Svertiajaponinas slopina odos pigmentaciją dviem mechanizmais, kad slopintų tirozinazę 2 dalis

Cistancheyra įprasta žolė, žinoma kaip „stebuklingas augalas, prailginantis gyvenimą“. Pagrindinis jo komponentas yra cistanozidas, turintis įvairų poveikį, pavyzdžiui, antioksidacinį, priešuždegiminį ir imuninę funkciją skatinantį poveikį. Mechanizmas tarp cistanche ir odos balinimo yra antioksidacinis cistanche glikozidų poveikis.

Melaninas žmogaus odoje susidaro oksiduojantis tirozinui, katalizuojamam tirozinazės, o oksidacijos reakcijai reikalingas deguonies dalyvavimas, todėl deguonies neturintys radikalai organizme tampa svarbiu veiksniu, turinčiu įtakos melanino gamybai.Cistanchesudėtyje yra cistanozido, kuris yra antioksidantas ir gali sumažinti laisvųjų radikalų susidarymą organizme, taip slopindamas melanino gamybą.

Norėdami pagerinti odos balinimą, spustelėkite Cistanche Tubulosa

Paprašyk daugiau:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Papildomai,cistanchetaip pat atlieka kolageno gamybos skatinimo funkciją, kuri gali padidinti odos elastingumą ir blizgesį bei padėti atkurti pažeistas odos ląsteles.

CistancheFeniletanolis Glikozidai turi reikšmingą tirozinazės aktyvumą mažinantį poveikį, o poveikis tirozinazei yra konkurencinis ir grįžtamasis slopinimas, o tai gali būti mokslinis pagrindas Cistanche balinamųjų ingredientų kūrimui ir panaudojimui.

Todėl,cistancheatlieka pagrindinį vaidmenįodos balinimas. Jis gali slopinti melanino gamybą, kad sumažintų spalvos pasikeitimą ir nuobodumą; ir skatina kolageno gamybą, kad pagerintų odos elastingumą ir spindesį. Dėl plačiai paplitusio cistanche poveikio pripažinimo, daugelis odą balinančių produktų pradėjo naudoti augalinius ingredientus, tokius kaip Cistanche, kad patenkintų vartotojų poreikius, taip padidinant Cistanche komercinę vertę odos balinimo produktuose.

Apibendrinant galima pasakyti, kad cistanche vaidmuo balinant odą yra labai svarbus. Jo antioksidacinis ir kolageną gaminantis poveikis gali sumažinti spalvos pakitimą ir blyškumą, pagerinti odos elastingumą ir blizgesį ir taip pasiektibalinimo efektas. Be to, platus Cistanche panaudojimas odos balinimo gaminiuose rodo, kad negalima nuvertinti jo vaidmens komercinėje vertėje.

Swertiajaponinas slopina UVB sukeltą MAPK aktyvaciją

Oxidative stress has been shown to stimulate melanogenesis by upregulation of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), a transcription factor to induce tyrosinase gene expression [4, 14]. We studied whether the antioxidative effect of swertiajaponin can regulate MITF activity. Western blotting data showed that UVB exposure increased phosphorylated MITF, an active form of MITF, whereas swertiajaponin treatment at 10 μM decreased it (Figure 6A). Consistently, a UVB-mediated increase in tyrosinase protein level was reduced by swertiajaponin treatment (Figure 6A). Because oxidative stress has been shown to activate MITF through mitogen-activated protein kinase (MAPK) [15, 16], it was investigated whether swertiajaponin can control MAPK signaling. UVB exposure dramatically increased the phosphorylation of ERK, JNK, and p38 (Figure 6B), which is associated with the UVB-induced ROS and ONOO- production in B16F10 cells (Figure 5C- 5D). Swertiajaponin treatment only at 10 μM decreased the protein levels of MAPKs (Figure 6B). This result is consistent with the antioxidative activity of swertiajaponin because the decrease in UVB-induced cellular oxidative stress was clear only at 10 μM of swertiajaponin (Figure 5C-5D).

Nors swertiajaponinas yra pagrindinis visos Swertia japonica žolės junginys, kuris buvo naudojamas kaip japonų vaistas, mūsų tyrimas neparodė įtikinamų įrodymų apie swertiajaponino saugumą, kai jis naudojamas ant žmogaus odos. Tačiau mūsų eksperimentinėje aplinkoje swertiajaponinas neparodė citotoksiškumo Hs27 (žmogaus fibroblastų), HaCat (žmogaus keratinocitų) ir B16F10 (pelės melanomos) ląstelių linijose. Be to, nebuvo matomų citotoksiškumo požymių, įskaitant ląstelių nuolaužų susidarymą ar ląstelių atsiskyrimą, remiantis mikroskopiniu stebėjimu, kai swertiajaponinas buvo gydomas žmogaus odos modelyje koncentracijomis, kurios neparodė citotoksiškumo ląstelių linijose. Atsižvelgiant į tai, kad saugos klausimai yra pagrindiniai šiuo metu turimų odos balinimo junginių rūpesčiai, reikia atlikti tolesnius in vivo tyrimus, kad būtų galima ištirti jų saugumą fiziologijoje.

Kartu swertiajaponinas slopino melanino kaupimąsi iki patenkinamos ribos tiek ląstelėse, tiek žmogaus odos modeliuose, naudodamas dvigubus mechanizmus, kad slopintų tirozinazę, tiesiogiai prisijungdamas prie tirozinazės ir konkurenciniu būdu slopindamas tirozinazę bei slopindamas oksidacinio streso sukeltą MAPK / MITF signalizaciją (7 pav.). Atsižvelgiant į žinomų odos balinimo medžiagų, tokių kaip kojinė rūgštis ir arbutinas, neigiamą poveikį ir ilgalaikio veiksmingumo stoką [17], svertiajaponinas gali būti saugesnis odos pigmentacijai slopinti ir būtų naujas balinamosios kosmetikos priedas.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Tirozinazės aktyvumo tyrimas naudojant grybų tirozinazę

Swertiajaponinas ir kojinė rūgštis (50 μM) buvo įdėta į 96-šulinėlių mikroplokštelę (Nunc, Danija) tirozinazės buferyje (200 μL), kuriame yra grybų tirozinazės (1000 V), 1 mM L-tirozino tirpalo ir 50 mM fosfato. buferis (pH 6,5) [5]. Plokštelė buvo inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje 15 min., o dopachinonas buvo įvertintas spektrofotometrija (450 nm). Remiantis matavimu, IC50 buvo apskaičiuotas naudojant logaritmines tiesines kreives ir jų lygtis.

Svertiajaponino ir tirozinazės prijungimo modeliavimas

„AutoDock Vina“ buvo naudojamas in silico baltymų ir ligandų prijungimo modeliavimui. Trimatė tirozinazės struktūra buvo panaudota Agaricus bisporus kristalinėje struktūroje (PDB ID: 2Y9X). Iš anksto nustatyta tirozino surišimo vieta buvo naudojama kaip prijungimo kišenė. Atlikus tirozinazės ir svertiajaponino arba kojinės rūgšties prijungimo modeliavimą, programinė įranga LigandScout 3.0 buvo panaudota norint numatyti skirtingų junginių ir tirozinazės surišimo likučius.

Svertiajaponino tirozinazės slopinimo kinetinė analizė

L-DOPA buvo paruošta esant 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 ir 0,0625 mM ir swertiajaponino koncentracijoms buvo paruoštas esant 20, 40 ir 80 μM. Reakcijos mišinio tirpalas buvo paruoštas 96-šulinėlių plokštelėje, kurioje buvo 20 μL tirozinazės substrato (L-DOPA), 10 μL vandeninio grybų tirozinazės tirpalo (200 U) ir 50 mM kalio fosfato buferio (pH). 6.5) buvo pridėta. Reakcijos mišinio dopachromo gamybos greitis buvo matuojamas esant 450 nm bangos ilgiui naudojant mikroplokštelių skaitytuvą. Tada svertiajaponino tirozinazės slopinimo greitis buvo apskaičiuotas naudojant Lineweaver-Burk diagramos analizę. Michaelio konstanta (Km) ir didžiausias greitis (Vmax) taip pat buvo apskaičiuotos Lineweaver-Burk diagramomis su skirtingomis L-DOPA substrato koncentracijomis [3].

Ląstelių kultūros ir gyvybingumo tyrimas

B16F10 melanomos ląstelės buvo įsigytos iš Korea Cell Line Bank. Ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM) su 5 procentais galvijų vaisiaus serumo (FBS) ir 1 procento penicilino, streptomicino, L-glutamino ir natrio piruvato. Ląstelės buvo palaikomos 37 laipsnių temperatūroje drėgnoje 95 procentų oro/5 procentų CO2 atmosferoje. Ląstelių gyvybingumo tyrimui ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles. B16F10 melanomos ląstelės buvo apdorotos swertiajaponinu įvairiomis koncentracijomis 48 valandas. Ez-Cytox (10 μL) buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojama 2 valandas. Susidarę formazano kristalai buvo matuojami spektrofotometrija esant 450 nm. Ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuotas naudojant ląsteles be gydymo swertiajaponinu kaip kontrolinę grupę.

Melanino kiekis B16F10 ląstelėse

Melanino lygis buvo matuojamas naudojant anksčiau aprašytą metodą su nedideliais pakeitimais [18]. B16F10 ląstelėms buvo leista augti iki 70-80 procentų susiliejimo 6-šulinėlių plokštelėse. Ląstelės buvo iš anksto apdorotos swertiajaponinu arba kojic rūgštimi 2 valandas. Po to MSH arba UVB buvo apdorotas swertiajaponino arba kojinės rūgšties turinčia terpe ir inkubuojamas dar 48 valandas. Po plovimo PBS, ląstelės buvo atskirtos naudojant tripsiną ir ištirpintos 90 μL 1 N NaOH tirpale, kuriame yra DMSO (5 procentai). Po 1 valandos inkubacijos 60 laipsnių temperatūroje melanino kiekis buvo nustatytas matuojant absorbciją esant 405 nm. B16F10 ląstelių UVB poveikiui buvo naudojama komerciškai prieinama UV kamera (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korėja).

Western blotingas

Baltymų mėginiai, išskirti iš B16F10 ląstelių (30 ug), buvo atskirti natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze, naudojant 10-12 procentų akrilamido gelius, ir perkelti į polivinilidenfluorido membranas, kurios iškart buvo patalpintos į blokuojantį buferį ( 5 proc. neriebaus pieno) 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl ir 0,1 proc. Tween 20. Membrana buvo plaunama TBS-Tween buferiu 30 min., o po to inkubuojama su specifiniais pirminiais antikūnais (1:1{). {24}} skiedimas), nurodyta paveikslo legendose 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Nuplovus TBS-Tween buferiu, membrana buvo inkubuojama su krienų peroksidaze konjuguotu anti-pelės antikūnu (Santa Cruz, 1:10, 000), antikūnu prieš triušius (Santa Cruz, 1:10, 000), arba antikūnas prieš ožką (Santa Cruz, 1: 10 000) 25 laipsnių temperatūroje 1 val. Imunoblotai buvo vizualizuoti naudojant Western Bright Peroxide tirpalą (Advansta, CA, JAV) ir ChemiDoc Touch vaizdo gavimo sistemą (Bio-Rad, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Šiame tyrime naudojami šie antikūnai: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tirozinazė (ląstelių signalizacija-104976), pMITF (Abcam{{40). }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (ląstelinis signalas-921L), p38 (ląstelinis signalas-9212S), pERK (ląstelinis signalas-4370L ), ERK (ląstelių signalizacija-9201L), pJNK (ląstelių signalizacija-9251L), JNK (ląstelių signalizacija-9252S) ir -aktinas (Santa Cruz{52}}) .

ROS ir ONOO lygių matavimas

Svertiajaponino antioksidacinis aktyvumas buvo tiriamas naudojant fluorescencinį 2,7-dichlorodihidrofluoresceino diacetatą (DCFDA) ROS ir dihidrorodaminą (DHR) 123 ONOO-. Trumpai tariant, norint nustatyti ROS lygį, į ląstelių homogenatus buvo pridėta DCFDA (25 μM), kad galutinis tūris būtų 250 ul. Norint išmatuoti ONOO lygį, 10 ul ląstelių homogenatų buvo pridėta į rodamino tirpalą (50 mM natrio fosfato buferis, 90 mM natrio chloridas, 5 mM dietilenotriamino pentaacto rūgštis [DTPA] ir DHR123). Abiejų tyrimų metu fluorescencija buvo matuojama kas 5 minutes 30 minučių fluorescencinės plokštelės skaitytuvu, sužadinimo ir emisijos bangos ilgiai buvo nustatyti atitinkamai 485 ir 530 nm.

Melanino kaupimasis žmogaus odos modelyje

Gyvybingas, atkurtas, trimatis žmogaus epidermis (Neoderm-ME, Tego Science) buvo naudojamas swertiajaponino anti-melanogeniniam poveikiui žmogaus odos modelyje ištirti. Žmogaus odos modelis buvo iš anksto apdorotas DMSO (nešikliu) arba svertiajaponinu 1 valandą ir 5 dienas kultivuojamas įmonės pateiktoje palaikomojoje terpėje, gydant DMSO arba swertiajaponinu. Mikroskopinė analizė buvo atlikta nuo 1 iki 5 dienos, siekiant stebėti odos pigmentaciją. Mikroskopiniai vaizdai buvo išanalizuoti Image J programine įranga, siekiant pusiau kiekybiškai įvertinti odos patamsėjimą. Fontana-Masson dažymui odos mėginiai buvo fiksuoti 4 procentų paraformaldehidu per naktį kambario temperatūroje, o mėginius išanalizavo komerciškai prieinama įmonė (Garam Meditech, Pietų Korėja).

Statistinė analizė

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Skirtingos grupės buvo lyginamos naudojant vienpusę dispersijos analizę, po kurios buvo atliktas Dunnett post-testas. P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

INTERESŲ KONFLIKTAI

Jokių interesų konfliktų deklaruoti nėra.

FINANSAVIMAS

Šį darbą parėmė Grantas K17281 iš Korėjos Rytų medicinos instituto, Švietimo, mokslo ir technologijų ministerijos (MEST), Korėjos Respublika.

NUORODOS

1. Bradford PT. Odos vėžys spalvos odoje. Dermatol slaugytojai. 2009 m.; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Cheminiai ir instrumentiniai metodai gydyti hiperpigmentaciją. Pigment Cell Res. 2003 m.; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(benzo[d]tiazol-2-ilamino)-5- (pakeistasis benzilidenas) tiazol-4(5H)-ono dariniai kaip nauji tirozinazės inhibitoriai. Biol Pharm Bull. 2015 m.; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P ir kt. (Z)-5-(2,4-dihidroksibenzilidenas) tiazolidinas- 2,4-dionas apsaugo nuo UVB sukeltos melanogenezės ir raukšlių susidarymo, nes slopina oksidacinį stresą žmogiškųjų išteklių valdymo sistemoje{{7} } beplaukių pelių. Oxid Med Cell Longev. 2016 m.; 2016 m.: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR ir kt. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihidroksifenil)tiazolidino- 4-karboksirūgštis apsaugo nuo UV spindulių sukeltų raukšlių susidarymo, nes slopina NF-kappaB sukeltą uždegimą. J Dermatol Sci. 2015 m.; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonols iš Heterotheca apima: tirozinazę slopinantį aktyvumą ir struktūrinius kriterijus. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Aktyvių vietų likučių, susijusių su metalo kofaktoriaus surišimu ir stereospecifinio substrato atpažinimu žinduolių tirozinazėje, identifikavimas. Poveikis kataliziniam ciklui. Biochemija. 2002 m.; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoidai kaip grybų tirozinazės inhibitoriai: fluorescencijos gesinimo tyrimas. J Agric Food Chem. 2006 m.; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoidų dariniai kaip stiprūs tirozinazės inhibitoriai – naujausių atradimų tarp 2008-2013 tyrimas. Curr Top Med Chem. 2014 m.; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Swertia japonica sudedamųjų dalių tyrimai. II. Naujo flavonoido, svertiajaponino, išskyrimas ir struktūra. Chem Pharm Bull (Tokijas). 1967 m.; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Swertia japonica ekstrakto ir jo pagrindinio junginio swertiamarin poveikis pelių skrandžio ištuštėjimui ir virškinimo trakto judrumui. Fitoterapija. 2011 m.; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. 2-metilnafto[1,2,3-de]chinolino-8-one slopinamasis poveikis melanosomų pernešimui ir odos pigmentacijai. Sci Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Flavonoidų vaidmuo oksidaciniame strese. Curr Top Med Chem. 2001 m.; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Jauni nendrių lapai (Phragmites communis) slopina melanogenezę ir oksidacinį stresą B16F10 melanomos ląstelėse. Biomed Pharmacother. 2017 m.; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalizacijos keliai melanogenezėje. Int J Mol Sci. 2016 m.; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihidromiricetinas iš Ampelopsis grossedentata slopina melanogenezę, sumažindamas MAPK, PKA ir PKC signalizacijos kelius. Chem Biol Interact. 2016 m.; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Ganoderma formosanum grybienos ekstraktas kaip labai stiprus tirozinazės inhibitorius. Sci Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimuliuoja tirozinazės geno ekspresiją ir melanogenezę diferencijuotuose melanocituose. Pigment Cell Res. 2001 m.; 14: 328-36.