SLC37A2, su fosforu susijusi molekulė padidina lygiųjų raumenų ląsteles kalcifikuotoje aormoje

Kraujagyslių kalcifikacijayra pagrindinis šaltinisširdies ir kraujagyslių ligospacientams, sergantiems lėtine inkstų liga.Hiperfosfatemijasukelia padidėjusį tarpląstelinį fosforo antplūdį, dėl kurio kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse padaugėja į osteoblastus panašių ląstelių. PiT-1 perkelia fosfatą į kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles. Tačiau kraujagyslių kalcifikacijos mechanizmas nėra visiškai suprantamas. Šiame tyrime buvo tiriamos kitos su fosforu susijusios molekulės, išskyrus PiT-1. Iškėlėme hipotezę, kad su fosforu susijusios molekulės, priklausančiostirpalas-nešiklis(SLC) superšeima būtų susijusi su kraujagyslių kalcifikacija. Atlikdami DNR mikrogardelių analizę, mes sutelkėme dėmesį į SLC37A2 ir parodėme, kad šių ląstelių mRNR ekspresija padidėjo kalcifikuotose aortos lygiųjų raumenų ląstelėse (AoSMC). Pranešama, kad SLC37A2 perneša ir gliukozės -6-fosfatą/fosfatą, ir fosfato/fosfato mainus. In vitro analizė parodė, kad AoSMC uždegimas neturėjo įtakos SLC37A2 ekspresijai. SLC37A2 mRNR ir baltymų ekspresija padidėjo kalcifikuotame AoSMC. In vivo analizė parodė, kad SLC37A2 mRNR ekspresija aortojelėtinė inkstų ligažiurkių buvo koreliuojamas su osteogeninių žymenų genais. Be to, SLC37A2 buvo išreikštas kraujagyslių kalcifikacijos srityjelėtinės inkstų ligos žiurkės. Dėl to mes parodėme, kad SLC37A2 yra viena iš molekulių, kurios didėjakraujagyslių kalcifikacijain vitro ir in vivo.

Pagrindiniai žodžiai: SLC37A2,kraujagyslių kalcifikacija, aortos lygiųjų raumenų ląstelės,lėtinė inkstų liga, hiperfosfatemija

SPUSTELĖKITE ČIA, KAD GAUTI NATŪRALIŲ EKOLOGIŠKŲ CISTANČIŲ EKSTRAKTĄ, SU 25% ECHINAKOZIDU IR 9% AKTEOZIDU, TURINČIŲ INKSTU FUNKCIJĄ

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp / Tel:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Kadangi sergančiųjų skaičiuslėtinė inkstų liga(CKD) didėja, sergančiųjų skaičiuskuriems reikalinga dializėtaip pat padidės. Daugiausia mirčių tarp pacientų, kuriems atliekamadializėyra dėlširdies ir kraujagyslių ligųtoks kaipširdies nepakankamumas, smegenų kraujotakos sutrikimai, arba miokardo infarktas. (,2) Pagrindinis šaltinisširdies ir kraujagyslių ligosyra negimdinis kalcifikacija,() anomalija, kurią sukelia kalcio fosfato kristalų susidarymas ir nusėdimas minkštuosiuose audiniuose. (4 6) Įvairūs veiksniai, pvz., uždegimas. oksidacinis stresas, o kalcio (Ca) ir fosforo (P) koncentracijos plazmoje padidėjimas yra susijęs su kraujagyslių kalcifikacijos progresavimu. Tarp šių veiksnių hiperfosfatemija yra labiausiai susijusi su kraujagyslių kalcifikacija. (7.8) Hiperfosfatemiją sukelia per didelis P suvartojimas esant susilpnėjusiai inkstų funkcijai. Todėl pacientams, kuriems atliekama dializė, reikia apriboti P vartojimą. (79-12) Tačiau buvo pranešta, kadkraujagyslių kalcifikacijajau progresuoja, kai pradedama dializė; taip pat buvo pastebėta pacientams, sergantiems ankstyvos stadijos LIL, kai hiperfosfatemija nėra akivaizdi. (3) Todėl, siekiant pagerinti gyvenimo prognozę, svarbu užkirsti kelią kraujagyslių kalcifikacijai pacientams, sergantiems ankstyvos stadijos CKD.

dėl to padidėja P antplūdis į kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles (VSMC). P antplūdis vykdomas per PiT{0}}, VSMC ląstelės membranos paviršiuje esantį transporterį. PiT- yra tirpiųjų medžiagų nešiklio (SLC) superšeimos narys, į kurį įeina natrio fosfato transporteris, užkoduotas SLC20A1.04 PiT- perneša fosfatą per nuo Na priklausomas ląstelių membranas ir vėliau matricos mineralizaciją dėl padidėjusio p lygio.s) Kaip tarpląstelinis. P lygis didėja, VSMC pradeda ekspresuoti osteogeninius transkripcijos faktorius, tokius kaip su bėgimu susijęs transkripcijos faktorius 2 (Runx2) (16) Po šio poveikio padidėja osteoblastams būdingų genų, tokių kaip osteopontinas ir osteokalcinas, ekspresija. Be to, sumažėjo lygiųjų raumenų specifinių baltymų ekspresija. pvz., lygiųjų raumenų baltymas 22-0 (SM22-0), atsiranda. Dėl to VSMC paverčiamas į osteoblastus panašiomis ląstelėmis. (1718) Naujausi klinikiniai tyrimai parodė, kad kalcio kiekis kraujyje. baltymų dalelių (CPP), kurios yra koloidinės kalcio fosfato dalelės, daugėja mažėjant inkstų funkcijai. (19-21) Be to, buvo pranešta apie koreliacijas su CPP ir P lygiais kraujyje.2o2i) Gali būti, kad CpP gali paskatinti kraujagyslių kalcifikacijos progresavimą.{21}})

Tačiau pacientams, sergantiems ankstyvos stadijos KŠL, kurių P koncentracija plazmoje normali, buvo pastebėta kraujagyslių kalcifikacija. (13) Be to.PiT-1 mRNR ekspresuojama visur visuose audiniuose. Taigi kita molekulė pirmiausia gali veikti kraujagyslių kalcifikacijos srityje. Yra pranešimų, kaduždegimasskatina kraujagyslių kalcifikaciją. Uždegiminiai veiksniai, tokie kaip interleukinas (IL)-1B, IL-6 ir naviko nekrozės faktorius-alfa (TNF-a), sukėlė VSMC diferenciaciją į osteoblastų tipo ląsteles (2s26) TNF-a sukelia kraujagyslių kalcifikaciją per cAMP kelią, kuris vaidina svarbų vaidmenį osteoblastų diferenciacijoje.2728) IL-6 reguliuoja įvairius kelius, vedančius į kraujagyslių kalcifikaciją VSMC2-31) Be to. IllB, IL-6 ir TNF-a taip pat yra veiksniai, susiję su padidėjusiu kraujagyslių kalcifikavimu, kurį sukelia aukštas p lygis.3233) Tačiau. dabartiniai duomenys nevisiškai paaiškina kraujagyslių mechanizmą

kalcifikacija, kurią sukelia šie veiksniai. Iškėlėme hipotezę, kad gali būti ir kitų su P susijusių molekulių, tokių kaip SLC superšeimoje esančios molekulės, dalyvaujančios kraujagyslių kalcifikacijoje. Mes sutelkėme dėmesį į membraninius baltymus SLC superšeimoje ir ištyrėme galimas su P susijusias molekules, išskyrus PiT-1, kad jos galėtų dalyvauti kraujagyslių kalcifikacijoje. Be to, vaizdo įraše ir in vivo ištyrėme ryšį tarp kandidatų molekulių ir kraujagyslių kalcifikacijos.

Medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūros. Normalios žmogaus aortos lygiųjų raumenų ląstelės (AoSMC) buvo gautos iš Lonza (Bazelis, Šveicarija) AoSMC buvo kultivuojamas pagal gamintojo instrukcijas. AoSMC buvo palaikomi augimo terpėje (lygiųjų raumenų ląstelių bazinė terpė, papildyta 5% galvijų vaisiaus serumu (FBS), epidermio augimo faktoriumi, insulinu, fibroblastų augimo faktoriumi-B ir gentamicinu / amfotericinu-B). Žiniasklaida buvo keičiama kas antrą dieną. AoSMC buvo auginami drėgname 5% CO inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje ir palaikomi tol, kol buvo pasiektas susiliejimas, o tada naudojami eksperimentuose.

Kalcifikuotas AoSMC. AoSMC kalcifikacija buvo sukelta, kaip aprašyta anksčiau.435) AOSMC buvo kultivuojami Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje, papildytoje 15% FBS ir penicilinu-streptomicinu, ir kultivuojami su 2,6 mM P 3, 6, 9, 12 ir 14 dienų. P koncentracija buvo koreguojama P buferiu NaH, PO/Na ir HPO. pH 7,2). Kiti AoSMC nebuvo auginami naudojant 2, 6 mM P.

DNR mikromasyvas. Naudota bendra AoSMC mėginių, kultivuotų ir neaugintų su 2,6 mM P, RNR. Bendra RNR 5.0 ug buvo ištirta naudojant DNR mikrogardelę (Agilent Technologies, Tokijas, Japonija). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray buvo naudojamas maždaug 26,000 genams ištirti. Santykis buvo apskaičiuotas padalijus AoSMC, kultivuoto su 2,6 mM 12 dienų, ekspresijos lygį iš AoSMC ekspresijos lygio nekultūrinto su 2,6 mM P

DNR mikromasyvas

Naudota bendra AoSMC mėginių, kultivuotų ir neaugintų su 2,6 mM P, RNR. Bendra RNR 5.0 ug buvo ištirta naudojant DNR mikrogardelę (Agilent Technologies, Tokijas, Japonija). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray buvo naudojamas maždaug 26,000 genams ištirti. Santykis buvo apskaičiuotas padalijus ekspresijos lygį ant AoSMC, kultivuoto su 2,6 mM 12 dienų, iš ekspresijos lygio ant AoSMC, nekultūrinto su 2,6 mM P. SLC37A2 ekspresija esant kraujagyslių uždegimui. Norint sukelti uždegiminį atsaką AoSMC, ląstelės buvo kultivuojamos auginimo terpėje, kol susiliejo, o po to apdorotos 1 ugmL lipopolisacharidais (LPS) (LPS iš escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) 24 ir 72 2,6 mM P. Kiti AoSMC nebuvo auginami naudojant realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizę. Bendra RNR buvo išgauta iš AoSMC, apdoroto LPS 24 ir 72 valandas, ir ląstelių, neapdorotų LPS. SYBR žalios spalvos kiekybinė realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant susintetintą cDNR ir atitinkamą pradmenų rinkinį kiekvienam tiksliniam genui su aStepOnePlus realaus laiko PGR sistema (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Pradmenų sekos buvo tokios: žmogaus IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' ir 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; žmogaus SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' ir 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazė (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- ir 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3}.IL-6 ir SLC37A2 mRNR ekspresijos lygiai buvo apskaičiuoti normalizavus SLCcal37AGA2 PD). Iš AoSMC buvo išskirtos visos AoSMC, kurios nebuvo kultivuotos su 2,6 mM P, ir AoSMC ląstelės, kultivuotos su 2,6 mM P 3, 6, 9, 12 ir 14 dienų. Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant susintetintą kDNR. Pradmenų sekos buvo tokios seka: žmogaus Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' ir 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Runx2 ir SLC37A2 mRNR ekspresijos lygiai buvo apskaičiuoti normalizavus APPH.

Western blot analizė.

Visas baltymas buvo paimtas iš AoSMC mėginių, kultivuotų tomis pačiomis sąlygomis, kurios buvo naudojamos realaus laiko PGR analizei. Šie mėginiai buvo lizuojami naudojant Tris buferinį fiziologinį tirpalą (pH 75), papildytą 5% NP-40 ir 1% proteazės inhibitorių kokteiliu. Baltymų koncentracijos mėginiai buvo matuojami naudojant BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). ir koncentracija buvo pakoreguota Western blot metodu, 10 ug baltymų buvo atskirta 10% poliakrilamido gelyje, naudojant natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezę. Membrana buvo apdorota SLC37A2 antikūnu (Novus Biologicals, Centennial, CO) arba GAPDH antikūnu (GeneTex, Irvine, CA), kaip pirminiais antikūnais, inkubuojama su Rabbit lgG krienų peroksidaze konjuguotu antikūnu (R&D Systems, Mineapolis, MN) kaip antrinis antikūnas. ir vizualizuojama naudojant Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anglija) ir liuminescencinio vaizdo analizatorių (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokijas, Japonija). Juosta buvo kiekybiškai įvertinta naudojant lmagel.

Eksperimentinis

Visus tyrimo protokolus patvirtino Hyogo universiteto Humanitarinių mokslų ir aplinkos mokyklos etikos komitetas. Dvylikos savaičių Sprague-Dawley žiurkės buvo nupirktos iš Japan SLC (Shizuoka, Japonija). Žiurkės buvo laikomos 12-šviesaus, 12-h tamsaus ciklo metu (09:00-21:00) ir leido laisvai gauti maisto ir ypač gryno vandens.

Eksperimentinės dietos apima kontrolinę P dietą (1.0% P, 0.6Ca, 20% baltymų), adenino dietą (0,75% adenino). , 1.0% P, 0,6%Ca, 2,5% baltymų), mažai P (LP) turinčios dietos (0,2% P,0 .6 % Ca, 10 % baltymų) ir didelio P (HP) dieta (1,0 % P, 0,6 % Ca, 10 % baltymų), pagrįsta AIN93-G dieta (rytietiška) Mielės, Tokijas, Japonija) su kazeinu kaip baltymų šaltiniu.3637) Buvo pranešta, kad mažai baltymų turinčios dietos skatina kraujagyslių kalcifikaciją žiurkėms, kurioms yra adenino sukeltas inkstų nepakankamumas, todėl buvo atliktas baltymų apribojimas.3738)Prieš suskirstant į grupes visos žiurkės (n)=23) savaitę buvo šeriami standartine MF dieta (rytietinėmis mielėmis), kad aklimatizuotųsi. 13 savaičių amžiaus žiurkės buvo suskirstytos į 2 grupes: kontrolinę grupę (n=5) ir adenino sukeltą ŠKL grupę (n=18). Kontrolinei grupei buvo skirta kontrolinė P dieta 6 savaites. . Adenino sukelta CKD grupė vartojo adenino dietą maždaug 3 savaites, o vėliau buvo suskirstyta į 2 pogrupius: CKD-LP grupę (n=8) arba CKDHP grupę (n=10). CKD-LP grupės ir CKD-HP grupės žiurkės vartojo LP dietą ir HP dietą atitinkamai 3 savaites, eksperimentiniu laikotarpiu maisto suvartojimas buvo registruojamas kasdien. Adenino dietos metu kraujo mėginiai buvo imami iš uodegos venos nuo 10:00 iki 11:00:00 vieną kartą per savaitę iki antros savaitės, o vėliau kartą per 2 dienas, kad būtų galima stebėti koncentraciją plazmoje. LP dietos arba HP dietos metu kraujo mėginiai buvo imami kartą per savaitę. Šlapimo mėginiai buvo paimti ir šlapimo tūris registruojamas kartą per savaitę. Žiurkės buvo nužudytos naudojant anestetiką, naudojant izofluraną (Wako Pure Chemical Industries. Osaka, Japonija) ir laparotomijas. Analizei buvo paimti kraujo mėginiai iš apatinės tuščiosios venos ir krūtinės pilvo aortos.

SLC37A2 išraiška aortoje.

Maždaug trečdalis surinktos krūtinės abdominalinės aortos buvo naudojama kalcifikacijai vizualizuoti ir imuniniam dažymui atlikti. Aorta buvo įterpta į parafiną ir nupjautos 4-um pjūviai. Pjūviai buvo nudažyti naudojant Von Kossa metodą kalcio rinkiniui (Polysciences. Warrington, PA) pagal gamintojo instrukcijas. imuninio dažymo analizė buvo atlikta su serijiniais pjūviais. Sekcijos buvo inkubuojamos su SLC37A2 antikūnu per naktį 4 laipsnių temperatūroje, o po to 30 minučių kambario temperatūroje apdorotos Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokijas, Japonija). Po to sekcijos buvo apdorotos DABsubstrato rinkiniu (Nichirei).

Bendra RNR buvo išgauta iš likusios užšaldytos krūtinės abdominalinės aortos. Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant susintetintą cDNR. Pradmenų sekos buvo tokios: žiurkės osteopontinas, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' ir 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' ir; žiurkės SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' ir 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Osteopontino mRNR ir SLC37A2 mRNR ekspresijos lygiai buvo apskaičiuoti normalizavus GAPDH

Statistinė analizė.

Duomenys pateikiami kaip vidurkis + SE. Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami naudojant t-testą. Fosfatų sukeltų kalcifikuotų AoSMC eksperimentų metu skirtumai buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersijos analizę, o po to Dunnett metodą. CKD modelio eksperimentuose skirtumai buvo analizuojami naudojant K ruskal-Wallis testą, o po to Steel-Dwass metodą. Koreliacijos koeficientai (rs) nustatyti naudojant Spearmano koreliacijos koeficiento rango testą. Visiems bandymams. dvipusės p reikšmės<0.05 were considered statistically significant.