Nutaikius laktatdehidrogenazę A su katechinu, SNU620/5FU skrandžio vėžio ląstelės iš naujo jautrinamos 5-fluorouracilui, 1 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Atsparumas priešvėžiniams vaistams pasireiškia beveik visų rūšių vėžiui ir tampa dideliu vėžio gydymo sunkumu. Nors 5-fluorouracilas (5FU) yra pirmosios eilės skrandžio vėžio priešvėžinio gydymo pasirinkimas, jo veiksmingumas yra ribotas dėl atsparumo vaistams. Pastaruoju metu pakitęs vėžio metabolizmas, įskaitant Warburgo efektą, pirmenybę teikiant glikolizei, o ne oksidaciniam fosforilinimui energijos gamybai, buvo priimtas kaip pagrindinis mechanizmas, reguliuojantis atsparumą chemoterapijai. Taigi, mes ištyrėme išsamų antiglikolitinių medžiagų mechanizmą ir galimą naudingumą gerinant atsparumą 5FU, naudojant nustatytas skrandžio vėžio ląstelių linijas, SNU620 ir SNU620/5FU. SNU620/5FU, skrandžio vėžio ląstelė, pasižyminti atsparumu 5FU, parodė daug didesnę laktato gamybą ir ekspresiją. apiesu glikolize susiję fermentai, pavyzdžiui, laktato dehidrogenazė A (LDHA), nei pirminių SNU620 ląstelių. Norėdami apriboti glikolizę, ištyrėme katechiną ir jo darinius, kurie yra žinomipriešuždegiminisir natūralūs priešvėžiniai produktai, nes anksčiau buvo pranešta, kad epigallocatechin galatas yra LDHA ekspresijos slopintuvas. Katechinas, paprasčiausias junginys iš jų, turėjo didžiausią slopinamąjį poveikį laktato gamybai ir LDHA aktyvumui. Be to, 5FU ir katechino derinys parodė papildomą citotoksiškumą ir sukėlė reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) sukeltą apoptozę SNU620 / 5FU ląstelėse. Taigi, remdamiesi šiais rezultatais, siūlome katechiną kaip kandidatą kuriant naują adjuvantinį vaistą, kuris sumažina cheminį atsparumą 5FU, ribodamas LDHA.

Raktiniai žodžiai:5-fluorouracilas;chemiškai atsparus; glikolizė; laktato dehidrogenazė; katechinas

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

1. Įvadas

Didelė pažanga pasiekta gydant skrandžio vėžį taikant chirurginę pirminio naviko rezekciją ir taikant 5-fluorouracilo (5FU) pagrindu pagamintą kombinuotą chemoterapiją, pvz., epirubicino, cisplatinos ir fluorouracilo bei docetakselio, oksaliplatinos ir 5FU[1 ,21 Iki šiol 5FU, uracilo analogas, blokuojantis DNR sintezę slopindamas timidilato sintazę [3], tebėra dažniausiai naudojamas chemoterapinis vaistas skrandžio vėžiui gydyti [1, A4]. Tačiau klinikinis chemoterapijos veiksmingumas buvo nepatenkinamas dėl pirminio ar metastazavusio vėžio atkryčio, susijusio su atsparumu vaistams [1,5].

Cistanche gali pagerinti imunitetą

Kai kurie ląstelių procesai yra laikomi pagrindiniais cheminio atsparumo mechanizmais, įskaitant vaistų aktyvavimą arba inaktyvavimą, DNR pažeidimo taisymo mechanizmus, vaistų taikinių modifikacijas, apoptotinių takų inaktyvavimą ir padidėjusią autofagiją [6, 7]. Vėžys yra nevienalytis, o įvairios vėžio rūšys energijos apykaitai naudoja ir glikolizę, ir oksidacinį fosforilinimą [8]. Tačiau buvo pranešta, kad metabolinis perprogramavimas, ypač nenormali aerobinė glikolizė, yra pagrindinis veiksnys kuriant skrandžio vėžį atsparumą chemoterapiniams vaistams, įskaitant 5FU [9]. Laktato dehidrogenazė A (LDHA) ir piruvatdehidrogenazės kinazės (PDK) yra žinomos kaip pagrindiniai aerobinės glikolizės reguliatoriai, gaminantys laktatą iš piruvato[10,11]. Dichloracetato, žinomo PDK inhibitoriaus, derinys atkuria jautrumą 5FU [12]. Be to, buvo pranešta, kad LDHA, pagrindinis fermentas, katalizuojantis piruvato virsmą laktatu, yra galimas skrandžio vėžio gydymo tikslas [13,14]. LDHA ekspresijos slopinimas vėžio ląstelėse slopina navikogeniškumą padidindamas mitochondrijų kvėpavimą ir sumažindamas ląstelių gyvybingumą [15]. Keletas LDHA inhibitorių, tokių kaip FX11, PSTMB ir GSK 2837808A, mažina ATP lygį ir sukelia oksidacinį stresą ir galiausiai sukelia apoptotinę ląstelių mirtį [16-18]. Nors tyrimas parodė, kad mikroRNR{15}}a slopinus LDHA, buvo atkurtas atsparumas 5FU sergant gaubtinės žarnos vėžiu [19], nė vienas ankstesnis tyrimas nepranešė apie genetinių ar farmakologinių LDHA inhibitorių poveikį cheminiam atsparumui.

Žaliosios arbatos polifenoliai, įskaitant katechiną (CA), epikatechiną (EC), gallokatechiną (GC), epigalokatechiną (EGC), epikatechin-3-galatą (EKG) ir epigalokatechin-3-galatą (EGCG), skatina žmogaus veiklą. sveikatai, užkertant kelią ir gydant kelias ligas, įskaitant uždegimą, diabetą, širdies ir kraujagyslių ligas bei piktybinį vėžį [20,21]. Tarp polifenolių EGCG padidina 5FU cheminį jautrumą gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ir kepenų ląstelių karcinomos ląstelėse, aktyvindamas AMPK kelius ir apribodamas vėžio kamieną [22, 23]. Be to, buvo pranešta, kad EGCG slopina LDHA, slopindamas jo ekspresiją krūties ir kasos vėžio ląstelėse [24, 25].

Šiame tyrime iškėlėme hipotezę, kad CA gali būti kandidatas į adjuvantinį vaistą, mažinantį skrandžio vėžio ląstelių atsparumą 5FU. Ištirta, kad CA ir (arba) jo derinio su 5FU slopinantis poveikis LDHA aktyvumui sukėlė mitochondrijų reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) ir apoptotinę ląstelių mirtį 5FU atspariose ląstelėse.

2. Rezultatai

2.1. 5FU atsparių ląstelių glikolitinės charakteristikos

Padidėjęs proliferacija yra cheminio atsparumo, įskaitant 5FU atsparias vėžio ląsteles, savybė [26, 27]. Pirma, patvirtinome SNU620 ir SNU620 / 5FU ląstelių atsparumą 5FU ir ilgalaikį augimo greitį. Kai šios ląstelės buvo kultivuojamos su nurodytomis 5FU koncentracijomis 48 valandas, apskaičiuota dozė, sukelianti 50 procentų augimo slopinimą (Gl50) SNU620/5FU ląstelėse (100,63 uM), buvo daug didesnė nei ta, kuri sukelia GIso jos pirminėse SNU620 ląstelėse (28,88 μM). ） (1A paveikslas ir papildomas S1 paveikslas). Be to, SNU620 / 5FU ląstelių augimo greitis buvo greitesnis nei SNU620 ląstelių (1B paveikslas ir papildomas S2 paveikslas). Kadangi atsparumas cheminiam poveikiui ir greitai augančios savybės gali būti susijusios su padidėjusiomis skrandžio vėžio ląstelių glikolitinėmis savybėmis [28], abiejose ląstelėse buvo matuojamas ekstraląstelinis rūgštėjimo greitis (ECAR) ir deguonies suvartojimo greitis (OCR), esant oksamatui, gerai žinomai. glikolizės inhibitorius, ar ne. Rezultatai parodė, kad SNU620 / 5FU ląstelės žymiai išskyrė daugiau laktato, nei išskiria SNU620 ląstelės, ir vėliau parūgštino auginimo terpę (1C paveikslas ir papildomas S3 paveikslas). Tačiau reikšmingų OCR pokyčių tarp šių ląstelių nepastebėta (1D pav.). Buvo išmatuotas LDHA mRNR ir baltymų ekspresijos lygis. LDHA ekspresija buvo didesnė SNU620 / 5FU ląstelėse nei SNU620 ląstelėse (1E, F pav.). Be to, ištyrėme PDK izotipų mRNR ir baltymų ekspresijos lygius ir nustatėme, kad PDK2 ir PDK3 ekspresijos lygiai buvo didesni SNU620 / 5FU ląstelėse nei SNU620 ląstelėse (papildomas paveikslas S4A, B). Taip pat buvo įvertintas piruvatdehidrogenazės (PDHA1) E1 subvieneto fosforilinimas, kurį padidino PDK, ir nustatyta, kad jis SNU620/5FU ląstelėse yra didesnis nei SNU620 ląstelėse (papildomas S4C paveikslas). Be to, mes naudojome oksamatas kaip LDHA inhibitorius, siekiant įveikti 5FU atsparumą SNU620/5FU ląstelėse. Šis junginys slopino ląstelių augimą tiek SNU620, tiek SNU620 / 5FU ląstelėse (papildomas S5 paveikslas). Be to, bendras gydymas oksamatu ir 5FU slopino ląstelių augimą, palyginti su individualiu gydymu oksamatu arba 5FUin SNU620/5FU ląstelėmis (1G pav.). Šie duomenys rodo, kad SNU620/5FU ląstelės labai ekspresuoja LDHA, o LDHA aktyvumo slopinimas gali įveikti SNU/5FU ląstelių atsparumą 5FU.

1 pav. Remiantis rezultatais, 5-fluorouracilui (5FU) atsparios ląstelės turi padidintą glikolitinę charakteristiką: (A)SNU620 ir SNU620/5FU ląstelės buvo apdorotos nurodytomis koncentracijomis 5FU 48 valandas. Šių ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant MTT tyrimą; (B) SNU620 ir SNU620/5FU ląstelių augimo lygiai buvo matuojami kiekvieną dieną 4 dienas naudojant MTT tyrimą; (C,D)SNU620 ir SNU620/5FU ląstelės buvo apdorotos oksamatu ( 5 mM) arba ne 24 valandas, o ECAR ir OCR reikšmės buvo įvertintos Seahorse XF analizatoriumi; (E, F) LDHA ekspresija SNU620 ir SNU620/5FU ląstelėse buvo aptikta naudojant qRT-PGR ir Western blot analizę; (G) SNU620 ir SNU620/5FU ląstelės buvo apdorotos oksamatu (25 mM) ir (arba) 5FU (10 μM) 48 valandas. Rezultatai rodomi kaip vidurkis ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA slopina LDHA aktyvumą

Laktato gamyba buvo analizuojama naudojant CA ir jo darinius, įskaitant EC, GC, EGC ir EGCG, SNU620/5FU ląstelėse. Palyginti su šiais dariniais, CA veiksmingiau sumažino laktato gamybą (2A pav.). Be to, in vitro buvo patvirtintas LDHA aktyvumas, kaip sakoma, ir CA parodė stipresnį slopinamąjį poveikį LDHA aktyvumui nei jo dariniai (2B pav.). CA slopinantis poveikis LDHA ir LDHB aktyvumui in vitro buvo matuojamas priklausomai nuo dozės. CA slopino LDHA aktyvumą, nepaveikdamas LDHB aktyvumo (2C, D pav.). Be to, LDHA ir LDHB aktyvumas buvo matuojamas naudojant EGCG, kuris, kaip žinoma, slopina LDHA aktyvumą, ir nustatyta, kad jis sumažėjo priklausomai nuo dozės (papildomas paveikslas S6A, B). Be to, intracelulinis LDHA ir LDHB aktyvumas buvo įvertintas nurodytomis CA koncentracijomis SNU620 / 5FU ląstelėse. CA slopino LDHA aktyvumą priklausomai nuo dozės in vitro rezultatus, bet ne LDHB aktyvumą (2E, F pav.). P-PDHA1, PDK2, PDK3 ir LDHA baltymų ekspresijos lygiai taip pat buvo išmatuoti SNU620/5FU ląstelėse po gydymo CA (papildomas S7 paveikslas), ir mes pastebėjome, kad šis gydymas jiems neturėjo įtakos. Šie rezultatai rodo, kad CA reguliuoja LDHA aktyvumą nedarant įtakos jo ekspresijai.

2.3. CA slopinimo LDHA veikimo būdas

Norėdami išanalizuoti LDHA aktyvumo slopinimo mechanizmą CA ir jo dariniams, atlikome žmogaus rekombinantinės LDHA ir CA surišimo sąveikos molekulinį modeliavimą (3A, B pav.). Rezultatai parodė, kad CA gali sąveikauti su LDHA T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 ir T247 likučiais. Tarp jų R105, S136 ir R168 yra labai svarbūs substrato (piruvato) surišimui. Taigi manėme, kad CA gali trukdyti substrato surišimo vietoms. Priešingai, EGCG yra prijungtas prie LDHA per kitą vietą. Siekiant toliau patikrinti LDHA slopinimo CA veikimo būdą, Michaelis-Menten ir Lineweaver-Burk diagramos buvo patvirtintos įvairiomis piruvato ir CA koncentracijomis. LDHA aktyvumas padidėjo priklausomai nuo piruvato dozės. Tačiau tai buvo pakeista padidinus CA. Taigi Michaelis-Menten ir Lineweaver-Burk diagramų rezultatai parodė, kad CA yra nekonkurencinis LDHA inhibitorius (3C pav., D). Be to, izoterminio titravimo kalorimetrijos (ITC) duomenys parodė, kad CA fiziškai jungiasi su LDHA Kd. vertė 197 uM (papildomas S8 paveikslas). Šie rezultatai suteikia įžvalgų, kad CA slopina LDHA aktyvumą, surišdama LDHA substrato surišimo vietą.

2.4. CA iš naujo jautrina 5FU atsparumą sumažindama LDHA aktyvumą

Įvertinome citotoksinį CA poveikį SNU620 ir SNU620/5FU ląstelėms ir nustatėme, kad CA slopino augimą abiejose ląstelių grupėse (4A pav.). Norint patikrinti, ar augimo slopinimas buvo susijęs su LDHA aktyvumo slopinimu, LDHA ekspresija buvo panaikinta trumpu plaukų segtuku ribonukleino rūgštimi (shRNR), skirta LDHA (shLDHA), o jos ekspresija buvo atkurta transfekuojant LDHA ekspresuojančią plazmidę (papildomas paveikslas S9A, B ).ShLDHA transfekuotose SNU620/5FU ląstelėse laktato gamyba ir ląstelių gyvybingumas ženkliai nepasikeitė gydant CA, lyginant su netikromis transfekuotomis ląstelėmis (4B pav., C). Be to, CA augimą slopinantis poveikis buvo padidino LDHA ekspresijos atsigavimą LDHA numuštose SNU620/5FU ląstelėse (4D pav.). Be to, SNU620 ir SNU620 / 5FU ląstelės buvo tiriamos po gydymo CA ir 5FU atskirai arba abiejų deriniu. Bendras gydymas CA ir 5FU reikšmingai slopino SNU620 / 5FU ląstelių augimą (4E pav.). Be to, buvo ištirtas CA ir 5FU derinys keliose kitose ląstelių linijose, tokiose kaip žmogaus skrandžio vėžys AGS, kasos vėžys Panic-1, MIA PaCa-2 ir gaubtinės žarnos vėžio LS174T ir RKO ląstelės, palyginti su SNU620 ir SNU620/5FU ląstelės. Laktato gamyba ir LDHA ekspresija parodė gerą koreliaciją viena su kita, o šios glikolitinės savybės yra gana didelės SNU620 / 5FU, AGS ir RKO (papildomas paveikslas S10A, B). Be to, kombinuotas CA ir 5FU gydymas žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą, palyginti su vienu 5FU apdorojimu glikolitinėse ląstelėse, įskaitant AGS ir RKO (papildomas paveikslas S10C). Tačiau bendras gydymas CA ir 5FU reikšmingai neslopino SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 ir LS174T ląstelių, kurių LDHA ekspresija buvo žema, augimo. Šie rezultatai rodo, kad CA jautrinantis poveikis 5FU atsparioms ląstelėms gali būti susijęs su jo slopinančiu poveikiu LDHA aktyvumui.

2 pav. Katechinas (CA) slopina LDHA aktyvumą, bet ne jo ekspresiją:(A)SNU620/5FU laktato gamyba buvo išmatuota po gydymo CA dariniais (10 μM) 24 valandas; (B) Gydymo metu buvo įvertintas LDHA aktyvumas in vitro su CA dariniais (10 uM) ir oksamatu (20 mM);(C, D)in vitro, LDHA ir LDHB aktyvumas buvo įvertintas nurodytomis CA koncentracijomis; (E, F) ląstelės buvo apdorotos nurodytomis CA koncentracijomis 24 valandas. Intraląstelinis LDHA ir LDHB aktyvumas buvo matuojamas naudojant ląstelių lizatus kaip fermento šaltinį. Rezultatai rodomi kaip vidurkis ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

4 pav. Ląstelių gyvybingumas buvo slopinamas kartu apdorojant katechinu (CA) ir 5-fluoruracilu (5FU) 5FU atspariose ląstelėse: (A) SNU620 ir SNU620/5FU ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas po apdorojimo nurodytomis koncentracijomis CA 48 valandas; (B) SNU620/5FU-pLKO.1 ir SNU620/5FU-shLDHA ląstelės buvo apdorotos CA (10 μM) 24 valandas. Laktato gamyba buvo matuojama SNU620/5FU-pLKO.1 ir SNU620/5FU-shLDHA ląstelių auginimo terpėje; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plius EV ir SNU620/5FU-shLDHA ir LDHA#2 ląstelės buvo apdorotos nurodytomis CA koncentracijomis 48 valandas. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant MTT tyrimą; (E) SNU620 ir SNU620/5FU ląstelės buvo apdorotos CA (10 μM) ir (arba) 5FU (10 μM) 48 valandas. Šių ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant MTT tyrimą. Rezultatai rodomi kaip vidurkis±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Šis straipsnis yra ištrauktas iš Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms