamas jų unikalią struktūrą ir funkciją12.

Čia mes tai parodomeinkstų kanalėlių epitelio ląstelėsdinaminas sujungia gijinį aktiną (F-aktiną) į šakotus tinklus. Dinamino kryžminio ryšio galimybes apibrėžia jo oligomerizacijos būsena ir F-aktino ilgis. Farmakologinis dinamino oligomerizacijos aktyvinimas neutralizuoja AKI, stabilizuodamas aktino tinklus ir tokiu būdu ląstelių vientisumą, kuris iš dalies apsaugo inkstų epitelio ląsteles nuo oksidacinio streso sukelto pažeidimo. Mūsų tyrime nustatyta, kad inkstų kanalėlių ląstelės viršūninės membranos aktomiozino žievė yra vaistinis preparatas AKI naudojant dinaminą kaip tarpinį serverį.

Rezultatai Dinamino oligomerizacija nustato viršūninės membranos standumą ir morfologiją.

Norėdami ištirti dinamino ir aktino sąveikos vaidmenį poliarizuotose inkstų kanalėlių epitelio ląstelėse, panaudojome Bis-T-23, nuo aktino priklausomos dinaminų oligomerizacijos allosterinį aktyvatorių atkurtoje sistemoje13, ląstelėse11,13 ir visas organizmas 12. Ląstelių fenotipai buvo įvertinti Madin-Darby šunų inkstų (MDCK) ląstelėse, atsižvelgiant į F-aktino būseną ir sandarios jungties baltymo zonula occludens-1 (ZO-1) dažymo modelį, kuris yra laikomas ląstelių poliškumo biomarkeriu. Citochalasinas D (CytoD) ir latrunkulinas A (LatA), žinomi aktino polimerizacijos inhibitoriai, sumažino F-aktino kiekį ir sukėlė nenutrūkstamą ZO-1 dažymą (papildomas 1a pav.). Priešingai, Bis-T-23 sukėlė nedidelį F-aktino kiekio padidėjimą, nedarant jokio poveikio ZO-1 dažymui. Bis-T-23 pridėjimas prieš LatA, bet ne po jo, iš dalies išsaugojo F-aktino lygį ir ląstelių poliškumą. Nei DMSO nešiklis, nei dinamino inhibitorius dynole14 neparodė jokio poveikio (papildomas 1a pav.).

Skenuojanti elektroninė mikroskopija (SEM) leido mums vizualizuoti vaistų sukeltus ląstelių morfologijos pokyčius, sutelkiant dėmesį į viršūninę membraną (1a pav.). Vidutinis MDCK ląstelių aukštis buvo 11 ± 2 µm, o vidutinis mikrovielių ilgis – 0,63 ± 0,2 µm (1 lentelė), kuris patenka į inkstuose stebimą diapazoną15. LatA sumažino ląstelių aukštį ir mikrovielių ilgį, o tolygiai pasiskirstytus mikrovielius perkėlė į grupes, o Bis-T-23 sukėlė priešingą poveikį (1 lentelė, 1a pav.). Pridėjus prieš LatA, Bis-T-23 iš dalies išsaugojo ląstelės aukštį ir mikrovielių ilgį. Kadangi mikrovilliukai pasižymi išskirtiniu ilgio valdymu, kurį apibrėžia žievės aktinas prie jų pagrindo16, šie duomenys rodo, kad Bis-T-23 pakeitė aktomiozino žievę viršūninėje membranoje.

Norėdami nustatyti tikslų Bis-T-23 poveikį žievės aktinui, mes vizualizavome aktomiozino žievę lamellipodijoje, naudodami platinos replikos elektronų mikroskopiją (PR-EM). LatA sumažino aktino tinklų tankį, ir šis poveikis buvo iš dalies panaikintas pridedant Bis-T -23 prieš LatA (1b pav.). Kadangi LatA pagreitina aktino gijų depolimerizaciją, atskirdama aktino monomerus, toliau ištyrėme, ar pastebėtas Bis-T -23 aktomiozino žievės išsaugojimas buvo dėl teigiamo jo poveikio aktino polimerizacijai. Priešingai nei stiprus aktino polimerizacijos stimuliavimas, pastebėtas podocitų ląstelių ekstraktuose10,11, Bis-T-23 tik nežymiai padidino aktino polimerizaciją MDCK ląstelių ekstrakte (papildomas 1b pav.). Panašiai, endogeninio dinamino -2 (Dyn2) imunodeplecija iš ekstrakto arba jo GTPazės aktyvumo slopinimas dinodu lėmė nežymų aktino polimerizacijos sutrikimą (papildomas 1c pav.). Nors LatA ir CytoD reikšmingai sutrikdė aktino polimerizaciją, Bis-T -23 pridėjimas prieš LatA arba CytoD negalėjo įveikti jų slopinamojo poveikio (papildomas 1d, e pav.). Jasplakinolidas, vaistas, skatinantis aktino polimerizaciją, skatindamas aktino gijų branduolių susidarymą17, reikšmingai nepadidino bendro polimerizacijos lygio (papildomas 1d pav.), o tai rodo, kad MDCK ląstelių lizatas pasižymi beveik maksimaliu polimerizuoto aktino kiekiu. Kartu šie duomenys parodė, kad Bis-T-23 poveikį MDCK ląstelių viršūninės membranos morfologijai lėmė kitas nei aktino polimerizacija mechanizmas.

Atsižvelgdami į bendras žinias apie praturtintą Dyn2 ir F-aktino lokalizaciją ties inkstų epitelio ląstelių šepetėlio siena8 ir dinamino vaidmenį endocitozėje, toliau ištyrėme, ar Bis-T -23 netiesiogiai paveikė aktiną per endocitozės pokyčius. Kaip ir tikėtasi, tiek Dyn2, tiek F-aktinas kartu lokalizuojasi aktomiozino žievėje po viršūnine membrana, mikrovilliuose ir klatrinu dengtose duobėse (CCP), kurias apibrėžia jų skirtinga forma ir dydis (papildomas 1f pav.). Mes ištyrėme CCP dinamiką naudodami bendros vidinės atspindžio fluorescencijos (TIRF) mikroskopiją 18, 19. Bis-T-23, net esant didžiausiai koncentracijai, neturėjo jokios įtakos CCP gyvavimo trukmės pasiskirstymui, o dinolis sumažino produktyvių CCP skaičių (papildomas 1g pav.). Šis koreliacijos tarp endocitozės lygio ir ląstelių morfologijos pokyčių nebuvimas patvirtina, kad Bis-T- 23 nukreiptas į žievės aktiną, nedarant įtakos dinamino vaidmeniui endocitozėje.

Kadangi inkstų ląstelių poliškumą palaiko aktomiozino tinklų architektūra ir nuolatinis susitraukimas, kuris nustato ląstelių standumą viršūninėje membranoje20, vėliau išmatavome ląstelių standumą naudojant atominės jėgos mikroskopiją (AFM). „Nanowizard IV“ sistema ir JPK analizės programinė įranga buvo naudojama norint nustatyti „Young's Modulus21“ pokyčius skirtingais eksperimentiniais parametrais (papildomas 2a pav.). Gydymas LatA lėmė reikšmingą ląstelių ir ląstelių kontaktinio standumo ir viršūninių ląstelių standumo sumažėjimą MDCK ląstelėse (1c – e pav.). Priešingai, Bis-T-23 žymiai padidino ląstelių standumą, palyginti su DMSO nešikliu (1c–e pav.), o tai atitinka jo teigiamą poveikį ląstelių aukščiui, mikrovilliukų skaičiui ir aktino tinklų tankiui (1 lentelė ir 1b pav.)22. Bis-T-23 pridėjimas prieš LatA stipriai sumažino neigiamą LatA poveikį ląstelių standumui (1c–e pav.), atsižvelgiant į teigiamą Bis-T-23 poveikį aktino tinklams. ir viršūninių ląstelių morfologija (1 lentelė, 1b pav.).

1 pav. Dinaminė oligomerizacija apibrėžia ląstelių standumą, paveikdama aktino architektūrą inkstų epitelio ląstelėse. a Reprezentatyvūs MDCK ląstelių, apdorotų DMSO (0,1 %) arba Bis-T-23 (30 µM, 0,1 % DMSO) SEM vaizdai, 1 0 min. prieš pridedant DMSO (0.1%) arba LatA (0.2 µM, 0.1 % DMSO) 2{{23} } min. Išdidinti įdėklų vaizdai (oranžinės spalvos sritys) rodo mikrovillių išsidėstymą, pasiskirstymą ir tankį viršūninėje membranoje. b Reprezentatyvūs MDCK ląstelių PR-EM vaizdai, apdoroti taip, kaip paaiškinta a punkte. Vaizdai rodo aktomiozino žievės organizavimo pokyčius MDCK ląstelėse nurodytomis sąlygomis. c Reprezentatyvūs MDCK ląstelių Youngo modulio žemėlapių vaizdai, apdoroti taip, kaip paaiškinta a punkte. d, e Juostinės diagramos, vaizduojančios Youngo modulį, vaizduojančios ląstelių standumą, išmatuotą ląstelės ir ląstelės sankryžoje (d) arba viršūninėje membranoje (e). Kiekvienas simbolis rodo vidutinį vienos ląstelės standumą. Rezultatai, pateikti d, e, buvo gauti iš mažiausiai 1 0 ląstelių iš mažiausiai trijų auginimo lėkštelių. Klaidų juostos, vidurkis ± SD (*P Mažiau arba lygu 0,05, **P Mažiau arba lygu 0,01, ***P Mažiau arba lygi 0,001, ****P Mažiau arba lygi 0,0001, nesusietas dvipusis t testas). ns, nereikšminga.

Mes taip pat nustatėme ląstelių standumą, naudodami BioScope II sistemą kaip alternatyvų eksperimentinį metodą AFM. Šiuo atveju jėgos įtraukimo kreivės buvo gautos pagal Discher ir bendradarbių modelį, apskaičiuotą naudojant Matlab programinę įrangą23. Panašios tendencijos, susijusios su ląstelių standumu, buvo užfiksuotos sąveikaujant tarp LatA ir Bis-T -23 (papildomas 2b, 2c pav.). Be to, dinodas neturėjo jokio poveikio ląstelių standumui, o CytoD žymiai sumažino ląstelių standumą (papildomas 2d pav., e) pagal jų aktino fenotipus (papildomas 1a pav.). Kartu šie duomenys nustato ryšį tarp aktomiozino žievės būklės, ląstelių standumo, viršūninės membranos morfologijos ir ląstelės poliškumo. Šios išvados taip pat įtikinamai parodo dinaminų oligomerizacijos vaidmenį apibrėžiant epitelio ląstelių poliškumo mechaninius parametrus per jo poveikį aktomiozino žievei.

Dinaminas kryžmiškai susieja aktino gijas į šakotus tinklus, kuriais grindžiamas ląstelių poliškumas. Siekdami išsiaiškinti molekulinį mechanizmą, kuriuo dinamino oligomerizacija daro įtaką aktomiozino žievės architektūrai, toliau ištyrėme dinamino poveikį aktino gijose atkurtoje sistemoje. Remiantis dabartine hipoteze, aktino gijų ilgis apibrėžia jų kryžminio susiejimo būdą6. Kadangi vidutinis žievės aktino gijų ilgis tinkle priekiniame krašte yra nuo 100 iki 150 nm24, mes ištyrėme dinamino poveikį trumpesnių gijų, susidarančių uždengus F-aktiną gelsolinu (Gsn-aktinu), organizavimui (1 pav.). 2a). Pridėjus Dyn2, susiformavo dideli šakoti tinklai (2b, c pav.). Remiantis rekombinantinio Dyn2 dydžiais ir formomis (2d pav.), tinklus daugiausia sudarė Dyn2 dimerai (Dyn2DIMER) ir tetramerai (Dyn2TETRA), kurie sąveikavo su keliais aktino gijomis (2e pav.): Dyn2DIMER susietas su dviem gijomis, Dyn2TETRA surišo iki keturių gijų, o Dyn2RING – iki šešių gijų. Mažas vaizdų padidinimas atskleidė, kad nuo dinamino priklausomi tinklai sudaro mažesnių ir didesnių žiedo formų modelį (2c pav.).

Norėdami koreliuoti atkurtos sistemos stebėjimus su dinamino vaidmeniu ląstelėse, toliau nustatėme endogeninio Dyn2 lokalizaciją žievės aktino tinkluose, naudodami monokloninį anti-Dyn2 antikūną, po kurio sekė auksu konjuguotas antrinis antikūnas (papildomas 3a–c pav.). Kaip matyti iš atkurtos sistemos, dinaminas yra susijęs su skirtingu F-aktino skaičiumi šakotuose tinkluose (2f pav.). Kartu šie duomenys nustato naują dinamino aktyvumą, ty kryžminį F-aktino susiejimą į šakotus tinklus.

Siekdami susieti dinamino kryžminio ryšio gebėjimą ir apsauginį Bis-T-23 poveikį aktomiozino žievei ir viršūninės membranos morfologiją, toliau ištyrėme Bis-T-23 poveikį dinaminui. tinklai atkurtose sistemose (3a pav.). Remiantis kontūriniais brėžiniais, kuriuose pateikiami įvairaus gijų tankio topografiniai vaizdai, Bis T-23 padidino bendrą tinklo tankį (3a pav.), o tai galima paaiškinti su dinaminu prisijungusio F-aktino skaičiaus padidėjimu dėl jo oligomerizacijos padidėjimas. Be to, dinaminas stipriau susiejo trumpesnius siūlus nei ilgas F-aktinas (3a–c pav.), o tai rodo, kad dinamino gebėjimas formuoti šakotus tinklus priklauso nuo jo oligomerizacijos būsenos ir aktino gijų ilgio. Sujungti aktino gijas į tinklus dalijasi dvi dinaminų izoformos, visur išreikštas Dyn2 ir neuronui specifinis dinaminas -1 (Dyn1) (3b pav., c).

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp / Tel.:+86 15292862950

Parduotuvė:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop